抑制（最高剂量）的范围内。因此，此新颖凝血酶原酶生物检定预测活体内抗血栓 形成活性。
[0320] 下表3提供狒狒模型中对活体内血栓形成的剂量反应性抑制。表3还提供输注对 照或测试化合物期间狒狒血浆样本中的抗fXa活性。
[0321] 表 3
[0322]
[0323] 图2提供活体外检定可预测活体内抗血栓形成活性的其它证据。具体来说，图2 展示狒狒模型中对活体外血栓形成的剂量反应性抑制。在输注贝曲昔班期间，经 mIn标记 的血小板随时间在静脉腔室中沉积（各剂量的n = 3)。向对照动物输注媒剂（n = 4)。
[0324] 图3、4A和4B展示贝曲昔班相较于磺达肝素在人类全血中对由组织因子启始的凝 血酶产生的抑制。通过荧光团底物的裂解来定量凝血酶活性。通过向来自11名健康捐赠 者的全血中添加不同量的贝曲昔班和磺达肝素来测量对凝血酶产生的抑制的剂量反应。展 示代表性捐赠者的相对荧光单位（RFU)测量。
[0325] 本研究显示贝曲昔班作为经纯化人类fXa和凝血酶原酶复合物的有效抑制剂的 活体外和活体内特征。具体来说，对相关人类蛋白酶（诸如，凝血酶和活化蛋白质C)具有 大于86, 000倍的特异性。对人类全血中组织因子启始的凝血酶产生也存在剂量依赖性抑 制且在动静脉血栓形成灵长类动物模型中对正在进行的血栓形成也存在剂量依赖性抑制， 而凝结参数或出血时间不延长。因此，相较于凝血的标准测量，本检定对动物模型中的活体 内功效更具预测性。
[0326] 实例 6
[0327] 对凝血酶原酶与不溶性因子Xa的抑制预测fXa抑制剂在深静脉血栓形成（DVT) 的活体内模型中的功效
[0328] 本实例经设计以测试如下假设：针对并入到凝血酶原酶复合物中的fXa的fXa抑 制剂的效力将预测活体内抗血栓形成功效。测试8种fXa抑制剂抑制人类血浆中凝血酶原 酶复合物的能力，所述8种fXa抑制剂来自具有一系列针对fXa的活性的4种结构独特的 化学药品系列。凝血酶产生和特异性凝血酶底物的随后裂解用作凝血酶原酶活性的测量， 抑制活性由产生实现最大凝血酶产生的时间的2倍延长（2 X lag)所需的抑制剂浓度定义。 还测定活体外家兔PT时间。通过向家兔血浆中添加促凝血酶原激酶来测定活体外家兔凝 血酶原时间（PT)。根据先前所述评估家兔DVT模型的抑制（霍仑巴齐（Hollenbach)等人， 血检止血（Thromb. Haemost. ) 1994 ;71:357)且与药物的血衆浓度关联。
[0329] 材料与方法
[0330] 合成化合物（朱（Zhu)等人；医药化学当前论题（Curr. Top. Med. Chem. ) 2001 ; 2:101-119 ;贝特斯（Betz)等人生物化学（Biochem. )，1999 ;36:14582-91)。自肽底物 Z-D-Arg-Gly-Arg pNA(Diapharma)形成对硝基苯胺后在 405nm 下在 Spectramax 板读取 器（分子装置（Molecular Devices))中测量将经纯化可溶性人类fXa(血液技术公司 (Haematologic Technologies))的酰胺水解活性抑制50%所需的化合物浓度（IC50)(辛 哈（Sinha)等人，欧洲医药（Eur.J.Pharmacol.)2000 ;395:51_59)。在以立止血处理的缺 乏血小板的汇集人类血衆中在肽凝血酶底物Pefachrome TG(潘得法（Pentapharm))裂解 后在405nm下测量对硝基苯胺评估凝血酶原酶引起的凝血酶形成（辛哈（Sinha)等人， ATVB ;2003 ;23:1098-1104)。引起实现最大凝血酶产生的时间增加两倍的化合物浓度记 录为2Xlag浓度。通过测量借助于插入左大腿静脉中的导管而置于腔静脉中的棉线上的 血栓增长来测定针对家兔静脉血栓形成的抗血栓形成功效。表示出化合物输注2小时后 相对于媒剂对照物的血栓重量减少（霍仑巴齐（Hollenbach)等人，血栓止血汀!!：!^!!^. Haemost.) 1994 ;71:357)〇
[0331] 通过LC-MS/MS测量家兔血浆中的药物浓度。使用促凝血酶原激酶C+ (Dade) 在自动凝血计时器上测量家兔凝血酶原时间（ACL 3000,仪器实验室（Instrumentation Laboratory))(辛哈（Sinha)等人，欧洲医药（Eur. J. Pharmacol. )，2000 ;395:51-59)。
