胞悬液，细胞以2. 5X 104/孔的密度接种在24孔培养板内。换成无双抗，含10%胎 牛血清的DMEM培养基，采用RNAiMAX转染50nm是siRNA。乱序RNA作为对照组。干扰24 小时后换成DMEM完全培养液并感染Ml病毒，72小时后MTT检测细胞生存率。
[0169] 结果：
[0170] 如图7a所示，HCT116细胞转入乱序siRNA后，与对照组以及单独处理db-cAMP或 者Ml组对比，db-cAMP/Ml联用可以显著的抑制细胞的生存率，也就是说db-cAMP显著地增 强了 Ml病毒的溶瘤效应。当采用三个不同的siRNA片段分别干扰PKA后，HCT116细胞中， 和对照组细胞、Ml单独处理组与db-cAMP单独处理组比较，db-cAMP/Ml联合处理依然可以 抑制肿瘤细胞的生长。如图7c所示，PKA干扰片段具有较好的干扰效率，但是干扰PKA却 不能阻断增加的病毒蛋白。
[0171] 2)干扰Epac 1取消cAMP激活增强的溶瘤效应
[0172] 材料：
[0173] 人结直肠细胞癌HCT116, Ml病毒，高糖DMEM培养基，MTT，siRNA，RNAiMAX，倒置 相差显微镜。
[0174] 方法：
[0175] a)细胞的培养：人结直肠细胞癌HCT116,生长在含10% FBS、100U/ml青霉素及 0. lmg/ml链霉素的DMEM完全培养基中；细胞置于5% C02, 37°C恒温密闭式孵箱（相对湿度 95%)内培养传代，倒置显微镜观察生长情况。大约2~3天传代一次，取处于对数生长期 的细胞用于正式实验。
[0176] b)RNA干扰：选择对数生长期细胞，DMEM完全培养液（含10%胎牛血清、1 %双抗） 制成细胞悬液，细胞以2. 5X 104/孔的密度接种在24孔培养板内。换成无双抗，含10%胎 牛血清的DMEM培养基，采用RNAiMAX转染50nm是siRNA。乱序RNA作为对照组。干扰24 小时后换成DMEM完全培养液并感染Ml病毒，72小时后MTT检测细胞生存率。
[0177] 结果：
[0178] 如图7b所示，HCT116细胞转入乱序siRNA后，与对照组以及单独处理db-cAMP或 者Ml组对比，db-cAMP/Ml联用可以显著的抑制细胞的生存率，也就是说db-cAMP显著地增 强了 Ml病毒的溶瘤效应。当采用三个不同的siRNA片段分别干扰Epacl后，HCT116细胞 中，db-cAMP/Ml联合处理组不能显著抑制细胞的生存率。如图7c所示，Epacl干扰片段具 有较好的干扰效率，并且干扰Epacl能够阻断增加的病毒蛋白。
[0179] 实施例4 Epac激动剂/Ml病毒联合处理有效抑制肿瘤生长
[0180] 1) Epac激动剂选择性在肿瘤组织增加 Ml病毒复制
[0181] 材料：
[0182] 4周龄雌性BALB/c裸鼠、人结直肠癌细胞系HCT116、RNA提取试剂Trizol，组织匀 浆机、实时荧光定量PCR仪
[0183] 方法：
[0184] 向4周龄的裸鼠背侧皮下注入5X 106HCT116细胞。6天后，每只小鼠尾静脉注入 Ml 病毒（3X107PFU)或 8-CPT-cAMP(20mg/kg)与 Ml 病毒（3X107PFU)，连续给药两天。给 药后第三天天处死裸鼠，收集组织样品（包括肿瘤、心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉），并抽提组 织RNA。然后，用QRT-PCR的方法检测Ml病毒的量。
[0185] 结果：
[0186] 如图8所示，在裸鼠皮下HCT116肿瘤模型中，单独Ml病毒处理后Ml病毒在肿瘤 组织内存在较少的Ml病毒RNA。与单独Ml病毒处理组比较，8-CPT-cAMP (20mg/kg)联合Ml 病毒（3X107PFU)处理组的肿瘤内Ml病毒RNA的数量超过1000倍以上，并且在其他正常 组织中Ml病毒RNA没有大幅度的增加。说明8-CPT-cAMP可以选择性地增加 Ml病毒在肿 瘤组织中复制，Ml病毒富集于肿瘤组织。
