温25°C交联5小时，37°C烘箱交联1小时，60°C烘箱交联1小时；c)将步骤(3)交联后的支架置于灭菌单蒸水中洗去氯化钠，得到丝素蛋白-羟基磷灰石多孔支架。
[0045](3) I型胶原溶液的制备:从二月龄健康白猪猪腿处剥取肌腱，去除筋膜和脂肪，剪碎120g，浸泡于500mL体积浓度75%的乙醇水溶液中，4°C过夜；B)将步骤A的肌腱碎片95g用蒸馏水冲洗5遍，加入0.5mol/L的乙酸水溶液1800mL中，用6M氢氧化钠水溶液调节pH至1，加入胃蛋白酶(Sigma-ALDRICH)9g，4°C放置3天，获得胶原溶胶液1800mL ;C)将步骤B获得的胶原溶胶液于4°C、4000rpm水平离心25分钟，弃上层脂肪层，将沉淀a用
0.5mol/L乙酸水溶液稀释3倍体积，在超净台中用4层纱布过滤，将滤液与0.9mol/L的氯化钠水溶液以体积比1:10混合，间歇震荡，4°C过夜，再在4°C、4000rpm水平离心25分钟，弃上清液及悬浮物，获得沉淀b ;D)将沉淀b按下述方式之一处理，制备水溶性I型胶原:a)将沉淀b用0.5mol/L的乙酸水溶液在4°C溶解过夜，所述乙酸水溶液与沉淀b的体积比为4:1，获得所述水溶性I型胶原；b)将沉淀b置于直径0.25 μ m的再生纤维素透析袋中，以三蒸水作为透析液，每天换水4?6次，透析3天，将透析袋中透析后的沉淀置于培养皿中_80°C过夜，再于冻干机中抽干2?3天，获得所述水溶性I型胶原62g。
[0046](4)丝素蛋白胶原双层支架的制备:将(3)方法提取的水溶性I型胶原溶于去离子水中配制成浓度为10mg/mL胶原水溶液20mL，加入80mL浓度为1M的碳酸氢钠溶液进行中和。取出50mL中和后的I型胶原溶液，平铺在步骤(2)获得的丝素蛋白支架上，置于真空干燥箱-80°C真空冷冻干燥7天，得到丝素蛋白胶原双层支架，如图5所示。
[0047](5) 一种含生物活性因子的组织工程软骨支架的制备:将(4)方法制备的丝素蛋白胶原双层支架裁剪成直径4mm、深度3.5mm的圆柱形。将10个上述支架置于直径10cm的细胞培养皿中，加入5mL由PBS(pH = 7.4)配制的浓度为100 μ g/mL的甲状旁腺激素相关肽(Bachem)溶液，置于细胞培养箱中于37°C浸泡lh，得到复合甲状旁腺激素相关肽的丝素蛋白胶原双层支架，即一种含生物活性因子的组织工程软骨支架，丝素蛋白胶原双层支架具有多孔海绵结构，可以大量吸收甲状旁腺激素相关肽溶液，植入软骨缺损处后，原位缓释甲状旁腺激素相关肽溶液，进行软骨缺损治疗，如图1所示。
[0048]实施例2:
[0049](1)骨软骨损伤造模:取体重2.5?3kg成年雄性新西兰大白兔，术前10%水合氯醛(剂量4mL/kg)耳缘静脉注射和腹腔注射各半总量的方式给药麻醉。膝关节周围5cm范围剪毛，将兔仰卧在手术手术台上，四肢固定，碘伏消毒，铺无菌洞巾。取膝关节内侧切口，切开皮肤、皮下筋膜，经髌骨内侧缘切开兔膝关节，向外侧牵开髌腱和股四头肌肌腱，显露膝关节，在膝关节股骨滑车处，用骨科钻制造一个直径4mm、深度3.5mm的圆柱形骨软骨缺损，如图2所示。
[0050](2)应用组织工程软骨支架:将实施例1中的一种含生物活性因子的组织工程软骨支架植入(1)中所造骨软骨损伤处，支架表面略低于缺损边缘。将脱位的髌骨从支架上方小心归位，避免接触支架使其移动。严密缝合膝关节囊和肌肉筋膜组织，缝合皮肤切口。切口碘伏消毒，肌肉注射青霉素钠40万单位后，放回兔笼。术后抗生素护理，肌注青霉素40万单位，每天一次，连续3天。标准动物饲料喂养，如图3所示。
