专利名称：Pcsk9拮抗剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及拮抗细胞外前蛋白转化酶枯草溶菌素9 (proproteinconvertase subtilisin kexin type 9) (PCSK9)的活性的抗体，例如全长抗体或其抗原结合部位)、肽及适体，所述活性包括PCSK9与低密度脂蛋白(LDL)受体(LDLR)的相互作用。更具体地说， 本发明涉及包含拮抗剂PCSK9抗体、肽和/或适体的组合物，及使用这些抗体和/或肽和/ 或适体以作为药物的方法。拮抗剂PCSK9抗体、肽及适体可被治疗性地使用以降低血液中 LDL-胆固醇水平，且可被用于预防和/或治疗胆固醇及脂蛋白代谢异常，包括家族性高胆固醇血症、致动脉粥样化的异常血脂症、动脉粥样硬化症及更普遍地心血管疾病(CVD)。
背景技术：
美国有数百万人面临心脏病的风险且导致心脏事件。CVD和潜在动脉粥样硬化症是所有人口族群的首要死因，尽管可提供针对其多风险因子的治疗。动脉粥样硬化症是动脉疾病，在工业化国家导致与许多死亡有关的冠状动脉心脏病。数种冠状动脉心脏病的风险因子现已被发现包括异常血脂症、高血压、糖尿病、抽烟、不良饮食、不活动及压力。最具临床相关性及常见的异常血脂症的特征为伴随高胆固醇血症的脂蛋白(极低密度脂蛋白(VLDL)和LDL)增加，不论是否有高三酸甘油脂血症(Fredrickson et al. ,1967,N Engl J Med. 276 :34-42,94-103,148-156，215-225 和 273-281)。一直以来有关 CVD 的需求明显地未被满足，因为即使使用他汀(statins)治疗(目前动脉粥样硬化症的标准治疗)仍有 60至70%的心血管事件、心脏病发作及中风发生率。另外，新的准则建议应达到更低的LDL 量以防止高风险病患发生早熟性CVD[美国胆固醇教育计划(NCEP)，2004]。PCSK9又名NARC-1，是在若干形式的家族性高胆固醇血症中被发现的一种基因突变蛋白质。PCSK9被合成为酶原，其于内质网中进行模体(motif)LVFAQ的自体催化处理。 族群试验显示，若干PCSK9突变是“获得功能”的突变且发生于体染色体显性高胆固醇血症的个体，然而其他“失去功能(LOF) ”的突变则与血浆胆固醇减少有关。此族群的发病率及死亡率试验清楚地显示，降低PCSK9的功能显著地减少心血管疾病的风险。在治疗CVD上具有显著重要性的是，LOF突变使人对他汀敏感化，能以较低剂量得到疗效(因此改善与安全性及耐受性有关的风险)且相较于现行治疗可能达到较低的血浆胆固醇水平。PCSK9主要由肝细胞分泌至血浆。小鼠中PCSK9的基因调节证实PCSK9具有调节血脂肪的能力，且暗示其下调(down-regulate)肝脏LDLR蛋白量的作用。PCSK9下调LDLR蛋白所凭借的机制及所发生的部位尚未被清楚建立。当过度表达时，PCSK9可在肝细胞内作用，同时可作为LDLR的分泌性配位体。强有力的证据显示，细胞外PCSK9与细胞表面LDLR结合且促使LDLR于胞内部位降解。然而，PCSK9亦有可能与 LDLR发生相互作用，当二者于内质网(ER)内翻译且经由内体结构被运往细胞膜时。马克斯韦尔等人(Maxwell et al. , 2005, Curr. Opin. Lipidol. 16 167-172)的研究显示，PCSK9 介导性LDLR内摄作用和降解不会被蛋白酶体抑制剂改变，也不会受到不同类型的溶酶体及非溶酶体蛋白酶的调节。二个天然发生的家族性高胆固醇血症突变S127R和DU9G已被报告为自加工及分泌缺陷，因为这些突变蛋白质在转染细胞培养基中的量大幅降低或无法侦测。然而这些突变显示增进下调LDLR的能力，与彼等可在高血浆LDL的个体中识别吻合(Homer et al.，2008，Atherosclerosis 196 :659-666 ；Cameron et al.，2006 Human MolecularGenetics 15 :1551-1558 ；Lambert et al. ,2006,TRENDS in Endocrinologyand Metabolism 17:79-81)。由于这些突变很明显地不会被分泌至细胞外但仍下调LDLR，因此强烈建议胞内作用部位具生理重要性。在本发明以前从本领域可取得的信息仍无法得知，导入以抗体、肽或适体为基础的PCSK9拮抗剂至血液循环以选择性拮抗细胞外PCSK9，是否能有效减少高胆固醇血症及相关CVD的发生率，且如果可以的话，PCSK9拮抗剂的何种性质为所述活体内有效性的所必
箭ο
发明内容
本发明涉及选择性地与PCSK9相互作用且抑制PCSK9功能的拮抗剂抗体、肽及适体。本发明首次证明特定PCSK9拮抗剂类可于活体内有效降低血液中胆固醇。在一个实施方式中，本发明提供一种经分离的PCSK9拮抗剂，其包含与PCSK9相互作用且对受试对象施用时降低所述受试对象血液中LDL-胆固醇水平的抗体、肽或适体。所述拮抗剂可为抗体，例如单克隆抗体或人抗体、人源化抗体、或嵌合抗体。在另一个实施方式中，本发明提供一种经分离的抗PCSK9抗体，所述抗体与PCSK9 特异性结合且当利用文中所揭示的Η 7细胞的LDLR下调试验进行活体外测量时，所述抗体是PCSK9对LDLR水平的介导效应的完全拮抗剂。在另一个实施方式中，本发明提供一种经分离的抗体，所述抗体拮抗以活体外 PCSK9与LDLR结合所测量的PCSK9与LDLR的细胞外相互作用，且对个体施用时降低所述个体血液中LDL胆固醇水平。优选的是，所述抗体辨识人PCSK9上的表位，所述表位与和LDLR 的EGF样结构域相互作用的PCSK9表面重迭超过约75% JBKwon et al.，2008，PNAS，105 1820-1825 所述。在另一个实施方式中，本发明提供一种抗体，所述抗体辨识PCSK9的第一表位，所述第一表位与经单克隆抗体辨识的第二表位重迭，所述单克隆抗体选自由保藏于美国菌种保存中心(ATCC)的登录号PTA-8986的杂交瘤细胞系所产生的5A10、由保藏于美国菌种保存中心的登录号PTA-8985的杂交瘤细胞系所产生的4A5、由保藏于美国菌种保存中心的登录号PTA-8984的杂交瘤细胞系所产生的6F6)或由保藏于美国菌种保存中心的登录号 PTA-8983的杂交瘤细胞系所产生的7D4。在另一个实施方式中，本发明提供一种抗人PCSK9抗体，其中所述抗体辨识人 PCSK9上的表位，该表位包含PCSK9氨基酸序列SEQ IDNO 53的氨基酸残基153-155、194、 195、197、237-239、367、369、374-379和381。优选的是，该人PCSK9上的抗体表位不包含一个或多个氨基酸残基 71、72、150-152、187-192、198-202、212、214-217、220-2洸、243、 255-258、317、318、347-351、372、373、380、382 和 383。在另一个实施方式中，本发明提供一种与PCSK9特异性结合的抗体，所述抗体包含具有SEQ ID NO :8 (SYYMH)所示的氨基酸序列的VH互补决定区1(⑶Rl)、具有SEQID NO 9 (EISPFGGRTNYNEKi7KS)所示的氨基酸序列的 VH CDR2、和 / 或具有 SEQ ID NO: 10 (ERPLYASDL)所示的氨基酸序列的VH⑶R3，或者它们在⑶R1、⑶R2和/或⑶R3的所述序列中具有一个或多个保守氨基酸取代的变异体，其中所述变异体保留实质上与所述序列所定义的CDR相同的结合特异性。优选的是，该变异体包含最多约10个氨基酸取代，且更优选的是最多约4个氨基酸取代。本发明另关于一种抗体，所述抗体包含具有SEQ ID NO :11(RASQGISSALA)所示的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO :12(SASYRYT)所示的氨基酸序列的CDR2、和/或具有SEQ ID NO 13 (QQRYSLffRT)所示的氨基酸序列的⑶R3，或者它们在⑶R1、⑶R2和/或 CDR3的所述序列中具有一个或多个保守氨基酸取代的变异体，其中所述变异体保留实质上与所述序列所定义的CDRl相同的结合特异性。优选的是，所述变异体包含最多约10个氨基酸取代，且更优选的是最多约4个氨基酸取代。在另一个实施方式中，本发明提供一种抗体，所述抗体包含特异性VL⑶R1、⑶R2 和/或CDR3序列，或者它们在CDRl、CDR2和/或CDR3中具有一个或多个保守氨基酸取代的变异体，且另包含具有SEQ ID NO :59、60或8所示的氨基酸序列的VH互补决定区⑶Rl、 具有SEQ ID NO :61或9所示的氨基酸序列的VH⑶R2、和/或具有SEQ ID N0:10所示的氨基酸序列的VH⑶R3，或者它们在⑶R1、⑶R2和/或⑶R3的所述序列中具有一个或多个保守氨基酸取代的变异体，其中所述变异体保留实质上与所述序列所定义的CDR1、CDR2和 /或CDR3相同的结合特异性。