[0187] 2)在荷瘤鼠体内Epac激动剂/Ml病毒联合处理有效抑制肿瘤生长
[0188] 材料：
[0189] Ml病毒、人肝癌细胞株Η印3B、人结直肠癌细胞株HCT116、人胰腺癌细胞株 Capan-1、4周龄雌性BALB/c裸鼠
[0190] 方法：
[0191] a)荷瘤鼠模型建立：将5X106H印3B，HCT116或者Capan-Ι细胞注入到4周龄 BALB/c裸鼠背侧皮下。
[0192] b)静脉给药：当Hep3B细胞肿瘤体积达到约50mm3时，静脉注射Ml病毒 (3 X 107PFU/次）/Epac激动剂。0ptiPR0?SFM培养基注射为溶剂对照组。每三天测量肿瘤 的长宽，肿瘤的体积依据公式：长X宽72。
[0193] 结果：
[0194] 在BALB/c裸鼠上建立了皮下荷瘤Η印3B、HCT116、Capan-l (图9a，b，c)裸鼠模型 后，连续多次静脉注射给予溶剂对照、Ml病毒、8-CPT-cAMP、8-CPT-cAMP联合Ml病毒处理， 观察裸鼠肿瘤体积变化状况。统计表明，与对照组或单独药物处理组对比，8-CPT-cAMP联 合Ml病毒处理组显著抑制Η印3B/HCT116/Capan-1荷瘤鼠肿瘤生长，且精神状态良好。表 明8-CPT-cAMP联合Ml病毒处理比单用Ml病毒、单用8-CPT-cAMP cAMP组更加有效抑制地 肿瘤生长，并且联合运用安全性良好。
[0195] 实施例5 Ml病毒制备方法
[0196] 材料：
[0197] 非洲绿猴肾细胞Vero,中国仓鼠卵巢细胞CH0,人胚肾细胞HEK293,高糖DMEM培 养基，0ptiPR0?SFM培养基（1 X)，Ml病毒，100mm细胞培养皿，离心机
[0198] 方法：
[0199] 选择对数生长期细胞，DMEM完全培养基（含10%胎牛血清、1 %双抗）制成细胞悬 液，细胞接种在100mm细胞培养皿内。待细胞的融合度达到80%~90%时，Vero细胞换成 0ptiPR0?SFM培养基。再加入50 μ 1 (Μ0Ι = 0· 01)M1病毒感染，或处理以500 μΜ db-cAMP， 当细胞出现大面积病变（约36小时），收集细胞上清。2000~3000RPM离心5min，小心吸 出上清，混匀分装，于-80 °C冰箱保存。
[0200] 结果：
[0201] 如图10所示，在Vero，CH0，HEK293细胞中，Ml病毒单独感染会引起较多的病毒复 制，当处理以Epac激动剂db-cAMP后，显著地增加了病毒复制。从而提示Epac激动剂具有 增加溶瘤病毒Ml生产的作用。
【主权项】
1. 一种用于治疗肿瘤的药物组合物，包含： (a) Epac直接或间接激动剂，以及 (b) 溶瘤病毒。2. 根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述溶瘤病毒选自Ml病毒、盖塔病毒、辛德 毕斯病毒、仙台病毒、柯萨奇病毒、单纯性疱疹病毒、细小病毒、腺病毒、腺相关病毒、脊髓灰 质炎病毒、新城疫病毒、水泡性口炎病毒、麻疹病毒、呼肠病毒、逆转录病毒、牛痘病毒、流感 病毒以及它们的工程改造株。3. 根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述Epac直接或间接激动剂选自cAMP类 似物、腺苷酸环化酶激动剂、磷酸二酯酶抑制剂中的一种或多种的组合。4. 根据权利要求3所述的药物组合物，其中所述cAMP类似物选自双丁酰环磷酸腺苷 (db-cAMP)、8- (4-硫代氯苯基）-3 '，5 ' -环磷酸腺苷（8-CPT-cAMP )、3 '，5 ' -环硫代磷酸 腺苷（Rp-cAMPS )、2' -氧代-(2-氨乙甲酰基）-3 '，5 ' -环硫代磷酸腺苷（Rp-2' -AEC-cAMPS / Rp-2' -EDA-cAMPS)、8- (6-己二胺基）-3'，5' -环硫代磷酸腺苷（Rp-8-AHA-cAMPS)、琼 脂糖凝胶固定的8- (6-己二胺基）-3'，5'-环硫代磷酸腺苷（Rp-8-AHA-cAMPS-Agarose)、 