°C冰箱保存待测。Rgi组和联合组小鼠血浆样品取70μL放入离屯、管中并加10μL内标地高辛（10μg/mL)，然后 加入-20°C甲醇500μL沉淀蛋白，满旋30s，4000巧m离屯、lOmin，取上清液放入另一离屯、 管中，再向装有蛋白的离屯、管中加入500μL甲醇超声满旋再萃取一遍，然后4000rpm离屯、 lOmin，合并上清液。上清液40°C下氮气吹干后，500μΙ水复溶，将上清液过〇化isI?HLB 固相萃取小柱，小柱首先采用3. 5mL甲醇活化，3. 5mL去离子水平衡，然后上样，再加1.OmL 去离子水洗脱杂质，最后用l.OmL纯甲醇洗脱目标物。洗脱液40°C下氮气吹干后，70μΙ 50 %甲醇水溶液复溶待测。
[0060]2. 3对照品溶液的制备
[0061] 用小鼠空白血浆配制浓度分别为100,60,48, 36, 24,6ng/mL标准工作液按步骤2 中血浆前处理方法处理后待测。
[006引 2. 4血浆样品中人参皂巧Rg洽量测定标准曲线的建立
[006引液相色谱条件：AC卵IYTUPLC'驳邸ΗC18色谱柱（2.lmmX50mm，1. 7μL?，美国Waters公司）；流动相A为乙腊（含Immol/L氨水），流动相Β为去离子水（含Immol/L氨 水）；血浆样品干扰杂质成分比较复杂，所W采用时间更长的梯度洗脱样品。洗脱梯度：0~ 3min，17 ~19%A;3 ~4min，19 ~21%A;4 ~5min，21 ~24%A;5 ~llmin，24 ~26% A;11 ~14min，26 ~75%A;14 ~17min，75%A;17 ~18min，75 ~95%A;18 ~21min， 95%A;21 ~22min，95 ~17%A;22 ~24min，17%A。流速 0. 5血/min,进样体积 5yL，柱 溫 35Γ。
[0064]质谱条件：ESI离子源，负离子模式检测；毛细管电压2.8kv，源溫150。脱溶剂气 流速为1000L/化，溫度为450°C;锥孔气流速50L/化，碰撞气流速0. 16mL/min;多反应监测 (MRM)采集模式。人参皂巧R&定量离子对为799. 5957〉637. 4817(锥孔电压为52v，碰撞 能量为22v)，人参皂巧R&定性离子对为799. 5957M75. 4191 (锥孔电压为52v，碰撞能量为 34v);内标地高辛的定量离子对为779. 6530〉649. 5557 (锥孔电压为66v，碰撞能量为32v)， 定性离子对为779. 6530M75. 4506 (锥孔电压为66v，碰撞能量为44v)。
[006引用小鼠空白血浆配制浓度分别为100,60,48, 36, 24,6ng/mL标准工作液按步骤2 中血浆样品前处理方法处理后进行LC-MS/MS检测，每个标准工作液进样量5μL建立标准 曲线，计算人参皂巧Rgi线性回归方程。检出限实验、定量限实验、回收率实验、日内精密度 和日间精密度实验按常规质谱方法学考察方法实施。
[0066] 2. 5血浆样品中人参皂巧Rg洽量测定
[0067] 按上述标准曲线色谱条件和质谱条件对经前处理的血浆样品进行测定，进样量为 5μL利用线性回归方程，计算血浆样品中人参皂巧Rgi的含量。
[006引 做实验结果
[006引 3.IRgi入血量检测结果
[0070] 检测采用多反应监测（MRM)模式，对人参皂巧Rgi进行定量离子和定性离子扫描， 信号灵敏，得到色谱图，如图1所示，图1中A为样品中Rgi总离子流色谱图，B为Rgi定量碎 片离子总离子流色谱图，C为Rgi定性碎片离子总离子流色谱图。经检测得出各血浆样品中 人参皂巧Rgi浓度，经定量分析发现联合组小鼠血浆中Rg1含量极显著高于单一给药的Rg1 组（P< 0. 01即具有极显著差异），提高到1. 78倍，如图2、图3与表1所示，图2为Rgi组 各血浆样品Rgl总离子流色谱峰图；图3为Rgl+B族维生素组各血浆样品Rgl总离子流色 谱峰图。
[00川表1B族维生素对人参皂巧Rgl入血量的影响（了±5η= 10)
[0072]
注：与Rgl组相比*表示有显著差异（Ρ<〇. 05)，表示有极显著差异（Ρ<0. 01)
[0073] 3. 2线性关系考察