优选的是，所述变异体包含最多约20个氨基酸取代，且更优选的是最多约8个氨基酸取代。在另一优选的实施方式中，本发明的抗体具有包含SEQ ID NO力4或由SEQ ID NO 54所组成的可变重链序列及包含SEQ ID NO 53或由SEQ ID NO 53所组成的可变轻链序列。本发明还提供一种人源化抗体，所述抗体包含选自SEQ ID NO :14、SEQ ID NO :15、 或SEQ ID N0:14及SEQ ID NO :15 二者，或者它们在所述序列中具有一个或多个保守氨基酸取代的变异体的多肽，其中所述变异体保留实质上与所述序列所定义的抗体相同的结合特异性。所述抗体还包括在重链上缺乏末端赖氨酸的抗体，因为在制造期间所述赖氨酸通常在一部分的抗体中丧失。优选的是，所述变异体包含最多约20个氨基酸取代，且更优选的是，最多约8个氨基酸取代。优选的是，所述抗体另包含免疫惰性恒定区，和/或所述抗体具有选自IgG2、 IgG4、IgG2h、IgG4Ab、IgG4^、IgG4 S228P、IgG4^ S228P 或 IgG4^ S228P 的同种型。在另一优选的实施方式中，该恒定区是非糖基化Fe。在一个实施方式中，本发明提供一种降低有此需要的个体的血液、血清或血浆中的LDL、LDL-胆固醇或总胆固醇水平的方法，该方法包含对所述个体施用治疗有效量的本发明的拮抗剂。在一个实施方式中，本发明提供治疗有效量的本发明的拮抗剂以用于降低有此需要的个体的血液、血清或血浆中的LDL、LDL-胆固醇或总胆固醇水平。本发明另提供治疗有效量的本发明的拮抗剂于制造供降低有此需要的个体的血液、血清或血浆中的LDL、 LDL-胆固醇或总胆固醇水平的药物的用途。在另一个实施方式中，本发明提供一种制备与PCSK9特异性结合的抗体的方法， 该方法包含a)提供PCSK9阴性宿主动物；b)以PCSK9对所述PCSK9阴性宿主动物免疫接种；及c)获得抗体。来自所述PCSK9阴性宿主动物的抗体产生细胞、或抗体编码核酸，及自所述抗体产生细胞或所述抗体编码核酸制备抗体。本发明还包含一种降低有此需要的受试对象血液中LDL量的方法，所述方法包含对所述受试对象施用治疗有效量的本发明所制备的抗体。所述受试对象可进一步藉由施用他汀治疗。在优选的实施方式中，所述受试对象是人受试对象。在一个实施方式中，所述抗体以无菌含水溶液的制剂施用，所述制剂具有介于约 5. 0至约6. 5的pH值且包含自约lmg/ml至约200mg/ml的抗体、自约ImM至约IOOmM的组氨酸缓冲剂、自约0. 0lmg/ml至约10mg/ml的聚山梨醇酯80、自约IOOmM至约400mM的海藻糖(trehalose)及自约0. OlmM至约1. OmM的EDTA 二钠二水合物。在另一个实施方式中，本发明提供治疗有效量的本发明所制备的抗体以用于降低有此需要的个体的血液中LDL量。本发明另提供治疗有效量的本发明所制备的抗体于制造供降低有此需要的个体的血液中LDL量的药物的用途。所述治疗有效量可随意地与治疗有效量的他汀组合。在另一个实施方式中，本发明提供一种产生PCSK9特异性抗体或其抗原结合部位的杂交瘤细胞系，其中所述杂交瘤细胞系选自ATCC 登录号 PTA-8985 的 4A5 ；ATCC 登录号 PTA-8986 的 5A10 ；ATCC 登录号 PTA-8984 的 6F6 ；及ATCC 登录号 PTA-8983 的 7D4。在另一个实施方式中，本发明提供一种细胞系，所述细胞系重组产生与PCSK9特异性结合的抗体且所述抗体包含具有SEQ ID NO :8、59或60所示的氨基酸序列的重链可变区(VH)互补决定区1 (⑶Rl)、具有SEQ ID NO 9或61所示的氨基酸序列的VH⑶R2、和 /或具有SEQ ID NO 10所示的氨基酸序列的VH⑶R3，或者它们在⑶R1、⑶R2和/或⑶R3 中具有一个或多个保守氨基酸取代的变异体，和/或包含具有SEQ ID N0:11所示的氨基酸序列的轻链可变区(VL)⑶R1、具有SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列的VL⑶R2、和/或具有SEQ IDNO 13所示的氨基酸序列的VL⑶R3，或者它们在⑶R1、⑶R2和/或⑶R3中具有一个或多个保守氨基酸取代的变异体。优选的是，所述细胞系重组产生包含SEQ ID N0:53 和/或M且更优选的是SEQ IDNO 14和/或15的抗体。
图1说明抗PCSK9拮抗剂单克隆抗体7D4. 4、4A5. G3、6F6. G10. 3及5A10. B8于培养的Huh7细胞中对于鼠PCSK9 (A)及人PCSK9 (B)下调LDLR的能力的影响。6F6. G10. 3是 6F6的亚克隆、7D4. 4系7D4的亚克隆、4A5. G3系4A5的亚克隆及5A10. B8系5A10的亚克隆。图2说明抗PCSK9拮抗剂单克隆抗体6F6. G10. 3、7D4. 4、4Α5· G3及5Α10. Β8、阴性对照抗体42Η7及PBS于活体外阻断重组生物素化人PCSK9(A)及鼠PCSK9(B)与固定化重组LDLR细胞外结构域结合的剂量反应。图3说明抗PCSK9拮抗剂单克隆抗体6F6. G10. 3、7D4. 4、4Α5· G3及5Α10. Β8于活体外中性PH的溶液中阻断重组生物素化人PCSK9 (30nm)与铕标记重组LDLR细胞外结构域(IOnm)结合的剂量反应。图4说明抗PCSK9抗体的比较性表位结合。图5说明抗PCSK9抗体与来自不同物种的血清PCSK9结合的蛋白印迹结果。图6说明抗PCSK9单克隆抗体7D4对小鼠血液中胆固醇水平的影响。图7说明㈧部分拮抗剂抗PCSK9多克隆抗体mAb CRN6对LDLR下调的影响及 (B)不影响小鼠胆固醇水平。图8说明在小鼠使用抗PCSK9拮抗剂抗体7D4所得到的胆固醇降低效果的时间进程。图9说明抗PCSK9拮抗剂单克隆抗体7D4在降低小鼠血清总胆固醇、HDL及LDL上的剂量依赖性。图10说明抗PCSK9拮抗剂抗体5A10在小鼠的胆固醇降低效果的剂量依赖性。图11说明抗PCSK9拮抗剂抗体(A)4A5及(B)6F6于小鼠的胆固醇降低效果的剂
量依赖性。图12说明抗PCSK9拮抗剂抗体对肝脏LDLR量的影响的蛋白印迹结果。图13说明抗PCSK9拮抗剂抗体4A5在LDLR-/-小鼠模型中缺乏效果。图14说明在小鼠多次施用抗PCSK9拮抗剂抗体对总血清胆固醇的效果相较于单一剂量具有延长的时间进程。图15说明在马来猴(cynomolgus monkey)模型中抗PCSK9拮抗剂抗体7D4对血脂参数的效果的时间进程。图16说明抗PCSK9拮抗剂抗体7D4对马来猴血清胆固醇水平的剂量及时间反应。图17说明抗PCSK9拮抗剂抗体4A5、5A10、6F6及7D4对马来猴血清胆固醇水平的比较。图18说明抗PCSK9拮抗剂抗体7D4影响喂食补充0. 胆固醇的33. 4%仟卡油脂饮食的马来猴的血浆胆固醇水平的时间进程。图19说明L1L3 (人源化抗PCSK9单克隆抗体)于Huh7细胞中下调LDLR的效果。图20说明L1L3人源化抗体、鼠前驱5A10及阴性对照抗体42H7于活体外阻断重组生物素化人PCSK9(A及B)及鼠PCSK9(C及D)与固定化重组LDLR细胞外结构域在pH 7. 5 (A及C)及pH 5. 3 (B及D)的结合的剂量反应。图21说明以10mg/kgLlL3对鼠治疗血清胆固醇的效果。图22说明施用5A10抗体或L1L3至马来猴的效果及测量与时间有关的血清 HDL(A)及血清LDL (B)的变化。图23A显示与L1L3抗体(黑色动画图示)结合的PCSK9 (淡灰色表面图标)的晶体结构。图2 显示与LDLR的EGF样结构域(黑色动画图标)结合的PCSK9 (淡灰色表面图标)的晶体结构(Kwon et al.，PNAS，105，1820-1825,2008)。图 23C 显示 PCSK9 的表面积图示及以深灰色表示的L1L3表位。图23D显示PCSK9的表面积图示及以深灰色表示的 LDLR EGF样结构域表位。图24A至G说明在亲和性成熟及优化的过程中在抗体5A10的⑶R所进行的取代以达到特定性质。与具有这些⑶R取代的抗体有关的PCSK9结合亦被表示。每个序列后面的数字是各序列的SEQ IDN0。