8-(2-乙二胺基）_3'，5'-环硫代憐酸腺昔（1^)-8-4￡4-〇4]\0 33)、8-(2-乙二胺基）-2'-氧 代-甲基-3 '，5 ' -环磷酸腺苷（8-AET-2' -O-Me-cAMP )、8- (6-己二胺基）-2' -氧代-甲 基-3'，5' -环磷酸腺苷（8-AHA-2' -0-Me-cAMP)、8-苄硫基-2' -氧代-甲基-3'，5' -环 硫代磷酸腺苷（Sp-8-BnT-2' -O-Me-cAMPS / 〃S-223〃）、8-苄硫基-3'，5' -环硫代磷 酸腺苷（Sp-8-BnT-cAMPS / 〃S-220〃）、I-N-氧基-3'，5' -环磷酸腺苷（1-NO-cAMP)、 3 '，5 ' -环磷酸腺苷（cAMP )、N-6- (2-氨乙基）-3 '，5 ' -环硫代磷酸腺苷（Sp-6-AE-cAMPS )、 8-(2-[0￥-547]-氛乙硫基）-3'，5'-环憐酸腺昔、8-(6-己二胺基）-2-氣_3'，5'-环憐 酸腺苷（8-AHA-2-Cl-cAMP)和 8- (6-己二胺基）-3'，5' -环磷酸腺苷（8-AHA-cAMP)中的 一种或多种的组合。5. 根据权利要求3所述的药物组合物，其中所述腺苷酸环化酶激动剂为佛司可林。6. 根据权利要求3所述的药物组合物，其中所述磷酸二酯酶抑制剂选自3-异丁 基-1-甲基黄噪呤（IBMX)、西洛司特（CiIomilast)、罗氟司特（Roflumilast)、毛地黄 黄酮（Luteolin)、二轻丙茶碱（Dyphylline)、略利普兰（Rolipram)、枸橡酸西地那非 (SildenafiI Citrate)、他达拉非（Tadalafi 1 )、伐地那非三水合盐酸盐（VardenafiI HCl Trihydrate)、匹莫苯丹（Pimobendan)、GSK256066、PF-2545920、阿普斯特（Apremilast (CC-10004))、西洛他唑（CiIostazol )、甲氰吡酮（Milrinone)、阿伐那非（Avanafi 1)、氨茶 喊（Aminophylline)、双啼达莫（Dipyridamole)、多索茶喊（Doxofylline)和 Deltarasin 中 的一种或多种。7. 根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述肿瘤为实体瘤或血液瘤。8. 根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述肿瘤选自肝癌、结直肠癌、膀胱癌、乳 腺癌、宫颈癌、前列腺癌、胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽癌、肺癌、胃癌、卵巢癌和白血病。9. 根据权利要求1或2或3所述的药物组合物，其中所述肿瘤为对所述溶瘤病毒不敏 感的肿瘤。10. 根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物还包含药学上可接受的 载体，并且所述药物组合物的剂型选自冻干粉针、注射剂、片剂、胶囊、滴剂或贴剂。11. 一种用于治疗肿瘤的药品套装，包含： (a) 独立包装的Epac直接或间接激动剂，以及 (b) 独立包装的溶瘤病毒。12. 根据权利要求11所述的药品套装，其中所述溶瘤病毒选自Ml病毒、盖塔病毒、辛德 毕斯病毒、仙台病毒、柯萨奇病毒、单纯性疱疹病毒、细小病毒、腺病毒、腺相关病毒、脊髓灰 质炎病毒、新城疫病毒、水泡性口炎病毒、麻疹病毒、呼肠病毒、逆转录病毒、牛痘病毒、流感 病毒以及它们的工程改造株。13. 根据权利要求11所述的药品套装，其中所述Epac直接或间接激动剂选自cAMP类 似物、腺苷酸环化酶激动剂、磷酸二酯酶抑制剂中的一种或多种的组合。14. 根据权利要求13所述的药品套装，其中所述cAMP类似物选自双丁酰环磷酸腺苷 (db-cAMP)、8- (4-硫代氯苯基）-3 '，5 ' -环磷酸腺苷（8-CPT-cAMP )、3 '，5 ' -环硫