[0332] 结果
[0333] 所有化合物在IOnM以下的浓度下将可溶性fXa抑制50 %。然而，抑制可溶性fXa 的效力的排位次序不同于抑制凝血酶原酶复合物所需的排位次序。结果展示于表4中。
[0334] 表 4
[0335]
[0336] 凝血酶原酶抑制的2 X lag值与实现家兔PT的2倍变化所需要的浓度（R2= 0. 57) 之间也存在不良相关性。fXa抑制活性或家兔PT的变化都不能预测活体内深静脉血栓形成 (DVT)模型中的活性。相反，可根据化合物在活体外凝血酶原酶检定中的效力，将化合物活 体内抑制血栓生长的功效大致分成3个水平。化合物1具有0. 18 y M的最低2X lag值，且 为最有效活体内血栓形成抑制剂，在65nM的血浆浓度下为94%抑制。第二组化合物在凝 血酶原酶检定中的2 X lag值在0. 22至0. 34 y M的范围内，其在1. 04至3. 39 y M范围的血 浆浓度下将活体内血栓形成抑制37至47%。第三类化合物为最不有效的凝血酶原酶抑制 剂（2X lag值大于0. 92 yM)且甚至在9. 2 y M的血浆浓度下也不能显著抑制活体内血栓形 成。所述数据显示凝血酶原酶检定中获得的2X lag值而非对可溶性fXa的抑制或家兔PT 时间的延长对活体内家兔DVT模型中的fXa抑制功效最具预测性。
[0337] 由于当前抗凝血剂的限制，因此因子Xa(fXa)位于血液凝固的外在和内在路径的 会合点使其成为新疗法研发中有吸引力的目标。关于潜在fXa抑制剂的结构-活性关系 (SAR)的研究而言，测量对溶液相fXa蛋白酶活性的抑制的检定为明显起点。然而，化合物 抑制可溶性经纯化fXa的能力并非抑制剂与酶的活体内相互作用的真实反映。这是因为 fXa在与因子Va组合作为凝血酶原酶复合物的部分时出现对凝血过程的最大贡献，此时蛋 白酶活性相对于溶液相fXa增加300, 000倍。凝血酶原酶复合物中fXa的活性增加极难 抑制，因此对化合物抗fXa效力的任何评估应包括对凝血酶原酶抑制的评价。可在缺乏血 小板的血浆（PPP)中测量凝血酶原酶活性，且在所述条件下，也考虑血浆蛋白质结合对化 合物效力的作用。评估化合物对抗凝血过程的作用的另一更直接方式是使用活体外凝结检 定，诸如凝血酶原时间（PT)和活化部分促凝血酶原激酶时间（aPTT)。
[0338] 实例 7
[0339] 生物检定在多个渐增剂量研究中的评价
[0340] 图5展示来自以经口给予贝曲昔班的健康人类捐赠者的血浆进行的活体外检定 的数据。9名个体各自连续10天每12小时接受40、80或120mg药物胶囊。对照个体（12) 以安慰剂或非抗凝剂药物对照物治疗。在组织因子启始的凝血酶产生的活体外生物学检定 中评价自所述个体获得的血浆样本。也使用高效液相色谱法与串联质谱法分析血浆样本的 药物浓度。结果显示生物学检定中贝曲昔班血浆药物浓度与凝血酶产生的抑制之间的剂量 反应性相互关系。
[0341] 实例 8
[0342] 贝曲昔班的人类治疗浓度
[0343] 如实例4中所述进行凝血酶产生检定，其中将化合物离体添加至人类全血 中。由缺乏血小板的血浆中所添加的化合物测定各种物种中的PT值和aPTT值。在ACL 3000plus(柯尔特（Coulter))上分析样本，使用Dade?促凝血酶原激酶C+测定PT且使用 Bade? Aetin? FS 活化 PIT 试剂测定 aPIT。
[0344] 贝曲昔班和磺达肝素（间接fXa抑制剂）均显著抑制人类全血中的TAT和FL 2 产生。相较于磺达肝素的治疗水平（200nM)而言，贝曲昔班（200nM)更有效抑制凝血酶产 生的两种标记物。
[0345] 材料与方法
[0346] 在三个动物模型中评价多个剂量的贝曲昔班。第一模型测量置于家兔腹部腔静脉 中的棉线上的凝块增长，其将贝曲昔班对血栓块的抑制作用与依诺肝素（LMff肝素）的超治 疗剂量的作用相比较。
[0347] 第二模型比较贝曲昔班在动脉流动条件下在FeCljI起的大鼠颈动脉血栓形成中 保持血管畅通的能力与依诺肝素或氯吡格雷（clopidogrel)(抗血小板剂）实现相同作用 的能力。