具体实施例方式本发明涉及拮抗细胞外PCSK9功能的抗体、肽及适体，所述功能包括PCSK9与LDLR 的相互作用。更具体地说，本发明涉及制备拮抗剂PCSK9抗体、肽及适体的方法，包含所述抗体、肽和/或适体的组合物，及使用所述抗体、肽和/或适体以作为药物的方法。所述拮抗剂PCSK9抗体及肽可被用于降低血液中LDL-胆固醇水平，且可被用于预防和/或治疗胆固醇及脂蛋白代谢异常，包括家族性高胆固醇血症、致动脉粥样化的异常血脂症、动脉粥样硬化症及更普遍地说的CVD。一般技术本发明的实施除非另外说明将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学及免疫学的常规技术，所述技术均属于本领域技术范围之内。这些技术在文献中完全说明，诸如MolecularCloning :A Laboratory Manual, second edition(Sambrook et al. ,1989)ColdSpring Harbor Press ；Oligonucleotide Synthesis(M. J. Gait, ed. , 1984) ；Methods in Molecular Biology, Humana Press ； Cell Biology :A LaboratoryNotebook (J.E.Cellis, ed. ,1998)Academic Press ； Animal Cell Culture(R. I. Freshney, ed. ,1987) ；Introduction to Cell and Tissue Culture(J. P. Matherand P. E. Roberts,1998)Plenum Press ；Cell and Tissue Culture LaboratoryProcedures(A. Doyle, J.B.Griffiths, and D. G. Newell, eds. ,1993-1998) J. Wiley and Sons ；Methods in Enzymology(Academic Press, Inc.) ；Handbook of Experimental Immunology(D. M. Weir and C. C. Blackwel1,eds. ) ；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J. M. Miller and M. P. Calos, eds. ,1987) ；Current Protocols in Molecular Biology(F. M. Ausubel etal., eds.,1987) ；PCR :The Polymerase Chain Reaction,(Mullis et al. ,eds. ,1994) ；Current Protocols in Immunology(J. E Coligan et al. , eds.,1991) ；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons,1999)； Immunobiology (C.A.Janeway and P.Travers,1997) ；Antibodies (P.Finch,1997)； Antibodies :a practical approach(D. Catty. , ed. , IRL Press,1988-1989) ；Monoclonal antibodies -.a practical approach (P. Shepherd andC. Dean, eds. , Oxford University Press,2000) ；Using antibodies :alaboratory manual(E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1999) ；The Antibodies(M. Zanetti and J. D. Capra, eds. , HarwoodAcademic Publishers,1995)。定义“抗体”是能通过至少一个抗原辨识位特异性结合标靶，诸如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等的免疫球蛋白分子，该抗原辨识位是位于所述免疫球蛋白分子的可变区。 文中所使用的该术语不仅包含完整的多克隆或单克隆抗体，但亦包含它们的片段(诸如 Fab,Fab'、F(ab' )2、Fv、单链(ScFv)及结构域抗体)及包含抗体部位的融合蛋白质及任何其他含有抗原辨识位的经修饰构型的免疫球蛋白分子。抗体包括任何类型的抗体，诸如 IgG, IgA或IgM(或彼的亚型)，且所述抗体不需要是任何特定类型。根据抗体的重链恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白可被分成不同类型。有五种主要的免疫球蛋白类型IgA、 IgD、IgE、IgG和IgM，其中数个类型可进一步被分成亚型(同种型)，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。对应不同类型的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别被称为α、δ、ε、 Y和μ。不同类型的免疫球蛋白的亚单元结构及三维构型系广为周知。文中所使用的“单克隆抗体”是指自基本上同源的抗体族群所获得的抗体，意即该个体抗体包含一致的族群除了少量存在的可能自然发生的突变以外。单克隆抗体具高度特异性，其针对单一抗原部位。另外，和通常包括针对不同决定位(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同的是，各单克隆抗体是针对抗原上的单一决定基。修饰语“单克隆” 表示抗体是自基本上同源族群的抗体所获得的特征，不应被视为需要藉由任何特定的方法以产生抗体。举例来说，本发明所使用的单克隆抗体可藉由最早由Kohler and Milstein, 1975，Nature 256 :495所描述的杂交瘤方法制备，或可藉由重组DNA方法诸如美国专利号 4，816，567所述者制备。该单克隆抗体亦可自例如利用McCafferty et al.，1990，Nature 348 :552-554所描述的技术所产生的噬菌体库分离。文中所使用的“人源化”抗体是指含有源自非人免疫球蛋白的最少序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或彼的片段(诸如Fv、Fab、Fab'、F(ab' )2或抗体的其他抗原结合子序列)的非人(例如鼠)抗体的形式。优选的是，人源化抗体是其中源自接受者的互补决定区(CDR)的残基被源自非人物种(捐赠者抗体)诸如具有所希望的特异性、亲和性及能力的小鼠、大鼠或兔的CDR的残基所取代的人免疫球蛋白(接受者抗体)。在一些实例中，人免疫球蛋白的Fv骨架区(FR)残基被对应的非人残基取代。另外，该人源化抗体可能包含未见于接受者抗体或导入CDR或骨架序列中的残基，所述残基被包括其中以进一步改善及优化抗体的表现。整体而言，所述人源化抗体将包含基本上所有的至少一个且通常二个可变结构域，其中所有或基本上所有的对应非人免疫球蛋白的CDR区者及所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白一致序列的那些区。所述人源化抗体亦将理想地包含至少部分的免疫球蛋白恒定区或结构域(Fe)，通常为人免疫球蛋白的该恒定区或结构域。优选的是具有如WO 99/58572所述经修饰的Fc区的抗体。其他形式的人源化抗体具有一个或多个相对于该原始抗体经改变的CDR类(CDR Li、CDRL2、CDR L3、CDR HI、CDR H2和/或CDR H3)，这些⑶R类亦被称为一个或多个“源自” 一个或多个来自该原始抗体的⑶R类的⑶R 类。文中所使用的“人抗体”是指具有氨基酸序列的抗体，该氨基酸序列对应可由人所产生和/或利用任何本领域技术人员所知或本文所揭示的制造人抗体的技术所制备的抗体的氨基酸序列。此定义的人抗体包括包含至少一个人重链多肽或至少一个人轻链多肽的抗体。一个实例是包含鼠轻链及人重链多肽的抗体。人抗体可利用本领域已知的多种技术制备。在一个实施方式中，该人抗体选自噬菌体库，其中该噬菌体库表现人抗体(Vaughan et al.,1996, Nature Biotechnology, 14 :309-314 ；Sheets et al. , 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)95 :6157-6162 ；Hoogenboom and Winter,1991, J. Mol. Biol.，227 :381 ； Marks et al.，1991，J. Mol. Biol.，222 :581)。人抗体亦可藉由免疫接种动物加以制备，该动物体内的内源性基因座(loci)已被基因转殖导入的人免疫球蛋白基因座所取代，例如内源性免疫球蛋白基因已被部分或完全不活化的鼠。此方法系于美国专利号5，M5，807、 5，545，806,5, 569，825,5, 625，126,5, 633，425 及 5，661，016 中描述。