C02加湿培养箱中培养。细胞生长液为DMEM培养基，加10% 小牛血清、100U/mL的青霉素和链霉素。细胞维持液除新生小牛血清为2%外，其余同细胞 生长液。
[0031] 延胡索甲素的细胞毒性检测：MDCK(狗肾）细胞按7000个细胞/孔接种于96孔 细胞培养板中，体积为100 μ L，细胞贴壁后，分别加入浓度为4. 23 μ M、8. 46 μ M、16. 92 μ M、 33. 84 μ Μ、67. 67 μ Μ、135. 34 μ Μ、270. 68 μ Μ、541. 36 μ Μ 的延胡索甲素溶液（采用细胞维持 液配制，DMEM+2 %小牛血清），每个浓度重复2个孔，置于37°C，5 % C02培养箱中培养48小 时后，弃培养液上清，每孔加入含5mg/mL的MTT溶液100 μ L，继续培养2h后，弃MTT上清， PBS洗3次，每孔加溶解液DMS0 150 μ L，振荡lOmin，待结晶完全溶解，用酶标仪检测550nm 处的0D值，计算细胞存活率。用统计学软件SPSS 20. 0的Probit回归法，计算药物TC5。。
[0032] 结果如图1所示，延胡索甲素在67. 67 μ Μ以下的浓度范围内对MDCK细胞完全没 有细胞毒性。基于此结果，本发明实施案例中延胡索甲素细胞水平抗病毒实验（流感病毒） 的给药剂量范围为〇. 53~67. 67 μ Μ，完全处在安全无毒性浓度范围。
[0033] 实施例2 :延胡索甲素抗甲型流感病毒Η3Ν2和Η1Ν1活性评价实验
[0034] MDCK细胞购自美国模式菌种保藏中心（ATCC);病毒株：流感病毒Α/汉防 /359/95 (Η3Ν2)和流感病毒A/PR/8/34(HlNl)，在鸡胚尿囊腔内培养传代，-80 °C保存； 药物：延胡索甲素购于中国药品生物制品检定所。仪器为酶标仪，molecular devices spectraMax M2e ;天平，Mettler Toledo AL104〇
[0035] 实验方法：
[0036] 将MDCK细胞按2 X 104细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，体积为100 μ L，置37°C 细胞培养箱中培养24h后，细胞长成单层，将孔板中培养基弃去，PBS液洗两遍，每孔加入 100 μ L的100T(HD5。流感病毒液感染细胞，吸附2小时，弃病毒液，加入200 μ L含有不同稀 释浓度药物（以67. 67 μ Μ为起始浓度，连续2倍梯度稀释8个梯度浓度，每个浓度设2个 复孔）的细胞维持液，同时设细胞对照孔和病毒对照孔，置于37°C，5% 0)2培养箱中培养， 观察各组CPE，在病毒对照组细胞病变达4+时，且细胞对照无病变时，确定为MTT比色的最 适时间点（约38小时），进行MTT比色分析，用酶标仪在550nm处读取0D值。
[0037] 依下式计算各检测孔中药物对病毒的抑制率：抑制率（％) = (试验组0D值-病 毒对照组0D值）八细胞对照组00值-病毒对照组00值）。用统计学软件3?33 20.0的 Probit回归法，计算药物抗病毒的IC5。。
[0038] 结果如图2和图3所示，延胡索甲素明显抑制了流感病毒A/汉防/359/95 (H3N2) 和流感病毒A/PR/8/34 (H1N1)的复制，且成剂量依赖型，其IC5。分别为10. 42 μ Μ和 18. 18 μΜ〇
[0039] 实施例3 :延胡索甲素对Hep-2细胞的细胞毒性实验
[0040] !fep-2细胞（人咽喉癌上皮细胞）购自美国模式菌种保藏中心（ATCC);
[0041] Hep-2细胞培养：37°C，5% C02加湿培养箱中培养。细胞生长液为DMEM培养基，加 10%小牛血清、100U/mL的青霉素和链霉素。
[0042] 延胡索甲素对Hep-2细胞的毒性检测：Hep-2细胞按5000个细胞/孔接种于96 孔细胞培养板中，体积为100 μ L，细胞贴壁后，分别加浓度为4. 23 μ M、8. 46 μ M、16. 92 μ M、 33. 84 μ Μ、67. 67 μ Μ、135. 34 μ Μ、270. 68 μ Μ、541. 36 μ Μ 的延胡索甲素溶液（采用细胞维持 液配制，DMEM+2 %小牛血清），每个浓度重复2个孔，置于37°C，5 % C02培养箱中培养48小 时后，弃培养液上清，每孔加入含5mg/mL的MTT溶液100 μ L，继续培养2h后，弃MTT上清， PBS洗3次，每孔加溶解液DMSO 150 μ L，振荡lOmin，待结晶完全溶解，酶标仪测550nm处的 0D值，计算细胞存活率。用统计学软件SPSS20. 0的Probit回归法，计算药物对Η印-2细胞 的 TC50。