[0348] 第三模型研究对狒狒体内置于大腿动静脉分路中的涤纶补片和膨胀室上经111In 标记的血小板沉积的抑制作用。在所测试的所有模型中，贝曲昔班和依诺肝素以静脉内输 注形式投与且氯吡格雷经口给药历时3天。在所有模型中测量离体PT和aPTT。所述模型 在三个模型中的每一个中具有动脉和静脉血栓形成以及贝曲昔班产生的剂量反应性抗血 栓形成活性的严格标准。有利地比较贝曲昔班功效与依诺肝素和氯吡格雷的超治疗水平。
[0349] 通过测量借助于插入左大腿静脉中的导管置于腔静脉中的棉线上的血栓增 长来测定对家兔静脉血栓形成的功效，如以引用的方式全部并入本文中的霍仑巴齐 (Hollenbach)等人，血检止血（Thromb. Haemost.) 1994;71:357-362 所述。相对于媒剂对 照物表述输注化合物2小时后血栓重量的降低。还参看辛哈（Sinha)等人，欧洲医药（Eur. J. Pharmacology) 395:51-59 (2000)，其以引用的方式全部并入本文中。
[0350] 大鼠 FeCl；^；^型是从库尔兹（Kurz)，K. D.等人血栓研究（Thromb. Res.) 1990 ; 60 (4) : 269-280修改而来，其利用左颈动脉，所述参考案以引用的方式全部并入本文中。以 结扎丝线实施动脉狭窄，从而将轻微碰伤的血流减少50%，随后在实验持续时间施用50% FeCl 3。通过脉冲多普勒血流探针监测血流且在FeCl3施用后记录90分钟。静脉内投与 依诺肝素和贝曲昔班。每日四次经口投与氯吡格雷。在俄勒闪健康与科学大学（Oregon Health & Science University)根据汉森（Hanson), S. R?等人临床研究期刊（J. Clin. Invest.) 1993 ;92:2003-2012所述的程序执行狒狒模型，所述参考案以引用的方式全部并 入本文中。简单来说，通过并入体外大腿动脉-静脉（A-V)分路中的两个不同血栓形成装 置诱发血栓形成。动脉模型利用高剪应力环境促进涤纶补片上的血栓形成。静脉模型利用 低剪应力环境促进膨胀室中的血栓形成。分别将血小板和纤维蛋白以 111In和125I血纤维蛋 白原预先标记来测量血小板沉积和纤维蛋白累积。
[0351] 结果
[0352] 令人惊奇地，与啮齿动物模型不同，灵长类动物中的功效在低得多的剂量下获得， 其中PT的延长最小。通过大鼠、家兔、狒狒和人类血浆中的PT和aPTT的活体外延长也证 明物种特异性。分别在8. 9、1. 6、1和0. 4 y M浓度下获得PT的2 X变化。数据表明抑制人 类血液中凝血酶产生的贝曲昔班剂量和提供与以每千克0. 05-0. 49mg剂量给药的狒狒类 似的抗凝血作用的贝曲昔班剂量可足以预防人类中的静脉血栓形成。对抗血栓形成功效水 平的PT变化程度的比较模拟也使我们预测：可获得贝曲昔班的人类治疗活性而无需同时 改变离体凝结参数。数据呈现于表5中。
[0353] 表 5
[0354]
[0355] 实例 9
[0356] 贝曲昔班与依诺肝素在全膝关节置换术后预防静脉血栓栓塞事件的随机试验中 的比较
[0357] 本研究包括215名经历全膝关节置换术（TKR)的患者，将所述患者以2:2:1比 率随机分组以接受每日两次经口给予15mg或40mg贝曲昔班剂量或每日两次皮下给予 30mg依诺肝素（Enox)剂量，历时10至14天。研究隐瞒15与40mg给药，但不隐瞒贝曲 昔班与Enox。主要功效终点为在第10天到第14天发生静脉血栓栓塞（"VTE"）（在强 制单向静脉造影上的有症状或无症状深静脉血栓形成或有症状肺栓塞）。安全性终点包 括静脉造影术后整天发生严重和临床显著不严重出血。由不知情独立中央裁决委员会 (blinded, independent central adjudication committee)裁定所有功效和出血终点。
[0358] 材料与方法
[0359] 贝曲昔班在所述研究中以明胶胶囊形式投与。所述胶囊含有贝曲昔班顺丁烯二酸 盐、右旋糖单水合物和硬脂酸镁。
[0360] 手术后6至8小时进行贝曲昔班的初次给药且其后每日两次（BID)给药。手术后 12至24小时后皮下投与依诺肝素且其后每12小时投与一次（q 12h)。除非满足方案规定 的停止标准，否则继续治疗10至14天。出院后，患者自投与研究药品。在手术腿的预定强 制静脉造影术早晨（第10天至第14天）投与研究药品的最后剂量。