[0051](3)修复效果评估:术后16周，使用耳缘静脉空气针将兔处死。取材包括股骨下端在内的关节面。大体观察发现组织工程软骨支架组软骨损伤处有大量白色透明新生软骨形成，与周围组织连接平滑，而空白对照组修复不佳，仍可见明显的缺损。组织学切片结果显示组织工程软骨支架组生成填充完全的、S0着色深、与周边组织连接紧密的透明软骨样组织，且软骨下骨也得到了良好的重建。而空白对照组新生组织S0着色很淡，软骨面凹陷不规则，基本为纤维组织，如图4所示。
[0052]实施例3
[0053]一种含生物活性因子的组织工程软骨支架的制备方法，包括以下步骤:
[0054](1)将浓度为5mg/mL的I型胶原溶液以体积比1:2比例平铺在丝素蛋白支架上，真空冷冻干燥，冷冻干燥的条件为-40?。C条件下真空冷冻干燥10天，得到丝素蛋白胶原双层支架；
[0055](2)将得到的丝素蛋白胶原双层支架浸泡于20 μ g/mL甲状旁腺激素相关肽溶液中孵育，孵育的温度30°C，且孵育的时间为2小时，于30°C孵育2小时。
[0056]所述丝素蛋白胶原双层支架制备方法如下:
[0057](1.1)以桑蚕蚕丝为原料，经脱胶、溶解、透析，获得丝素蛋白溶液；
[0058](1.2)将无水羟基磷灰石与无水氯化钠颗粒1:1混合，以1?10比例加入步骤(1.1)得到的5%的丝素蛋白溶液，无水羟基磷灰石直径为20nm，无水羟基磷灰石与无水氯化钠颗粒的混合比例为1:1，无水羟基磷灰石与无水氯化钠颗粒混合物与丝素蛋白溶液比例为1:10 ；
[0059](1.3)支架交联:0?4°C交联30?40小时，20?30°C交联3?8小时，30?40°C交联0.5?1小时，60?70°C交联1?2小时；
[0060](1.4)将步骤(L 3)交联后的丝素蛋白支架置于灭菌单蒸水中洗去氯化钠。
[0061]实施例4
[0062]一种含生物活性因子的组织工程软骨支架的制备方法，包括以下步骤:
[0063](1)将I型浓度为30mg/mL胶原溶液以体积比1:2比例平铺在丝素蛋白支架上，真空冷冻干燥，得到丝素蛋白胶原双层支架，冷冻干燥的条件为110°C条件下真空冷冻干燥5天;
[0064](2)将得到的丝素蛋白胶原双层支架浸泡于200 μ g/mL甲状旁腺激素相关肽溶液中，于40°C孵育0.5小时。
[0065]所述丝素蛋白胶原双层支架制备方法如下:
[0066](1.1)以桑蚕蚕丝为原料，经脱胶、溶解、透析，获得丝素蛋白溶液；
[0067](1.2)将无水羟基磷灰石与无水氯化钠颗粒5:1混合，以1:1比例加入步骤(1.1)得到的30%的丝素蛋白溶液，无水羟基磷灰石直径为40nm，无水羟基磷灰石与无水氯化钠颗粒的混合比例为5:1，无水羟基磷灰石与无水氯化钠颗粒混合物与丝素蛋白溶液比例为1:1 ;
[0068](1.3)支架交联:0?4°C交联30?40小时，20?30°C交联3?8小时，30?40°C交联0.5?1小时，60?70°C交联1?2小时；
[0069](1.4)将步骤(1.3)交联后的丝素蛋白支架置于灭菌单蒸水中洗去氯化钠。
【主权项】