[0043] 结果如图4所示，延胡索甲素在135. 34 μ Μ以下的浓度范围内对Η印-2完全没有 细胞毒性。
[0044] 实施例4 :延胡索甲素抗甲型呼吸道合胞病毒、腺病毒、柯萨奇病毒活性评价实验
[0045] 病毒株：呼吸道合胞病毒（RSV，Long株）、柯萨奇病毒Β 3型（CVB3, Nancy株）和 腺病毒7型（Ad7)。
[0046] Hep-2细胞按1. 5X 104细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，体积为100 μ L，置 37 °C细胞培养箱中培养24h后，细胞长成单层，将孔板中培养基弃去，PBS液洗两遍，每孔加 入100 μ L的100TCID5。流感病毒液（RSV、CVB3、Ad7)感染细胞，吸附2小时，弃病毒液，加入 200 μ L含有不同稀释浓度样品（以67. 67 μ Μ为起始浓度，连续2倍梯度稀释8个梯度浓 度，每个浓度设2个复孔）的细胞维持液，同时设细胞对照孔和病毒对照孔，置于37°C，5% C02培养箱中培养，观察各组CPE，在病毒对照组细胞病变达4+时，且细胞对照无病变时，确 定为MTT比色的最适时间点（约38小时），进行MTT比色分析，用酶标仪在550nm处读取 0D值。
[0047] 依下式计算各检测孔中药物对病毒的抑制率：抑制率（％) = (试验组0D值-病 毒对照组0D值）八细胞对照组00值-病毒对照组00值）。用统计学软件3?33 20.0的 Probit回归法，计算药物抑制各病毒的IC5。。
[0048] 结果如图5-7所示，延胡索甲素明显抑制了呼吸道合胞病毒（RSV，Long株）、柯萨 奇病毒B3型（CVB3, Nancy株）和腺病毒7型（Ad7)的复制，且成剂量依赖型，其IC5。分别 为 16. 68 μΜ、21· 52 μΜ 和 17. 48 μΜ。
[0049] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 延胡索甲素在制备抑制呼吸道病毒药物和/或制备预防和治疗呼吸道疾病药物中 的应用。2. 根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述呼吸道病毒为甲型流感病毒、乙型流感 病毒、丙型流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、鼻病毒和/或柯萨奇病毒。3. 根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述呼吸道疾病为由甲型流感病毒、乙型流 感病毒、丙型流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、鼻病毒和/或柯萨奇病毒引 起的上/下呼吸道急/慢性炎症。4. 根据权利要求2或3所述应用，其特征在于，所述甲型流感病毒为甲型流感病毒 H3N2和/或甲型流感病毒H1N1。5. 根据权利要求2或3所述应用，其特征在于，所述柯萨奇病毒为柯萨奇病毒B3型。6. 根据权利要求2或3所述应用，其特征在于，所述腺病毒为腺病毒7型。7. 根据权利要求1或3所述应用，其特征在于，所述呼吸道疾病包括流感、肺炎、哮喘、 咳嗽、支气管炎、结膜炎、鼻炎、鼻窦炎和扁桃体炎。8. 根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述药物为片剂、胶囊、颗粒剂、滴丸剂、液 体制剂、煎膏剂、分散剂、栓剂、凝胶剂、气雾剂或贴剂。
【专利摘要】本发明涉及医药技术领域，公开了延胡索甲素在制备抑制呼吸道病毒药物和/或制备预防和治疗呼吸道疾病药物中的应用，从而为临床上病毒性呼吸道疾病的治疗提供一种安全高效毒副作用小的天然小分子化合物。延胡索甲素在无毒性范围内能够有效地抑制呼吸道病毒的复制，可进一步开发为治疗或预防病毒性呼吸道疾病的药物，具有广泛的应用前景。
【IPC分类】A61P31/14, A61P11/02, A61P11/14, A61P31/16, A61P31/20, A61P11/00, A61P11/06, A61K31/4375
【公开号】CN105287539
【申请号】CN201510771967
【发明人】萧伟, 黄文哲, 孙莉琼, 李玉环, 王振中, 李艳静, 周习
【申请人】江苏康缘药业股份有限公司
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年11月12日