[0361] 在筛选时、在第2天投与研究药品的早晨剂量1至4小时后、出院日以及第10天 至第14天强制静脉造影之前获取用于评估血浆药物浓度和药效测量的血液样本。也使 用高效液相色谱法与串联质谱法分析血浆样本的贝曲昔班。基于对〇. 2mL血浆的分析对 0. 100-50.0 ng/mL范围验证所述方法。使用加权最小平方回归分析产生的校正标准曲线进 行定量。
[0362] 除活化部分促凝血酶原激酶时间（aPTT)、凝血酶原时间（PT)和国际标准化比率 (INR)之外，还通过实例4中所述的凝血酶产生抑制检定和抗X a活性测量抗凝血作用。抗 Xa单位检定是从Coatest LMff肝素试剂盒（Diapharma)修改而来且将其改为96孔培养盘 格式。在这一检定中，一式两份检定标准样本和患者样本且定量极限为0.05抗Xa U/mL。 通过向经柠檬酸盐抗凝血处理的患者血浆（0.1 mL)中添加组织因子（依诺维，德灵）和钙 来启始凝血酶的产生。通过特异性凝血酶底物（Z-GGR-AMC，巴亨公司）经10分钟时段的裂 解测量凝血酶的形成。在FlexStation荧光读取器（分子装置）中测量相对荧光单位且将 其用于定量凝血酶产生。所有患者血浆样本以一式三份检定且对凝血酶产生的抑制以自各 个体的基线相对荧光单位的变化形式报导。
[0363] 结果
[0364] 观测到贝曲昔班对凝血酶产生的抑制和抗fXa水平的剂量以及浓度依赖性作用。 175名患者（81. 4% )的功效以及安全性评估如表6所示。
[0365]表6
[0367]图6展示本研究中在第8天与第10天之间以单向静脉造影测定的贝曲昔班和依 诺肝素的VTE比率和95%置信区间，以及依诺肝素住院对照的VTE比率和95%置信区间， 所述依诺肝素住院对照数据来自使用TKR后第10天与第14天之间进行的双向静脉造影术 的研究。图9描绘第二次给药后（第2天）、出院以及静脉造影术时的血浆贝曲昔班浓度。 如根据贝曲昔班的长半衰期所预期，对两个贝曲昔班剂量组而言，平均药物浓度在前几次 给药后增加且似乎在出院时达到稳定状态（中位数为第4天）。贝曲昔班展现对抑制凝血 酶产生和抗Xa水平的剂量依赖性以及浓度依赖性作用（图7和图8)。15mg贝曲昔班对凝 血酶产生抑制的作用与依诺肝素观测到的作用类似，而40mg贝曲昔班所见的作用更显著。 相反，对抗Xa活性所见的作用类似于40mg贝曲昔班和依诺肝素的作用且小于15mg贝曲昔 班的作用。以贝曲昔班治疗未显著影响其它凝血作用参数（即，aPTT、PT和INR)。
[0368] 贝曲昔班有效预防TKR后的VTE且是安全且良好耐受的。
[0369] 应了解，尽管本发明已结合上述实施例进行描述，但前述说明和实例意图说明且 不限制本发明的范畴。本发明范畴内的其它方面、优势和修改对本发明所属领域的技术人 员将显而易见D
【主权项】
1. 一种化合物II:或其医药学上可接受的盐在制备药物中的用途，所述药物适用于口服从而抑制有需要 的人类患者的凝血，其中所述药物包含介于30mg和SOmg之间的日剂量的化合物II。2. 根据权利要求1所述的用途，其中所述化合物II的日剂量为30mg。3. 根据权利要求1所述的用途，其中所述化合物II的日剂量为80mg。4. 根据权利要求1所述的用途，其中所述口服产生人类患者中1 或更低的化合物II 血清含量。5. 根据权利要求1-4中任一权利要求所述的用途，其中化合物II的医药学上可接受的 盐是顺下締二酸盐。
【专利摘要】本申请涉及使用经口因子XA抑制剂治疗血栓形成的单位剂量调配物和方法。在灵长类动物中抑制凝血所需的本文所揭示的因子Xa抑制剂化合物的单位剂量比在其它动物模型(诸如，啮齿动物)中获得类似凝血抑制程度所需的单位剂量低。本文还教示适用于预测人类活体内抗血栓形成活性的活体外检定。
【IPC分类】A61P7/02, A61K31/44
【公开号】CN105193799
【申请号】CN201510530619
【发明人】乌马·辛哈, 斯坦利·J·霍伦巴克, 基思·阿贝
【申请人】米伦纽姆医药公司
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2007年11月15日
【公告号】CA2671502A1, CA2913963A1, EP2101760A2, EP2101760B1, US8404724, US20080153876, WO2008073670A2, WO2008073670A3