个保守氨基酸替换。例如，本发明 包括使用含有HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列的抗PCSK9抗体，相对于本文所公开的任何 HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列，该氨基酸序列含有例如10个或以下、8个或以下、6个或以 下、4个或以下等保守氨基酸替换。
[0065]本文所用的术语"表面等离子共振"是指一种光学现象，基于该光学现象可利用例 如BIAcore?系统(Biacore Life Sciences division of GE HealthcarejPiscataway,NJ) 来检测生物感测器基质中蛋白质浓度的变化，从而实时分析相互作用。
[0066]本文所用的术语"KD"意指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。
[0067]术语"表位"是指抗原决定位，其与抗体分子中称为抗原互补位的可变区中一个特 异性抗原结合位点相互作用。单个抗原可以有一个以上表位。因此，不同的抗体可与一个抗 原的不同区域结合并可产生不同的生物学效应。表位可为构象的，也可为线性的。构象表位 是由线性多肽链不同碎片中空间并列的氨基酸产生的。线性表位是由多肽链上邻近的氨基 酸残基形成的。在某些情况下，表位可包括抗原上的糖类、磷酰基或磺酰基等基团。
[0068]依照某些实施例，用于本发明之方法的抗PCSK9抗体是一种具有pH依赖性结合特 征的抗体。本文所用的表述"pH依赖性结合"，意为该抗体或其抗原结合片段展现了"在酸性 pH条件下与PCSK9的结合力比在中性条件下为低"的特征（出于本公开书的目的，两种表述 可以互换使用）。例如，具有"pH依赖性结合特征"的抗体，包括在中性条件下与PCSK9的结合 亲和力比在酸性pH条件下为高的抗体或其抗原结合片段。在某些实施例中，本发明之抗体 及其抗原片段在中性pH值条件下与PCSK9结合的亲和力，比在酸性pH值条件下至少要高3、 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100 倍或更高。
[0069] 依照本发明之这一方面，相对于亲本抗PCSK9抗体，具有pH依赖性结合特征的抗 PCSK9抗体可以具有一种或多种氨基酸变异。例如，具有pH依赖性结合特征的抗PCSK9抗体 可以在例如亲本抗PCSK9抗体的一个或多个CDR中包含一个或多个组氨酸替换或插入。因 此，依照本发明之某些实施例，提供了一些包括施用含CDR氨基酸序列（例如重链和轻链 CDR)的的抗PCSK9抗体的方法，除了亲本抗体的一个或多个CDR中一个或多个氨基酸被组氨 酸残基替换外，该CDR氨基酸序列与亲本抗PCSK9抗体的CDR氨基酸序列是相同的。具有pH依 赖性结合特征的抗PCSK9抗体可具有例如1、2、3、4、5、6、7、8、9个或更多的组氨酸替换，这些 组氨酸替换可存在于亲本抗体的单一CDR中，或分散在亲本抗PCSK9抗体的多个(例如2、3、 4、5或6个)CDR中。例如，本发明包括使用呈pH依赖性结合之抗PCSK9抗体，其在亲本抗PCSK9 抗体之HCDRl内包含一个或多个组氨酸替换、HCDR2内包含一个或多个组氨酸替换、H⑶R3内 包含一个或多个组氨酸替换、LCDRl内包含一个或多个组氨酸替换、LCDR2内包含一个或多 个组氨酸替换及/或LCD3内包含一个或多个组氨酸替换。
[0070] 本文所用的表述"酸性pH"，意为6.0或更低（例如，低于约6.0、低于约5.5、低于约 5.0等）的？田直。"酸性?!1"这一表述包括约6.0、5.95、5.90、5.85、5.8、5.75、5.7、5.65、5.6、 5·55、5·5、5·45、5·4、5·35、5·3、5·25、5·2、5·15、5·1、5·05、5·0 或更低的 pH 值。本文所用的 表述"中性pH"，意为约7.0至约7.4的pH值。"中性pH"这一表述包括约7.0、7.05、7.1、7.15、 7.2、7.25、7.3、7.35以及7.4的口田直。
[0071] 人源抗体的制备
[0072]在转基因小鼠体内产生人源抗体的方法在本领域内是已知的。任何这类已知的方 法均可在本发明之背景下用于制造与人类PCSK9特异性结合的人源抗体。
[0073] 利用VEL0CIMMUNE?技术（参阅例如Regeneron Pharmaceuticals公司的美国第6， 596,541号专利)或任何其他产生单克隆抗体的已知技术，初步分离出对PCSK9具有高亲和 力的含有一个人类可变区和一个小鼠恒定区的嵌合抗体。VELOCIMMUNE?技术涉及建立 这样一种转基因小鼠：该小鼠的基因组包含一些与内源小鼠恒定区基因座操作性连接的人 源重链和轻链可变区，使得该小鼠能响应抗原刺激而产生一种包含人类源可变区和小鼠恒 定区的抗体。将编码该抗体的重链和轻链可变区的DNA分离出来，并与编码人类重链和轻链 恒定区的DNA操作性连接，然后在能够表达完全人类抗体的细胞中表达该DNA。