或者，该人抗体可藉由永存化产生针对标靶抗原的抗体的人B淋巴细胞加以制备(该B淋巴细胞可自个体收集或已在活体夕卜被免疫)°参见例如 Cole et al. Monoclonal Antibodies andCancer Therapy,Alan R. Liss,p. 77,1985 ；Boerner et al. , 1991, J. Immunol. , 147(1) :86-95及美国专利号 5，750，373。抗体的“可变区”是指单独或组合的抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区。如本领域所知，重链及轻链的可变区各由四个骨架区(FR)组成，该四个骨架区是由含有超可变区的三个互补决定区(⑶幻所连接。各链中的⑶R藉由FR紧密地拉靠在一起且与来自另一链中的CDR导致抗体的抗原结合位的形成。至少有二种技术用于决定CDR: (1)以跨种序列变异性为基础的方式(意即Kabat et al. ,Sequences ofProteins of Immunological Interest, (5th ed. ,1991, Naional Institutes ofHealth, Bethesda MD)) ； R (2) U 抗原-抗体复合物的结晶学试验为基础的方式(Al-lazikani et al,1997, J. Molec. Biol. 273 :927-948)。文中所使用的⑶R可指以任一种方式或二种方式的组合所定义的 CDR。本领域中所谓的抗体的“恒定区”是指单独或组合的抗体轻链的恒定区或抗体重链的恒定区。文中所使用的术语“PCSK9”是指保留至少部分的PCSK9活性的任何形式的PCSK9 及其变异体。除非不同地指明诸如特指人PCSK9，否则PCSK9包括所有哺乳动物物种的天然序列PCSK9，例如人、犬、猫、马及牛。一个示范性的人PCSK9系见于Uniprot登录号 Q8NBP7(SEQ ID NO 16)。文中所使用的“PCSK9拮抗剂”是指能抑制PCSK9生物活性和/或由PCSK9信号所介导的下游途径的抗体、肽或适体，该由PCSK9信号所介导的下游途径包括PCSK9所介导的 LDLR下调及PCSK9所介导的LDL血液清除减少。PCSK9拮抗剂抗体包含阻断、拮抗、抑制或降低(至任何程度包括显著地)PCSK9生物活性的抗体，所述PCSK9生物活性包括由PCSK9 信号所介导的下游途径，诸如LDLR相互作用和/或诱发对PCSK9的细胞反应。就本发明的目的而言，应清楚了解的是，术语“PCSK9拮抗剂抗体”包含PCSK9本身、PCSK9生物活性(包括但不限于其所介导的与LDLR的相互作用、下调LDLR及血液LDL清除减少的任何态样的能力)或该生物活性的结果藉以被基本上废止、降低或中和至任何有意义的程度的先前确认的所有术语、标题及功能状态及特征。在一些实施方式中，PCSK9拮抗剂抗体与PCSK9结合且防止与LDLR的相互作用。本发明提供PCSK9拮抗剂抗体的实例。文中所使用的“完全拮抗剂”是指有效浓度时可基本上完全阻断PCSK9可测量效应的拮抗剂。部分拮抗剂是指能部分阻断可测量效应的拮抗剂，但即使在最高浓度该拮抗剂亦非完全拮抗剂。基本上完全是指至少约80%，优选为至少约90%，更优选为至少约 95%，且最优选为至少约98%或99%的可测量效应被阻断。相关的“可测量效应”是于文中描述且包括在活体外Huh7细胞中所测定的PCSK9拮抗剂的LDLR下调、活体内降低血液中(或血浆中)总胆固醇水平及活体内降低血液中(或血浆中)LDL量。文中所使用的术语“临床上有意义”是指人血液中LDL-胆固醇水平至少降低15% 或鼠全血胆固醇降低至少15%。很清楚的是，血浆或血清测量值可作为血液量测量值的替代值。文中所使用的术语“PCSK9拮抗剂肽”或“PCSK9拮抗剂适体”包括任何常见的阻断、拮抗、抑制或降低(至任何程度包括显著地)PCSK9生物活性的肽或多肽或适体，所述 PCSK9生物活性包括由PCSK9信号所介导的下游途径，诸如LDLR相互作用和/或诱发对PCSK9的细胞反应。PCSK9拮抗剂肽类或多肽类包括包含LDLR及所述LDLR的可溶性部分的Fc融合，或对PCSK9具有较高亲和性的它们的突变。术语“多肽”、“寡肽”、“肽”及“蛋白质”在文中可交换使用以指称任何长度优选的是相对较短(例如10至100个氨基酸)的氨基酸链。该链可为线性或分支，其可包含经修饰的氨基酸和/或可被非氨基酸所中断。该术语亦包含已经天然或人为介入修饰的氨基酸链；例如双硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，诸如与标记成分共轭。该定义亦包括例如包含一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域中熟知的其他修饰的多肽。应了解的是，该多肽可以单链或结合的链存在。如本领域中所熟知的“多核苷酸”或“核酸”在文中可交换使用，是指任何长度的核苷酸的链，且包括DNA及RNA。该核苷酸可为脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基和/或它们的类似物，或任何可藉由DNA或RNA聚合酶被纳入链中的底物。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸及它们的类似物。若有的话，对核苷酸结构的修饰可在该链组合之前或之后进行。核苷酸的序列可被非核苷酸成分中断。多核苷酸在聚合之后可进一步被修饰，诸如与标记成分共轭。其它类型的修饰包括例如“帽端(cap)”、 以类似物取代一个或多个天然发生的核苷酸、核苷酸间修饰诸如例如该些具有不带电荷的键接(linkage)(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酸酰胺化物、胺甲酸酯等)及带电荷的键接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)者、含有悬吊基团者，诸如例如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚赖氨酸等)、具有嵌入剂(intercalator)者(例如吖啶、补骨脂素等)、具有螯合剂者(例如金属、放射线活性金属、硼、氧化性金属等)、含有烷基化剂者、 具有经修饰连结者(例如α反构核酸等)以及未经修饰的多核苷酸形式。另外，任何通常存在于糖类中的羟基团可能被例如膦酸基、磷酸基所取代、被标准保护基保护或被活化以制备与额外核苷酸的其他键接，或可能被共轭至固体支持物。该5'及3'端OH可被磷酸化或被胺类或自1至20个碳原子的有机封端基团取代。其他羟基亦可被衍生成为标准保护基团。多核苷酸亦可包含本领域通常已知的类似形式的核糖或脱氧核糖糖类，包括例如 2' -0-甲基-核糖、‘-0-烯丙基核糖、2'-氟代-核糖或2'-迭氮基-核糖、碳环糖类似物、α或β反构糖类、差向异构体糖类诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖糖类、呋喃糖糖类、景天酮庚糖、非环类似物及无碱基核苷类似物诸如甲基核糖苷。一个或多个磷酸二酯连结可被可选择的连接基团取代。这些可选择的连接基团包括但不限于其中磷酸盐被 P (0) S ( “硫代盐”)、P ⑶ S ( “二硫代盐”)、(0) NR2 ( “酰胺化物”)、P (0) R、P (0) OR'、⑶或 CH2( "formacetal")取代的实施方式，其中各R或R'系独立地H或经取代或未经取代的烷基(1至20个碳)，该烷基可选择的含有醚(-0-)连结、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基。在多核苷酸中的所有键接不需要完全相同。前面的叙述适用于文中所指称的所有多核苷酸，包括RNA及DNA。包含核酸或蛋白质序列的“PCSK9拮抗剂适体”是选自例如大量的随机序列且与 PCSK9特异性结合。所述适体的核酸是双股DNA或单股RNA。核酸适体可包括经修饰的碱基或官能基团，包括但不限于2'-氟核苷酸及2' -0-甲基核苷酸。适体可包括亲水性聚合物，例如聚乙二醇。适体可藉由本领域已知的方法制造且可藉由例行性修饰实施例所揭示的方法选择PCSK9拮抗剂活性。如文中所使用，当以实施例2于文中所揭示的方法测量的平衡解离常数等于或小于20nM，优选为小于约6nM，更优选为小于约InM，最优选为小于约0. 2nM时，抗体、肽或适体与PCSK9 “相互作用”。表位与抗体或多肽“优先性结合”或“特异性结合”(在文中可交换使用)的术语系本领域广为周知，用于决定该特异性或优先性结合的方法亦为本领域所广为周知。若分子与特定细胞或物质的相互作用或结合相较于彼与其他细胞或物质的这些作用更为频繁、更为快速、作用期间更长和/或亲和性(affinity)更高时，该分子被称为展现“特异性结合” 或“优先性结合”。若抗体以相较于彼与其他物质结合时更高的亲和性、亲合力(avidity)、 更快速和/或更长期间地与标靶结合时，所述抗体与标靶“特异性结合”或“优先性结合”。 