，为44. 0%，并且以低聚糖为主，占总糖的62%，其中蔗糖占总糖的38. 9%左右，而功能性低 聚糖中棉子糖和水苏糖占总糖的比例相对较少，分别为5. 9%和17. 2%，由于高含量的蔗糖 存在大大降低了大豆糖蜜中低聚糖的功能性，所以去除糖蜜中的蔗糖是非常必要的。
[0039] 2、大豆糖蜜的预处理 量取60 mL大豆糖蜜，用蒸馏水稀释6倍，在100 °C密闭的试管中加热15 min，在10， 000 rpm高速离心15 min,吸取上清液。
[0040] 3、活性炭柱预处理 量取500 mL的活性炭，加入2500 mL蒸馈水加热至沸，保持微沸30 min,然后补加热开 水至5000 mL，趁热灌装至60 cmX2. 5 cm的夹套玻璃柱中，用去离子水以I mL/min的流速 平衡4 h。
[0041] 4、大豆糖蜜中功能性低聚糖的分离纯化 将步骤2中处理好的大豆糖蜜连续上样到步骤3中预处理好的活性炭柱中，用蒸馏水 以I mL/min的流速洗脱2-3个柱体积，再用0%-20%的乙醇线性洗脱，分部收集，对收集得 到的样品进行薄层层析（TLC)和高效液相分析（HPLC)。由图1和图2. A可以看出，样品中 含有葡萄糖、蔗糖、棉子糖和水苏糖等，其中以蔗糖含量最多，水苏糖含量次之，蔗糖和单糖 (果糖和葡萄糖)比例占到63. 3%。通过活性炭色谱层析，利用乙醇线性洗脱能够很好的将大 豆低聚糖和蔗糖以及葡萄糖分离。在洗脱过程中，葡萄糖和果糖最先被洗脱，随着乙醇浓度 的不断增加，单糖逐渐被洗脱下来，当乙醇浓度达到1%左右时，蔗糖开始被洗脱，继续增加 乙醇浓度，当乙醇浓度达到3%时功能性低聚糖棉子糖和水苏糖开始洗脱，此时蔗糖和单糖 等非功能性糖基本被洗脱完全。由图2. B可以看出，经过活性炭色谱分离后，大豆糖蜜中的 蔗糖和单糖全部被除去，所收集的样品中只含有棉子糖、水苏糖和一未知的双糖，含量分别 为21. 6%、78. 2%和0. 2%，通过计算获得棉子糖和水苏糖的回收率分别达到78. 6%和99. 2%， 总回收率达到82. 5%，具体参见表2。
[0042] 表2活性炭色谱层析纯化前后大豆糖蜜中糖成分的变化
通过活性炭色谱分离方法可以获得高纯度的功能性大豆低聚糖，几乎不含有蔗糖和单 糖等非功能性糖，并且具有较高的回收率。活性炭在糖生成过程中主要用作脱色剂，色谱型 活性炭同样具有脱色。由实验结果可以发现，大豆糖蜜在242 nm处具有较高的吸收峰，测 定纯化前大豆糖蜜的吸光值为53. 4,纯化后收集浓缩至上样体积后的吸光值为3. 93,脱色 率达到92. 6%。如图3所示，大豆糖蜜经稀释5倍离心后取上清溶液，发现该样品呈棕红色， 并且有甜香味，而经过纯化浓缩后样品无色透明，并且无味，说明该色谱型活性炭在分离纯 化大豆功能性低聚糖的同时，还具有脱色素的作用。
[0043] 5、功能性大豆低聚糖干粉的制备 收集步骤4中含有水苏糖和棉子糖而不含有蔗糖部分的样品溶液，利用真空旋转蒸发 方法浓缩至固形物含量为65%以上，通过真空冷冻干燥方法制备功能性大豆低聚糖干粉。
[0044] 实施例2、功能性大豆低聚糖抗氧化特性 1、功能性大豆低聚糖清除 OH自由基 采用H202/Fe2+体系，取0. 2 mol/L pH 7. 4磷酸缓冲液（PBS) 2. 0 mL加入试管中，加入 5父103111〇1/1的邻二氮菲溶液1.5 1^，混匀。加入7.5臟〇1/1的？65041.0 1^混匀。未 损伤管加5. 5 mL蒸馈水，混匀，37 °C保温I h，测OD536 (未损伤);损伤管加4. 5 mL蒸馈水， 再加入I mLO. 1%的H2O2，混匀，37 °C保温I h，测OD536 (损伤);样品管加3. 5 mL蒸馏水，加 入I mL不同浓度梯度的样品（纯化后浓缩的大豆低聚糖)，再加入I mL 0.1%的H2O2，混匀， 37 °C保温I h，测OD536 (样品）。