[0074] 通常，用所研究的抗原刺激VEL〇C|M_NE?小鼠，并从表达抗体的小鼠体内回收 淋巴细胞(如B细胞）。淋巴细胞可与骨髓瘤细胞系融合来制备永生杂交瘤细胞系，然后再对 这种杂交瘤细胞系进行筛选，以识别能产生对相关抗原具有特异性抗体的杂交瘤细胞系。 可将编码重链和轻链可变区的DNA分离出来，并与合乎需要的重链和轻链的同型恒定区连 接。此类抗体蛋白可在如CHO等细胞中产生。或者，编码抗原特异性嵌合抗体或轻链和重链 可变域的DNA可直接从抗原特异性淋巴细胞分离。
[0075] 首先分离包含一个人类可变区和一个小鼠恒定区的高亲和力嵌合抗体。该抗体是 根据所需的特性，包括亲和力、选择性、表位等，使用本发明所属技术领域中普通技术人员 已知的标准程序予以鉴定和选择的。用合乎需要的人类恒定区取代小鼠恒定区，以产生本 发明之完全人源抗体，例如野生型或经修饰的IgGl或IgG4。所选择的恒定区可根据特定的 用途而改变，而高亲和力抗原结合特性和靶标特异性特征则留存于可变区中。
[0076] -般而言，当以与固定在固相或液相的抗原结合的方式测定时，可用于本发明之 方法的抗体具有如上所述的高亲和力。用合乎需要的人类恒定区取代小鼠恒定区，以产生 本发明之完全人源抗体。所选择的恒定区可根据特定的用途而改变，而高亲和力抗原结合 特性和靶标特异性特征则留存于可变区中。
[0077] 与可用于本发明之方法背景下的PCSK9特异性结合的人源抗体或抗体的抗原结合 片段的具体实例，包括任何在重链可变区(HCVR)内包含三个重链⑶R(HCDR1、HCDR2、HCDR3) 的抗体或抗原结合片段，且该重链可变区包含的氨基酸序列选自以下一组序列，其序列号 为：2、18、22、26、42、46、50、66、70、74、90、94、98、114、118、122、138、142、146、162、166、170、 186、190、194、210、214、218、234、238、242、258、262、266、282、286、290、306、310、314、330、 334、338、354、358、362、378、382、386、402、406、410、426、430、434、450、454、458、474、478、 482、498、502、506、522、526、530、546、550、554、570、574、578、594、598、602、618、622、626、 642、646、650、666、670、674、690、694、698、714、718、722、738和742，或一种与其基本上相似 具有至少90 %、至少95 %、至少98%或至少99 %序列同一"性的序列。该抗体或抗原结合片段 可在轻链可变区（LCVR)内包含三个轻链CDR(LCVR1、LCVR2、LCVR3)，且该轻链可变区包含的 氨基酸序列选自以下一组序列，其序列号为：10、20、24、34、44、48、58、68、72、82、92、96、 106、116、120、130、140、144、154、164、168、178、188、192、202、212、216、226、236、240、250、 260、264、274、284、288、298、308、312、322、332、336、346、356、360、370、380、384、394、404、 408、418、428、432、442、452、456、466、476、480、490、500、504、514、524、528、538、548、552、 562、572、576、586、596、600、610、620、624、634、644、648、658、668、672、682、692、696、706、 716、720、730、740和744，或一种与其基本上相似具有至少90%、至少95%、至少98%或至少 99 %序列同一性的序列。
[0078] 在本发明的某些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括源自重链和轻链可变 区氨基酸序列对(HCVR/LCVR)的6个CDR(HCDRl、HCDR2、HCDR3、LCDRl、LCDR2和LCDR3)，该氨 基酸序列对选自以下一组序列对，其序列号为：2/10、18/20、22/24、26/34、42/44、46/48、 50/58、66/68、70/72、74/82、90/92、94/96、98/106、114/116、118/120、122/130、138/140、 142/144、146/154、162/164、166/168、170/178、186/188、190/192、194/202、210/212、214/ 216、218/226、234/236、238/240、242/250、258/260、262/264、266/274、282/284、286/288、 290/298、306/308、310/312、314/322、330/332、334/336、338/346、354/356、358/360、362/ 