举例来说，与PCSK9表位特异性或优先性结合的抗体系指相较于彼与其他PCSK9表位或非 PCSK9表位结合时以更高的亲和性、亲合力、更快速和/或更长期间地与此表位结合的抗体。由阅读此定义亦可了解，例如与第一标靶特异性或优先性结合的抗体(或基团或表位) 可与或不可与第二标靶特异性或优先性地结合。因此，“特异性结合”或“优先性结合”不一定需要(虽然其可包括)排除性结合。一般来说但不是一定，所谓的结合系指优先性结合。文中所使用的“基本上纯的”是指其为至少50%纯的(也就是不含污染物)，更优选的是至少90%纯的，更优选的是至少95%纯的，甚至更优选的是至少98%纯的，且最更优选的是至少99%纯的物质。“宿主细胞”包括可为或已是用于导入多核苷酸插入物的载体的接受者的个别细胞或细胞培养。宿主细胞包括单一宿主细胞的后代，且因为天然、意外或蓄意突变使该后代 (在形态学或基因DNA互补性上)不一定与原始亲代细胞完全相同。宿主细胞包括以本发明的多核苷酸在活体内转染的细胞。如本领域所知，术语“Fe区”是用于定义免疫球蛋白重链的C末端区。该“Fe区” 可为天然序列Fc区或变异Fc区。虽然免疫球蛋白重链的Fc区的边界可能不同，人IgG重链Fc区通常被定义为从位置的氨基酸残基或从ftx)230延伸至彼的羧基末端。Fc 区中的残基编号是如卡巴(Kabat)中的EU指数。Kabat et al. ,Sequences of Proteinsof Immunological Interest,5th Ed. Public Health Service, National Institutesof Health, Bethesda, Md.，1991.免疫球蛋白的Fc区通常包含二个恒定结构域CH2及CH3。本领域所使用的“Fe受体”及“FcR”描述与抗体的Fc区结合的受体。优选的FcR 是天然序列的人FcR。另外，优选的FcR是与IgG抗体结合的受体(γ受体)且包括FcyRI、 Fc γ RII及Fc γ RIII亚型受体，包括这些受体的对偶变异体及可选择的剪接形式。FcyRII 受体包括Fc γ RIIA( “活化受体”)及Fc γ RIIB ( “抑制受体”)，这些受体具有类似的氨基酸序列，这些序列主要在它们的细胞质结构域有所不同。FcR系于Ravetch and Kinet,1991, Ann. Rev. Immunol. ,9 :457-92 ；Capel et al. , 1994, Immunomethods, 4 :25-34及 de Haas et al.，1995，J. Lab. Clin. Med.，126 :330-41 中综述。“FcR” 亦包括新生儿受体 Fcfoi，所述受体负责转运母体 IgG 至胎儿(Guyer et al.，1976，J. Immunol.，117 :587 ；and Kim etal.， 1994，J. Immunol. ,24 :249)。文中关于抗体所使用的术语“竞争”是指第一抗体或其抗原结合部位以充分类似于第二抗体或其抗原结合部位的结合的方式与表位结合，使得所述第二抗体存在时所述第一抗体与其同源表位的结合的结果相较于所述第二抗体不存在时所述第一抗体的结合是可检测地降低。或者，该情况可为但不一定是当所述第一抗体存在时，所述第二抗体与其表位的结合亦可检测地降低。也就是说，第一抗体可抑制第二抗体与其表位的结合，但第二抗体不抑制所述第一抗体与其相应表位的结合。然而，当各抗体不论以相同、较高或较低程度可检测地抑制另一抗体与其同源表位或配位体结合时，所述抗体被称为彼此“交叉竞争”与其相应表位的结合。本发明包含竞争及交叉竞争抗体。不论所述竞争或交叉竞争所藉以发生的机制为何(例如立体阻碍、形态变化、或与共同表位或彼的部分结合)，本领域技术人员将了解根据文中所提供的教示，该竞争和/或交叉竞争抗体包含且可用于文中所揭示的方法中。抗体具有与其它(第二)表位或与LDLR的EGF样结构域相互作用的PCSK9表面 “重迭”的表位，是指分享就相互作用的PCSK9残基而言的空间。为了计算重迭的百分比， 举例来说，所述请求保护的抗体的PCSK9表位和与LDLR的EGF样结构域相互作用的PCSK9 表面的重迭百分比，意即当与LDLR形成复合物时被埋入的PCSK9的表面积系以每残基为基础计算。所述被埋入的面积亦根据PCSK9:抗体复合物中的这些残基计算。为了避免超过 100%可能的重迭，在PCSK9 抗体复合物中相较于LDLR :PCSK9复合物具有更高的埋入表面积的残基表面积从LDLR:PCSK9复合物(100%)开始设定数值。面积重迭百分比系藉由加和所有LDLR :PCSK9相互作用的残基加以计算且经相互作用面积的加权。“功能性Fc区”具有天然序列Fc区的至少一个效应物功能。示范性“效应物功能” 包括Clq结合、补体依赖性细胞毒性、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导性细胞毒性、吞噬作用、下调细胞表面受体(例如B细胞受体)等。所述等效应物功能通常需要Fc区与结合结构域(例如抗体可变结构域)组合且可利用本领域已知的用于评估所述抗体效应物功能的各种测定进行评定。“天然序列Fc区”包含与天然发现的Fc区的氨基酸序列完全相同的氨基酸序列。 “变异Fc区”包含与天然序列Fc区有至少一个氨基酸修饰的差异的氨基酸序列，但仍保留该天然序列Fc区的至少一个效应物功能。优选的是，该变异Fc区相较于天然序列Fc区或亲代多肽的Fc区具有至少一个氨基酸取代，例如自约1个至约10个氨基酸取代，且优选的是在天然序列Fc区或亲代多肽的Fc区的自约1个至约5个氨基酸取代。文中的变异Fc 区将优选地具有与天然序列Fc区和/或与亲代多肽的Fc区至少约80%的序列一致性，最优选的是具有与之至少约90%的序列一致性，更优选的是具有与彼等至少约95%、至少约 96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%的序列一致性。文中所使用的“治疗”是指得到有益或所欲临床结果的方法。就本发明的目的而言，有益或所欲的临床结果包括但不限于下列一或多项增进LDL清除及降低异常胆固醇和/或脂蛋白量的发生率或改善异常胆固醇和/或脂蛋白量，该异常胆固醇和/或脂蛋白量系因代谢和/或饮食失调所致或包括家族性高胆固醇血症、致动脉粥样化的异常血脂症、动脉粥样硬化症及更普遍地说的心血管疾病(CVD)。“降低发生率”是指任何严重性的降低(其可包括降低对通常用于治疗该状况的其他药物和/或治疗的需要和/或量(例如暴露))。如本领域技术人员所了解的，个体就他们对治疗的反应而言可能不同，因此举例来说，“降低发生率的方法”显示根据合理的期待施用PCSK9拮抗剂抗体、肽或适体可能造成该发生率在该特定个体降低而施用。“改善”是指相较于不施用PCSK9拮抗剂抗体、肽或适体时减少或改善一或多种症状。“改善”亦包括缩短或减少症状的期间。
文中所使用的药物、化合物或药物组合物的“有效剂量”或“有效量”是指足以影响任何一种或多种有益或所欲结果的量。就预防性用途而言，有益或所欲结果包括消除或减轻风险、降低严重性或延迟该疾病的开始，包括该疾病的生化学、组织学和/或行为学症状，其并发症及在疾病发展期间所表现的中间病理表现型。就治疗用途而言，有益或所欲的结果包括诸如减少高胆固醇血症或异常血脂症、动脉粥样硬化症、CVD或冠状动脉心脏病的一或多种症状、降低治疗该疾病所需的其他药物的剂量、增进其他药物的效果和/或延缓病患的疾病进展的临床结果。有效剂量可分一或多次施用。就本发明的目的而言，药物、化合物或药物组合物的有效剂量系足以直接或间接完成预防性或治疗性治疗的量。如临床意义上所了解的，药物、化合物或药物组合物的有效剂量可能与或不与另一药物、化合物或药物组合物组合达到。因此，“有效剂量”可能被认为是施用一或多种治疗剂的情况下，且单一剂可被认为是给予有效量若与一或多种其他剂组合时可能或系经达成所欲的结果。“个体”或“受试对象”是哺乳动物，更优选为人。哺乳动物亦包括但不限于农场动物、运动动物、宠物、灵长动物、马、犬、猫、小鼠及大鼠。文中所使用的“载体”是指建构物，其能在宿主细胞中传送且优选的是表现感兴趣的一个或多个基因或序列。载体的实例包括但不限于病毒性载体、裸DNA或RNA表达载体、 质体、黏质体或噬菌体载体、与阳离子缩合剂有关的DNA或RNA表达载体、包封于脂质体中的DNA或RNA表达载体及特定真核细胞诸如生产细胞。文中所使用的“表达控制序列”是指导核酸转录的核酸序列。表达控制序列可为启动子，诸如持续性或诱导性启动子或促进子。表达控制序列可操作地与所欲转录的核酸序列连接。文中所使用的“可药用载剂」或“可药用赋形剂”包括任何当与活性成分组合时能使该成分保留生物活性且不与该受试对象的免疫系统反应的任何物质。实例包括但不限于任何标准医药载剂诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳化液诸如油/水乳化液及各种类型的润湿剂。