[0074] 用小鼠空白血浆配制浓度分别为100,60,48, 36, 24,6ng/血标准工作液，按脑组 织前处理方法处理后进行LC-MS/MS检测，每个标准工作液进样量5μL建立标准曲线，计 算人参皂巧Rgl线性回归方程。测得血浆样品中人参皂巧Rgl在6~l(K)ng/mL范围内呈良 好的线性关系r=0. 99865 (η=6)。
[0075] 3. 3检出限和定量限实验
[0076] 将低浓度的标准工作液W小鼠空白血浆提取液稀释经前处理后测得该方法检出 限为 1. 5ng/mL(S/N= 3)，定量限为 4ng/mL(S/N= 10)。
[0077] 3. 4回收率实验
[007引利用小鼠血浆进行60ng/mL，25ng/mL，1化g/mL 3个添加水平的回收实验，经如上 所述的血浆样品前处理方法处理后，按本实验方法中的液相和质谱条件进行检测，测得回 收率为83%~99%。
[0079] 3. 5日内精密度和日内精密度实验
[0080]进标准工作液5μL连续重复进样6次，据峰面积计算RSD为3. 0%，可见日内精 密度良好。同一标准工作液连续Ξ天在同一时间内进样5μL据峰面积计算RSD为4. 5%， 可见日内精密度也良好。
[00引]实施例5
[0082] Β族维生素对人参皂巧Rgl入脑量的影响
[008引 （1)材料
[0084]UPLC/XEV0 TQ超高压液相色谱-Ξ重四级杆串联质谱联用仪，美国Waters公司 生产；Q粥起猿HLB固相萃取小柱，美国Waters公司生产；Milli-Q Advantage A10超纯水 器，美国Millipore公司生产；XS205DU十万分之一电子天平，瑞：t Mettler Toledo公司生 产細胞组织破碎仪，美国肥XT ADVANCE公司生产；3-30K高速台式冷冻离屯、机，德国Sigma 公司生产；微量样品高灵敏度光吸收酶标仪，瑞±Tecan公司生产。
[00财 ICR小白鼠50只，雄性，体重20±2g，由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提 供，SPF级，合格证号：SCXK(吉）-2011-0004。
[0086] 人参皂巧Rgl单体化合物，纯度大于98%，由吉林大学化学学院提供；维生素Bi、 Β2、Β3、Β5、Β6、Β,、Β9、Βι2(化学纯），由上海源叶生物科技有限公司提供；盐酸异丙肾上腺素由 济南凯恩医药科技有限公司生产；内标化合物地高辛纯度大于98%由成都植标化纯生物 技术有限公司生产；一氧化氮测定试剂盒（硝酸还原酶法）由南京建成生物工程研究所提 供；甲醇和乙腊（色谱纯）由美国Fisher公司生产；氨水（色谱纯）由天津市光复精细化 工研究所生产。
[0087] 似方法
[0088] 2. 1动物分组给药和急性屯、肌缺血模型的制备
[008引 50只雄性ICR小白鼠适应性喂养一周后，随机分成五组：1、对照组；2、模型组；3、 Rgi组；4、B族维生素组；5、Rg1+B族维生素联合组。对照组和模型组给予溶药媒介0. 5%簇 甲基纤维素钢溶液，Rgi组按20mg/kg剂量给予人参皂巧Rgi，B族维生素组设定小鼠灌胃 剂量为Bi2. 25mg/kg、B22. 25mg/kg、B37. 5mg/kg、Bs3. 45mg/kg、Bgl. 5mg/kg、B722. 5 μ g/kg、 B96Oμg/kg、B12I. 5μg/kg，联合组同时给予Rgi (20mg/kg)和B族维生素，用法同上。连续 灌胃给药10天，每天记录体重。除对照组外，其他四组在第8天，第9天和第10天在给药 半小时后按照20mg/kg剂量腹腔注射盐酸异丙肾上腺素（IS0-HC1)制造急性屯、肌缺血小鼠 模型。
[0090] 2. 2动物脑组织的取得和前处理
[0091] 在第10天注射盐酸异丙肾上腺素3小时后摘眼球取血并处死小鼠，取出完整大 脑，用生理盐水冲洗后滤纸吸干，用锡纸包好放-80°C冰箱保存待测。准确称取Rgi组和联合 组小鼠大脑组织0. 4g放入离屯、管中加入1. 2血生理盐水，利用细胞组织破碎仪匀浆2min， 超声lOmin,然后1000化/min, 4°C离屯、lOmin，统一取出1. 0血上清液放入另一干净离屯、管 中，重复上述提取步骤1