[0045] 羟基自由基清除率（％)=[( OD536样品-OD536损伤）/(OD536未损伤-OD536损 伤）]X100%。
[0046] 利用纯化后干燥的功能性大豆低聚糖配制成的样品溶液(棉子糖、水苏糖和其它 功能性糖浓度分别为20. 7 mg/mL、74. 9mg/mL和6. 9mg/mL)具有一定的清除OH自由基的 能力，清除能力达到53. 1%。
[0047] 2、功能性大豆低聚糖清除DPPH自由基 准确称取20 mg DPPH，用无水乙醇定容于250 mL容量瓶中，得到浓度为2X 10 4mol/L 的DPPH溶液。利用DPPH溶液在517 nm的特征吸收峰，用紫外-可见分光光度计测定加抗 氧化剂后OD517吸收的下降表示其对有机自由基的清除能力。反应体系为3 mL，按照表3进 行加样后，混匀，避光室温放置30 min，测定517 nm波长下吸光值得变化。按照下列公式计 算抗氧化物质的抑制率。
表3清除DPPH自由基能力试验加样表
大豆功能性低聚糖对DPPH也具有清除自由基的能力，表现出一定的氧化能力，利用上 述配制的大豆低聚糖溶液测定的抑制率能达到17. 6%。
[0049] 实施例3、功能性大豆低聚糖抗过敏特性 1、功能性大豆低聚糖抗瘙痒 将70只小鼠随机分为7组，每组10只，分为模型对照组；盐酸苯海拉明对照组；中药组 (桃仁0.3 g、玳玳花0.4 g、桑叶0.15 g、紫苏叶0.15 g、乌梅肉0.15 g);过敏康组(中药 成分中添加 I g纯化后冷冻干燥的大豆低聚糖粉)。造模前7天开始给予五种受试药物，以 盐酸苯海拉明为阳性对照药，模型对照组为赋性剂。采用末次给药I h后，向各组小鼠尾静 脉注射0.025%右旋糖酐0.05 mL/10 g (1.25 mg/kg)。以小鼠前爪搔抓头部、后爪搔抓躯 干、嘴咬全身各部位作为瘙痒症状。观察记录30 min内小鼠瘙痒次数及瘙痒持续时间。
[0050] 试验结果如图4所以，由图可以看出，与模型组比较，阳性对照盐酸苯海拉明组和 过敏康组能显著减轻右旋糖酐所致小鼠全身皮肤瘙痒，减少瘙痒次数，而中药组则效果不 显著（P〈0. 05)。由此可见，大豆低聚糖具有一定止痒效果以及促进中药的止痒效果。
[0051] 2、大豆低聚糖抗组胺 将BALB/c小鼠70只随机分为7组，每组10只。给药方法同1项。末次给药后I h， 每只小鼠尾静脉注射〇. 5%伊文思蓝生理盐水溶液5 mg/kg。立即于小鼠腹部正中事先已脱 毛皮肤处内注射0. 1%磷酸组胺0.1 mL/只，形成小皮丘。30 min后，将小鼠脱颈椎致死，剖 开腹部，剪下腹部皮肤，平铺于玻璃板上，测量注射部位蓝斑的最长直径和与之垂直的最长 径，按椭圆形面积公式计算皮肤蓝斑面积（S= π AB)。剥下腹部蓝染皮肤，用手术剪剪碎，置 试管内，加入4 mL丙酮-生理盐水（7 :3)混合液，振摇。浸泡24 h后，2000 r/min离心10 min,取上清液于分光光度计610 nm处比色，记录OD值，按以下公式计算抑制率。抑制率= (模型组值-干预组值）/模型组值X 100%。
[0052] 同样，与模型组比较，阳性对照盐酸苯海拉明组和过敏康组能明显减小组胺导致 的小鼠腹部风团面积（P〈〇. 05)而中药组却效果不明显（图5)。过敏康组与中药组相比，小 鼠腹部风团面积下降接近一倍，具有很好的抗敏作用。由此可见，大豆低聚糖具有良好的抗 过敏效果和抗组胺效果。