优选的用于喷雾或肠胃外施用的稀释剂是磷酸盐缓冲盐水(PBQ或生理(0.9%) 盐水。包含此类载剂的组合物由众所周知的常规方法调制(参见例如Remington' s Pharmaceutical Sciences, 18th edition,A. Gennaro, ed. , Mack Publishing Co. ,Easton, PA,1990 ；and Remington, The Science andPractice of Pharmacy,20th Ed. , Mack Publishing,2000)。文中所使用的术语“K。n”是指抗体与抗原的结合速率常数。具体地说，速率常数 (Kon及K。ff)与平衡解离常数是利用Fab抗体片段(意即单价)及PCSK9测量。文中所使用的术语“K。ff”是指抗体自抗体/抗原复合物解离的速率常数。文中所使用的术语“KD”是指抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。A.用于预防或治疗与高胆固醇血症有关的异常的方法在一方面中，本发明提供一种用于治疗或预防个体的高胆固醇血症，和/或异常血脂症、动脉粥样硬化症、CVD或冠状动脉心脏病的至少一种症状的方法，该方法包含对该个体施用有效量的拮抗循环PCSK9的PCSK9拮抗剂抗体或肽或适体。在另一方面中，本发明提供有效量的拮抗循环PCSK9的PCSK9拮抗剂抗体、肽或适体以用于治疗或预防个体的高胆固醇血症，和/或异常血脂症、动脉粥样硬化症、CVD或冠状动脉心脏病的至少一种症状。本发明另提供有效量的拮抗细胞外或循环PCSK9的PCSK9拮抗剂抗体、肽或适体于制造治疗或预防个体的高胆固醇血症，和/或异常血脂症、动脉粥样硬化症、CVD或冠状动脉心脏病的至少一种症状上的药物的用途。有利的是，治疗性施用所述抗体、肽或适体导致较低的血液中胆固醇和/或较低的血液中LDL。优选的是，血液中胆固醇和/或血液中LDL相较于施用之前至少降低约10% 或15%。更优选的是，血液中胆固醇和/或血液中LDL相较于施用所述抗体之前至少降低约20%。甚至更优选的是，血液中胆固醇和/或血液中LDL相较于施用所述抗体之前至少降低30%。有利的是，血液中胆固醇和/或血液中LDL相较于施用所述抗体之前至少降低40%。更为有利的是，血液中胆固醇和/或血液中LDL相较于施用所述抗体之前至少降低50%。非常优选的是，血液中胆固醇和/或血液中LDL相较于施用所述抗体之前至少降低60%。最优选的是，血液中胆固醇和/或血液中LDL相较于施用所述抗体之前至少降低 70%。就文中所描述的所有方法而言，提及PCSK9拮抗剂抗体、肽及适体亦包括包含一或多种额外剂类的组合物。这些组合物可能进一步包含适当的赋形剂，诸如可药用赋形剂包括本领域众所周知的缓冲剂。本发明可被单独或与其他常规的治疗方法组合使用。所述PCSK9拮抗剂抗体、肽或适体可经由任何适当的途径对个体施用。对本领域技术人员显而易见的是，文中所描述的实例不应意图限制而是说明可取得的技术。因此，在一些实施方式中，所述PCSK9拮抗剂抗体、肽或适体系根据已知方法对个体施用，诸如静脉内施用例如快速浓注或在一段时间内连续输注、肌肉内、腹腔内、脑脊髓腔内、经皮、皮下、 关节内、舌下、滑膜内、经吹气、鞘内、经口、吸入或局部途径。施用可为系统性例如静脉内施用或局部性。市售的用于液体制剂的喷雾器包括喷射喷雾器及超音波喷雾器可被用于施用。液体制剂可经直接喷雾施用，冷冻干燥的粉末在复水重建后可经喷雾施用。或者，PCSK9 拮抗剂抗体、肽或适体可利用氟碳制剂及定量喷雾吸入器被喷雾化或以经冷冻干燥及磨细粉末被吸入。在一个实施方式中，PCSK9拮抗剂抗体、肽或适体经位置特异性或标靶局部递送技术施用。位置特异性或标靶局部递送技术的实例包括各种PCSK9拮抗剂抗体、肽或适体的植入式贮积来源或局部递送导管，诸如输注导管、留置导管、或针头导管、合成性移植物、外膜包覆、分流器及支架或其他植入式装置、位置特异性载剂、直接注射或直接施用。参见例如PCT公开号WO 00/53211及美国专利号5，981，568。PCSK9拮抗剂抗体、肽或适体的各种制剂可被用于施用。在一些实施方式中，所述PCSK9拮抗剂抗体、肽或适体可被直接施用。在一些实施方式中，PCSK9拮抗剂抗体、肽或适体与可药用赋形剂可制成各种制剂。可药用赋形剂系为本领域所知，且有助于施用药理有效物质的相对惰性物质。举例来说，赋形剂可给予外形或稠度，或作为稀释剂。适当的赋形剂包括但不限于稳定剂、润湿及乳化剂、用于改变渗透性的盐类、包封剂、缓冲剂及皮肤渗透增进剂。用于非经肠及经肠药物递送的赋形剂以及制剂系阐明于RemingtonJhe Science andPractice of Pharmacy,20th Ed.，Mack Publishing(2000)。这些试剂类可与可药用载剂诸如盐水、林格氏液、葡萄糖溶液及该类似物组合。该特定的投药方案意即剂量、时间及重复性将依特定个体及该个体的医学史而定。如文中所述，PCSK9抗体亦可经吸入施用。一般来说，在施用PCSK9抗体时，初始候选剂量可为约ang/kg。就本发明的目的而言，典型的每日剂量可根据上述因子介于约3 μ g/kg M 30 μ g/kg 至 300 μ g/kg 至 3mg/kg、至 30mg/kg 至 100mg/kg 或更高的任何范围内。举例来说，可使用约lmg/kg、约2. 5mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg及约25mg/kg的剂量。 视状况而定重复施用数天或更久时，持续该治疗直到所欲的症状抑制发生或直到达成足够的治疗量，例如降低血液中LDL量。示范性投药方案包含施用约ang/kg的PCSK9抗体的初始剂量，随后约lmg/kg的每周维持剂量，或随后每二周约lmg/kg的维持剂量。然而，其他投药方案可根据医师所希望达成的药物动力衰减模式而使用。举例来说，在一些实施方式中，每周投药一至四次可被考虑。在其他实施方式中，每个月投药一次或每二个月或每三个月投药一次可被考虑。此治疗的进展可藉由常规的技术及测定被轻易地监测。该投药方案 (包括所使用的PCSK9拮抗剂)可随时间而异。就本发明的目的而言，PCSK9拮抗剂抗体、肽或适体的适当剂量将依所采用的 PCSK9拮抗剂抗体、肽或适体(或彼等的组合物)、所欲治疗的症状的类型及严重性、该剂是以预防性或治疗性目的施用、先前治疗、病患的临床病史及对该剂的反应、该病患的血液中 PCSK9量、该病患合成及清除PCSK9的速率、病患清除该施用的剂的速率及主治医师的考虑而定。通常医师将施用PCSK9拮抗剂抗体、肽或适体直到达到可完成所欲结果的剂量。剂量和/或频率可依治疗疗程而异。经验性考虑诸如半衰期通常将影响该剂量的决定。举例来说，可相容于人免疫系统的抗体诸如人源化抗体或全人抗体可被用以延长所述抗体的半衰期及防止所述抗体被该宿主的免疫系统攻击。投药频率可根据治疗的疗程加以决定及调整，通常但不一定根据症状例如高胆固醇血症的治疗和/或抑制和/或改善和/或延缓。或者，PCSK9拮抗剂抗体的持续性连续释放制剂可为适当。各种用于达成持续释放的制剂及装置系为本领域所知。在一个实施方式中，拮抗剂抗体、肽或适体的剂量在已给予一或多次拮抗剂抗体、 肽或适体投药的个体中可凭经验决定。个体系给予增量剂量的PCSK9拮抗剂抗体、肽或适体。为了评估疗效，可追踪疾病的指标。根据本发明的方法施用PCSK9拮抗剂抗体、肽或适体可依例如该接受者的生理状况、该投药的目的系治疗性或预防性及本领域技术人员所知的其他因素而为连续性或间歇性。PCSK9拮抗剂抗体、肽或适体可以实质上连续一段预先决定的时间或以一系列间隔剂量施用。在一些实施方式中，可能存在超过一种拮抗剂抗体、肽或适体。至少一种、至少二种、至少三种、至少四种、至少五种不同或更多种拮抗剂抗体和/或肽可以存在。一般来说， 这些PCSK9拮抗剂抗体或肽可能具有不会互相不良影响的互补活性。PCSK9拮抗剂抗体、肽或适体亦可与其他PCSK9拮抗剂或PCSK9受体拮抗剂组合使用。举例来说，可使用一或多种下列PCSK9拮抗剂以PCSK9为标靶的反义分子(包括以编码PCSK9的核酸为标靶的反义分子)、PCSK9抑制化合物及PCSK9结构类似物。PCSK9拮抗剂抗体、肽或适体亦可与其他用于增进和/或补充这些剂类的有效性的剂类组合使用。