1.一种含生物活性因子的组织工程软骨支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)将I型胶原溶液以体积比1: 2比例平铺在丝素蛋白支架上，真空冷冻干燥，得到丝素蛋白胶原双层支架； (2)将得到的丝素蛋白胶原双层支架浸泡于20?200μ g/mL甲状旁腺激素相关肽溶液中，于30?40°C孵育0.5?2小时。2.根据权利要求1所述的含生物活性因子的组织工程软骨支架的制备方法，其特征在于，步骤(1)中I型胶原溶液的浓度为5?30mg/mL。3.根据权利要求2所述的含生物活性因子的组织工程软骨支架的制备方法，其特征在于，步骤(2)中丝素蛋白胶原双层支架在甲状旁腺激素相关肽溶液中孵育的温度30?40°C，且孵育的时间为0.5?2小时。4.根据权利要求1所述的一种含生物活性因子的组织工程软骨支架的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中支架冷冻干燥的条件为-40?_110°C条件下真空冷冻干燥5?10天。5.根据权利要求1至4中任意一项所述的含生物活性因子的组织工程软骨支架的制备方法，其特征在于，所述丝素蛋白胶原双层支架制备方法如下: (1.1)以桑蚕蚕丝为原料，经脱胶、溶解、透析，获得丝素蛋白溶液； (1.2)将无水羟基磷灰石与无水氯化钠颗粒1?5: 1混合，以1: 1?10比例加入步骤(1.1)得到的5?30%的丝素蛋白溶液； (1.3)支架交联:0?4°C交联30?40小时，20?30°C交联3?8小时，30?40°C交联0.5?1小时，60?70°C交联1?2小时； (1.4)将步骤(1.3)交联后的丝素蛋白支架置于灭菌单蒸水中洗去氯化钠。6.根据权利要求5所述的含生物活性因子的组织工程软骨支架的制备方法，其特征在于，所述步骤(1.2)中无水羟基磷灰石直径为20?40nm。7.根据权利要求5所述的一种含生物活性因子的组织工程软骨支架的制备方法，其特征在于，所述步骤(1.2)中无水羟基磷灰石与无水氯化钠颗粒的混合比例为1?5: 1。8.根据权利要求5所述的一种含生物活性因子的组织工程软骨支架的制备方法，其特征在于，所述步骤(1.2)中无水羟基磷灰石与无水氯化钠颗粒混合物与丝素蛋白溶液比例为1: 1?10。9.一种含生物活性因子的组织工程软骨支架，其特征在于，通过如1至8任意一项所述的复合甲状旁腺激素相关肽的丝素蛋白胶原双层支架的制备方法制备得到。10.一种如权利要求9所述的含生物活性因子的组织工程软骨支架在制备骨软骨损伤修复物中的应用。
【专利摘要】本发明是提供一种含生物活性因子的组织工程软骨支架及其制备方法和应用，制备方法，包括以下步骤：(1)将I型胶原溶液以体积比1∶2比例平铺在丝素蛋白支架上，真空冷冻干燥，得到丝素蛋白胶原双层支架；(2)将得到的丝素蛋白胶原双层支架浸泡于20～200μg/mL甲状旁腺激素相关肽溶液中，于30～40℃孵育0.5～2小时。本发明所述的一种含生物活性因子的组织工程软骨支架，丝素蛋白胶原双层支架可以有效的缓释甲状旁腺激素相关肽，能够抑制骨软骨损伤修复过程中的软骨钙化现象，从而提高软骨修复质量。
【IPC分类】A61L27/48, A61L27/54
【公开号】CN105363073
【申请号】CN201510808397
【发明人】张薇, 陈隆坤, 徐国伟, 宣铁锋
【申请人】浙江星月生物科技股份有限公司
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2015年11月20日