【主权项】
1. 成分A在制备抗过敏药物、抗过敏食物或抗过敏保健品中的应用，所述的成分A为大 豆低聚糖或者含有大豆低聚糖的物质。2. 成分A在制备降低组胺药物、降低组胺食物或降低组胺保健品中的应用，所述的成 分A为大豆低聚糖或者含有大豆低聚糖的物质。3. 成分A在制备抗瘙痒药物、抗瘙痒食物或抗瘙痒保健品中的应用，优选的，所述瘙痒 是由于过敏引起的，所述的成分A为大豆低聚糖或含有大豆低聚糖的物质。4. 根据权利要求1-3之一所述的应用，其特征在于：所述的成分A中大豆低聚糖含量 大于0.lwt%，优选的大于0. 5wt%，优选的大于lwt%，优选的大于2wt%，优选的大于5wt%, 优选的大于8wt%，优选的大于10wt%，优选的大于15wt%，优选的大于20wt%，优选的大于 25wt%，优选的大于30wt%，优选的大于35wt%，优选的大于40wt%，优选的大于45wt%，优选的 大于50wt%，优选的大于55wt%，优选的大于60wt%，优选的大于65wt%，优选的大于70wt%， 优选的大于75wt%，优选的大于80wt%，优选的大于85wt%，优选的大于90wt%，优选的大于 95wt%，优选的大于96wt%，优选的大于97wt%，优选的大于98wt%，优选的大于99wt%，优选的 大于99. 5wt%，优选的大于99. 9wt%，优选的为100wt%。5. 根据权利要求1-4之一所述的应用，其特征在于：所述成分A按照以下方法制备而 来，该方法包括以下步骤： 1) 将大豆糖蜜溶于水中，去除蛋白等杂质； 2) 通过乙醇线性梯度洗脱，纯化得到大豆低聚糖。6. 根据权利要求1-5之一所述的应用，其特征在于：所述成分A按照以下方法制备而 来，该方法包括以下步骤： 1) 将大豆糖蜜中的固形物含量用蒸馏水稀释为10%左右，在100 °C保温15min，10 000 rpm，离心10min，去除蛋白等杂质； 2) 活性炭中加入适量的蒸馏水，煮沸，保持30min，趁热灌装入夹套玻璃柱中，用蒸馏 水以1mL/min的流速平衡4h; 3) 利用色谱型活性炭纯化步骤1)中处理好的大豆糖蜜，通过乙醇线性梯度洗脱，纯化 得到功能性大豆低聚糖。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述步骤3)中，首先利用蒸馏水洗脱，然 后再利用0%_20%的乙醇线性梯度浓度洗脱，分部收集得到功能性大豆低聚糖。8. -种制备大豆低聚糖的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤： 1) 将大豆糖蜜溶于水中，去除蛋白等杂质； 2) 通过乙醇线性梯度洗脱，纯化得到大豆低聚糖。9. 根据权利要求8所述方法制备的大豆低聚糖。10. 含有权利要求9所述大豆低聚糖的食品、药品或保健品。
【专利摘要】本发明的目的是提供一种高效、快捷和高回收率的从大豆糖蜜中分离功能性大豆低聚糖的制备方法，同时研究了大豆低聚糖在抗过敏食品或药品中的应用，能够降低组胺药物的使用，促进抗过敏药物的效果。
【IPC分类】A61P37/08, A61P39/06, C07H3/06, C07H1/08, A61K31/702, A61P17/04
【公开号】CN105434448
【申请号】CN201410439406
【发明人】段盛林, 蔡木易, 范光森, 刘杰, 王雪
【申请人】中国食品发酵工业研究院
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2014年9月1日