可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量及浓度下对接受者不具毒性，可包含缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐及其他有机酸；盐诸如氯化钠；抗氧化剂包括抗坏血酸及甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八基二甲基苄基氯化铵、六甲氯铵、氯化苯甲烃铵、氯化苄乙氧铵、酚醇、丁醇或苄醇、烷基对羟苯甲酸酯类诸如对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇及间甲酚)、低分子量(小于约10个残基)多肽、蛋白质诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白、亲水性聚合物诸如聚乙烯基吡咯烷酮、氨基酸诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰氨酸、组氨酸、精氨酸或赖氨酸、单醣、双醣及其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精、螯合剂诸如EDTA、糖类诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇、盐形成反离子诸如钠、金属复合物(例如锌蛋白质复合物)和/或非离子性界面活性剂诸如TWEEN 、 PLUR0NICS 或聚乙二醇(PEG)。含有PCSK9拮抗剂抗体、肽或适体的脂质体以本领域已知的方法制备，诸如 Epstein, et al. ，1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 3688 ；Hwang, et al. ，1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 :4030及美国专利号4，485，045及4，544，545中所述。增进循环时间的脂质体披露于美国专利号5，013，556。特别有用的脂质体可藉由逆相蒸发方法以包含磷脂酰胆碱、胆固醇及PEG衍生性磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物产生。脂质体被挤压通过定义孔径大小的滤网以产生具有所欲直径的脂质体。该活性成分亦可被包封于藉由例如凝聚技术或藉由界面聚合所制备的微胶囊中例如分别于羟甲基纤维素或明胶微胶囊及聚甲基丙烯酸甲酯微胶囊中、于胶体药物递送系统中(例如脂质体、白蛋白微球、微乳化液、奈米微粒及奈米微囊)或于巨乳化液中。技术系于 Remington，The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed., MackPublishing(2000)。持续释放性制剂可被制备。持续释放性制剂的适当实例包括含有所述抗体的固相疏水性聚合物的半透性基质，该基质为成型物件的形式，例如膜或微囊。持续释放性基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚乙烯醇)、聚交酯(美国专利号3，773，919)、L-谷氨酸及7乙基-L-谷氨酸盐的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOT (由乳酸-乙醇酸共聚物及柳菩林 (leuprolide acetate)所组成的注射型微球)、蔗糖乙酸异丁酸酯及聚_D_ (-) _3_羟丁酸。欲用于活体内施用的制剂必须是无菌的。这可轻易地藉由例如经由无菌过滤膜过滤达成。治疗性PCSK9拮抗剂抗体、肽或适体组合物通常被置放于具有无菌出入孔的容器中，例如具有可被皮下注射针穿刺的塞子的静脉溶液袋或小瓶。适当的乳化液可利用市售的脂肪乳化液制备，诸如htralipid 、Liposyn 、 InfonutrolT\Lipofundin 及Lipiphysan 。该活性成分可被溶解于预先混合的乳化液组合物中或其可被溶解于油中(例如大豆油、红花子油、棉花子油、芝麻油、玉米油或杏仁油) 而当与磷脂(例如卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)及水混合时形成乳化液。将了解的是可添加其他成分例如甘油或葡萄糖以调整该乳化液的张力。适当的乳化液通常将含有最高20%例如介于5至20%的油。该脂肪乳化物可包含介于0. 1至LOym特别是0. 1至 0. 5 μ m的脂肪液滴，且具有介于5. 5至8. 0范围内的pH。该乳化液组合物可为藉由混合PCSK9拮抗剂抗体、肽或适体与htralipid 或其成分(大豆油、卵磷脂、甘油及水)所制备的那些。用于吸入或吹入的组合物包括于可药用含水或有机溶剂或彼等的混合物中的溶液及悬浮液和粉末。该流体或固体的组合物可能包含如前述的适当的可药用赋形剂。在一些实施方式中，该组合物以经口或经鼻呼吸途径施用以供局部或系统性效应。在优选的无菌可药用溶剂中的组合物可藉由气体被喷雾化。经雾化的溶液可从雾化装置被直接吸入或该雾化装置可与面罩、帐篷或间歇性正压呼吸器连接。溶液、悬浮液或粉末组合物可自以适当方式递送该制剂的装置优选经口或经鼻施用。B.PCSK9 拮抗剂类本发明的方法使用PCSK9拮抗剂抗体、肽或适体，这些抗体、肽或适体指任何阻断、抑制或降低(包括显著地降低)PCSK9生物活性的肽或核酸分子，PCSK9生物活性包括由PCSK9信号所介导的下游途径，诸如诱发对PCSK9的细胞反应。PCSK9拮抗剂抗体、肽或适体应具备下列特征的任一或多项(a)与PCSK9结合、 (b)阻断PCSK9与LDLR的相互作用、(c)阻断或减少PCSK9所介导的下调LDLR、(d)抑制 PCSK9所介导的LDL血液清除减少、(e)增加经培养的肝细胞在培养中清除LDL、(f)增加活体内肝脏所进行的血液LDL清除、(g)使对他汀(statins)敏感化及(h)阻断PCSK9与其他仍待辨识的因子的相互作用。就本发明的目的而言，所述抗体、肽或适体优选地以抑制PCSK9信号功能及LDLR 相互作用的方式与PCSK9反应。在一些实施方式中，所述PCSK9拮抗剂抗体特异性地辨识灵长动物的PCSK9。在一些实施方式中，所述PCSK9拮抗剂抗体与灵长动物及啮齿动物的 PCSK9结合。本发明所使用的抗体可包含单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段(例如Fab、 Fab'、F(ab' )2、Fv、Fc等)、嵌合抗体、双特异性抗体、异源共轭抗体、单链(ScFv)、及其突变、包含抗体部位的融合蛋白质(例如结构域抗体)、人抗体、人源化抗体及任何其他含有所需特异性的抗原辨识位的经修饰构型的免疫球蛋白分子，包括抗体的糖基化变异体、抗体的氨基酸序列变异体及经共价修饰的抗体。所述抗体可为小鼠、大鼠、人或任何其他来源 (包括嵌合或人源化抗体)。在一些实施方式中，所述PCSK9拮抗剂抗体是单克隆抗体。所述PCSK9拮抗剂抗体亦可为人源化抗体。在其他实施方式中，所述抗体系人抗体。在一些实施方式中，所述抗体包含经修饰的恒定区，诸如免疫惰性的恒定区，意即引发免疫反应的能力降低。在一些实施方式中，该恒定区如Eur. J. Immunol. ,1999,29 2613-2624 ；PCT公开号W099/58572和/或英国专利申请号9809951. 8中所述修饰。所述 Fc可为人Ig(i2或人IgG4。所述Fc可为含有突变A330P331至S330S331 (IgG2J的人IgG2, 其中所述氨基酸残基参照野生型IgG2序列编号。Eur. J. Immunol. ,1999,29 2613-26240 在一些实施方式中，所述抗体包含IgQ的恒定区，所述恒定区含有下列突变(Armour et al. ,2003,Molecular Immunology 40 585-593) :E233F234L235 至 P233V234A235 (IgG4Ac)， 其中该编号参照野生型IgG4。在另一个实施方式中，所述Fc是人IgG4 E233F234L235至 P233V234A235及缺失G236 (IgG4Ab)。在另一个实施方式中，所述Fc是任何含有绞链稳定突变 S228 至 P228 的人 IgG4Fc (IgG4, IgG4^ 或 IgG4^) (Aalberse et al.，2002，Immunology 105，9-19)。在另一个实施方式中，所述Fc可以是非糖基化Fe。在一些实施方式中，所述恒定区藉由使该寡醣连接残基(诸如AsM97)突变和/ 或使所述恒定区中为糖基化辨识序列部分的残基侧翼化而被非糖基化。在一些实施方式中，所述恒定区的N连接糖基化经酶性非糖基化。所述恒定区的N连接糖基化可经酶性非糖基化或藉由在糖基化缺损宿主细胞中表现而被非糖基化。PCSK9拮抗剂抗体与PCSK9 (诸如人PCSK9)的结合亲和性(Kd)可为约0. 002至约 200nM。在一些实施方式中，所述结合亲和性是约200nM、约ΙΟΟηΜ、约50nM、约10nM、约InM、约 500pM、约 ΙΟΟρΜ、约 60pM、约 50pM、约 20pM、约 15pM、约 ΙΟρΜ、约 5pM 或约 2pM 中的任一。 在一些实施方式中，所述结合亲和性是小于约250nM、约200nM、约ΙΟΟηΜ、约50nM、约ΙΟηΜ、 约 InM、约 500pM、约 ΙΟΟρΜ、约 50pM、约 20pM、约 ΙΟρΜ、约 5pM 或约 2pM 中的任一。