370、378/380、382/384、386/394、402/404、406/408、410/418、426/428、430/432、434/442、 450/452、454/456、458/466、474/476、478/480、482/490、498/500、502/504、506/514、522/ 524、526/528、530/538、546/548、550/552、554/562、570/572、574/576、578/586、594/596、 598/600、602/610、618/620、622/624、626/634、642/644、646/648、650/658、666/668、670/ 672、674/682、690/692、694/696、698/706、714/716、718/720、722/730、738/740及742/744。
[0079] 在本发明的某些实施例中，可用于本发明之方法的抗PCSK9抗体或其抗原结合片 段包括含有选自以下一组序列的HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3氨基酸序列，其 序列号为：76/78/80/84/86/88(mAb316P)和 220/222/224/228/230/232(mAb300N)(参阅美 国专利申请公开书2010/0166768)。
[0080]在本发明的某些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下一组序列对 的 HCVR/LCVR 氨基酸序列对，其序列号为：2/10、18/20、22/24、26/34、42/44、46/48、50/58、 66/68、70/72、74/82、90/92、94/96、98/106、114/116、118/120、122/130、138/140、142/144、 146/154、162/164、166/168、170/178、186/188、190/192、194/202、210/212、214/216、218/ 226、234/236、238/240、242/250、258/260、262/264、266/274、282/284、286/288、290/298、 306/308、310/312、314/322、330/332、334/336、338/346、354/356、358/360、362/370、378/ 380、382/384、386/394、402/404、406/408、410/418、426/428、430/432、434/442、450/452、 454/456、458/466、474/476、478/480、482/490、498/500、502/504、506/514、522/524、526/ 528、530/538、546/548、550/552、554/562、570/572、574/576、578/586、594/596、598/600、 602/610、618/620、622/624、626/634、642/644、646/648、650/658、666/668、670/672、674/ 682、690/692、694/696、698/706、714/716、718/720、722/730、738/740及742/744。
[0081 ]药物组合物及给药方法
[0082] 本发明包括一些给患者施用一种PCSK9抑制剂的方法，该PCSK9抑制剂包含在一种 药物组合物中。本发明之药物组合物是与适宜的载体、辅料以及赋予药物各种适宜特性如 转移、递送、耐受性等其他试剂一起配制的。在以下这本所有药剂化学师都知道的处方集里 可以找到许多适宜的配方：雷明登药学大全（Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company，Easton，PA.)。这些配方包括，如粉剂、糊剂、油膏、凝胶、錯剂、 油剂、脂类、脂质（阳离子或阴离子)囊泡(如LIPOFECTIN?)、DNA偶联物、无水吸收性糊剂、水 包油或油包水乳剂、乳胶状碳蜡(各种分子量的聚乙二醇）、半固体状凝胶以及含有碳蜡的 半固体状混合物。还可参阅Powell et al.''Compendium of excipients for parenteral formulations"PDA(1998)J Pharm Sci Technol52:238-31I〇
[0083] 已知有各种药物递送系统可用于本发明之药物组合物的给药，例如脂质体封装、 微颗粒、微胶囊、能表达突变病毒的重组细胞、受体介导的胞吞作用（参阅如Wu et al.， 1987，J. Biol. Chem. 262:4429-4432)。给药方法包括但不限于皮内、肌内、腹腔内、静脉、皮 下、鼻内、硬膜外以及经口。该组合物可经由任何方便的途径给药，例如，输注或大剂量注 射，经上皮或粘膜(例如口腔粘膜、直肠和肠道粘膜等)吸收，并可与其他生物活性剂一起给 药。
[0084] 本发明之药物组合物可用标准针头和注射器经皮下或静脉给药。此外，对于皮