决定抗体与PCSK9的结合亲和性的一个方法是测量抗体的单功能Fab片段的结合亲和性。要得到单功能Fab片段，可利用木瓜酶剪切抗体(例如IgG)或经重组表现。抗体的PCSK9Fab片段的亲和性可藉由装设预先固定链霉抗生物素蛋白感应芯片(SA)的表面等离子体共振(BiaCOre3000TM表面等离子体共振(SPR)系统，纽泽西州皮斯卡塔维Biacore， INC)使用 HBS-EP 电泳缓冲液(0. OlM HEPES, pH 7. 4,0. 15NaCl,3mM EDTA，0. 005%体积 / 体积界面活性剂P20)决定。生物素化的人PCSK9(或任何其他PCSK9)可经HBS-EP缓冲液稀释至浓度低于0. 5 μ g/ml，并利用不同的接触时间注射通过个别芯片槽以达到用于详细动力学试验的50至200反应单位(RU)抑或用于筛选测定的800至1000RU的二种抗原密度范围。再生试验已显示含25mMNa0H的25%体积/体积乙醇有效地移除该结合的Fab同时保持芯片上的PCSK9活性以供超过200次注射。一般来说，经纯化的Fab样本的连续稀释液(0. 1至10倍预估Kd的横跨浓度)以100 μ 1/min注射1分钟，且允许最高2小时的解离时间。所述Fab蛋白的浓度藉由使用已知浓度(以氨基酸分析测定)的Fab作为标准物的ELISA和/或SDS-PAGE电泳决定。使用BIAevaluation软件将数据完整带入1 1 兰缪尔(Langmuir)结合模型(Kar Is son, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. , 1994. MethodsEnzymology 6.99-110)以同时得到动力学结合速率(k。n)及解离速率(k。ff)。平衡解离常数(Kd)数值以k。ff/k。n计算。此程序适合用于决定抗体与任何PCSK9的结合亲和性， 包括人PCSK9、其他哺乳动物的PCSK9 (诸如小鼠PCSK9、大鼠PCSK9、灵长动物PCSK9)以及不同种型式的PCSK9(诸如α及β型)。抗体的结合亲和性通常在25°C测量，但亦可在 37°C测量。PCSK9拮抗剂抗体可藉由任何本领域已知的方法包括实施例1中所提供的方法制备。免疫接种宿主动物的途径及时程通常与已建立及常规的抗体刺激及产生技术一致，如文中进一步描述。用于产生人及小鼠抗体的通用技术为本领域所知和/或于文中描述。目前制备抗体的优选方法包含如文中所揭示的免疫接种？〔51(9_基因敲除(PCSK9-/-)动物。应考虑的是，任何哺乳动物对象包括人或源自该动物的抗体产生细胞可经操作以作为产生哺乳动物(包括人)杂交瘤细胞系的基础。一般来说，所述宿主细胞是经腹腔内、 肌肉内、经口、皮下、脚掌内和/或皮内接种一定量的免疫原，包括如文中所述。杂交瘤可自淋巴细胞及永存化的骨髓瘤细胞制备，使用Kohler，B. and Milstein, C.，1975，Nature 256 :495-497 的常规体细胞杂交技术或由 Buck, D. W.，et al.，1982，In Vitro, 18 :377-381所修饰的技术。可取得的骨髓瘤细胞包括但不限于)(63-Ag8. 653及那些来自美国加州圣地亚哥沙克研究所细胞分布中心(Salk Institute Cell Distribution Center)的细胞可被用于杂交。一般来说，该技术涉及使用促融剂诸如聚乙二醇或藉由本领域技术人员众所周知的电方法使骨髓瘤细胞与淋巴样细胞融合。在融合后，将这些细胞自融合培养基中分离并于选择性生长培养基(诸如次黄嘌呤-胺喋呤-胸腺核苷(HAT)培养基)中生长以除去未杂交的亲代细胞。任何文中所描述的培养基不论有无补充血清皆可被用于培养分泌单克隆抗体的杂交瘤。在细胞融合技术的另一替代技术中，EBV永存化B细胞可被用于产生本发明的PCSK9单克隆抗体。若需要的话这些杂交瘤经扩展及次克隆，上清液藉由常规的免疫测定方法(例如放射免疫测定法、酶免疫测定法或荧光免疫测定法)检测抗免疫原的活性。可被用来作为抗体来源的杂交瘤包含所有衍生物、产生对PCSK9具特异性的单克隆抗体或彼的部分的亲代杂交瘤的后代细胞。产生这些抗体的杂交瘤可利用已知方法在活体外或活体内生长。所述单克隆抗体可藉由常规的免疫球蛋白纯化方法自培养基或体液中分离，诸如硫酸铵沉淀法、胶体电泳法、透析法、色层分析法及需要时，超过滤法。如果存在非所欲的活性时，可藉由例如使该制剂通过由免疫原连接固相所组成的吸附剂及使所希望的抗体自该免疫原溶析或松脱以移除。以和蛋白质共轭的人PCSK9或含有该标靶氨基酸序列的片段免疫接种宿主动物可产生抗体族群(例如单克隆抗体)，所述蛋白质对所希望的免疫接种的物种具致免疫性，例如钥孔状帽贝血蓝素、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂，该共轭是利用双功能或衍生剂例如顺丁烯二亚胺基苯甲酰基磺酸基琥珀酰亚胺基酯(经由半胱氨酸残基共轭)、N-羟琥珀二酰亚胺(经由赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酐、SOCl2或R1N = C = NR(其中R和R1是不同的烷基基团)。需要的话，可对感兴趣的PCSK9拮抗剂抗体(单克隆或多克隆)定序且所述多核苷酸序列接着可被克隆至载体以表现或繁殖。编码所述感兴趣抗体的序列可被维持于宿主细胞的载体中且该宿主细胞接着可被扩展及冷冻以供未来使用。在细胞培养中产生重组单克隆抗体可透过藉由本领域已知的方法自B细胞克隆抗体基因加以进行。参见例如Tiller et al. ,2008, J. Immunol. Methods 3 ，112 ；美国专利号 7，314，622。在替代实施方式中，所述多核苷酸序列可被用于基因操作以“人源化”所述抗体或改善所述抗体的亲和性或其他特征。举例来说，所述恒定区可经基因工程改造以更为近似人恒定区以避免若所述抗体用于人的临床试验及治疗时的免疫反应。所希望的是基因操作所述抗体序列以得到较高的PCSK9亲和性及较高的PCSK9抑制效用。对本领域技术人员显而易见的是，可在PCSK9拮抗剂抗体进行一个或多个多核苷酸改变且仍维持其与PCSK9的结合能力。人源化单克隆抗体有四个常规步骤。这些步骤为(1)决定该起始抗体轻链及重链可变结构域的核苷酸及预测的氨基酸序列；( 设计所述人源化抗体，意即决定在人源化步骤期间将使用哪一个抗体骨架区；C3)实际人源化方法/技术；及(4)转染及表现该人源化抗体。参见例如美国专利号4，816，567 ；5, 807, 715 ；5, 866, 692 ；6, 331,415 ； 5，530，101 ；5，693，761 ；5，693，762 ；5，585，089 ；及 6，180，370。一些包含源自非人免疫球蛋白的抗原结合位的“人源化”抗体分子已被描述，包括具有融合至人恒定结构域的啮齿动物或经修饰的啮齿动物V区及它们的相关CDR的嵌合抗体。参见例如 Winter et al. , 1991, Nature 349 :293-299 ；Lobuglio et al. , 1989, Proc. Nat.Acad. Sci. USA86 :4220-4224 ；Shaw et al.,1987，J Immunol. 138 :4534-4538 及 Brown etal.，1987，Cancer Res. 47 :3577_3583。其它参考文献描述在与适当的人抗体恒定结构域融合前移植啮齿动物CDR至人支持骨架区(FR)。参见例如Riechmann et al. ,1988, Nature 332 :323-327 ；Verhoeyen et al.，1988，Science 239 1534-1536 及 Jones et al.，1986， Nature 321 :522_525。另一参考文献描述由经基因工程重组改造的啮齿动物骨架区所支持的啮齿动物⑶R。参见例如欧洲专利公开号0519596。这些“人源化”分子经设计以最小化对啮齿动物抗人抗体分子的所不希望的免疫反应，所述不希望的免疫反应限制这些部分在人接受者的治疗应用的期间及有效性。举例来说，所述抗体恒定区可经基因工程改造以使其呈免疫惰性(例如不会诱发补体溶解)。参见例如PCT公开号W099/58572 ；英国专利申请号9809951. 8。其他亦可能被利用的人源化抗体的方法系由Daugherty et al. , 1991,Nucl. Acids Res. 19 :2471-2476 及美国专利号 6，180，377 ；6，054，297 ；5，997，867 ；5，866，692 ； 6，210，671 及 6，350，861 及 PCT
发明者乔米.庞斯, 亚斯米纳.N.阿布迪切, 布鲁斯.C.戈梅斯, 帕维尔.斯特罗普, 朱莉.J.L.霍金斯, 梁鸿, 王宇莉, 贾维尔.F.查帕罗里格斯, 邱夏杨 申请人:瑞纳神经科学公司, 美国辉瑞有限公司