一种同时实现促进树突细胞迁移至淋巴结和多模式成像的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物科学领域，特别涉及一种促进树突细胞迀移至淋巴组织，并能对该迀移过程进行多模式成像监测的方法。
【背景技术】
[0002]DC疫苗是通过采用病人自体的单核细胞在体外培养诱导生成DC，然后负载相应的肿瘤抗原并刺激成熟而获得。若要高效地发挥其治疗作用，成熟的DCXmature DC，mDC)必须迀移至病人的淋巴结组织并与幼稚T细胞相互作用。已有大量研究证据表明，DC所产生的体内免疫反应与携带相关肿瘤抗原的成熟DC迀移至次级淋巴组织的效率成正相关。虽然近期的临床预实验显示DC疫苗具有良好的治疗效果，但是仅有不到2%的注射进入体内的DC到达次级淋巴组织。因此，若要提升DC疫苗治疗功效，其中关键的一步在于如何提高DC在体的迀移效率。目前的研究主要集中在通过探索DC在体迀移的分子机制来解决DC迀移效率低的问题。Fontecha等人发现采用肿瘤坏死因子(TNF)或白细胞介素(IL-la)等炎症因子预免疫小鼠，可以增强其淋巴管内皮细胞对于趋化因子CCL21的表达，从而引导DC细胞更高效地迀移。Weber等人于2013年1月在Science上发表文章，指出通过构建模型证实了 DC在体迀移主要取决于淋巴管内皮细胞表达的CCL21的浓度。阐明DC的迀移机制在一定程度上可以指导今后的DC疫苗设计，但是采用炎症因子预刺激存在以下问题:1)DC迀移率仍较低(<3% );2)在DC接种量较高时(> 2 X 106)，预刺激基本不起作用；3)高剂量的炎症因子在体给药存在一定的不良反应;4)预刺激可以提高体内CCL21的浓度梯度水平，但无法实现对DC迀移的直接控制。因此，迫切需要开发更加高效、安全和可控的技术手段来提高DC的活体迀移效率。
[0003]磁力牵引是借用磁体异极相吸的原理而产生的一种方法，目前在生物医学领域已展现出良好的应用前景。Susan P.Foy合成了一种装载氧化铁的纳米颗粒(magneticnanopart i c 1 e，丽P)经小鼠尾静脉给药后，利用外加磁场提高了 MNP在肿瘤组织中的蓄积。Alain Luciani将摄取MNP的Huh7肝癌细胞经脾脏注射到小鼠体内，发现利用磁力牵引可以显著性地提高Huh7在肝脏外周血管周围的数量。目前还未有报道利用磁力牵引来提高DC的活体迀移效率。目前的研究已表明磁力牵引具有特异性好、安全和可控等优点，因此有望解决DC活体迀移效率低的难题。
[0004]另外，DC疫苗的优化要求建立非创伤性的成像手段来动态地监测DC迀移至淋巴组织的过程，从而实现在治疗过程中快速评价DC疫苗的效果。将这些造影剂标记DC主要是通过纳米运输载体实现，包括量子点、磁性纳米颗粒和聚合物纳米材料等。其中，采用纳米载体携带多种造影剂(尤其是近红外和MRI探针)进行多模式成像可以兼顾成像检测灵敏度和空间分辨率。为了满足以上需求，纳米颗粒的设计必须满足以下要求:1)生物相容性好;2)能被DC高效地摄取;3)能同时包裹肿瘤抗原、近红外和磁性MRI探针;4)在应用于肿瘤治疗时，携带的肿瘤抗原能被优先递送到DC的胞浆中而不是内体/溶酶体中。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是为解决上述问题而提供了一种促进树突细胞迀移至淋巴组织，并能对该迀移过程进行多模式成像监测的方法，利用该方法能有效提高DC的肿瘤防治功效。
[0006]本发明所采用的技术方案是:
[0007]一种同时实现促进树突细胞迀移至淋巴结和多模式成像的方法，所述方法由成熟树突细胞(mDCs)携带磁性焚光纳米颗粒在外加磁场下实现。
[0008]进一步地，所述磁性荧光纳米颗粒是由油酸酯-磁性氧化铁颗粒、两种磷脂、近红外探针和一种具有脂质结合能力的抗原融合肽通过自组装有机结合形成。
[0009]进一步地，所述的磷脂为DMPC和MHPC。
[0010]进一步地，所述的近红外探针为ICG分子。
[0011]进一步地，所述的具有脂质结合能力的抗原融合肽是由α螺旋多肽、连接序列和抗原肽以共价键的形式串连而成。
[0012]进一步地，所述α螺旋多肽的氨基酸序列为FAEKFKEAVKDYFAKFWD，所述连接序列的氨基酸序列为GSG，所述抗原肽的氨基酸序列为KVPRNQDWL、KTWGQYWQV、SIINFEKL或ISQAVHAAHAEINEAGR。
[0013]进一步地，所述外加磁场为磁铁产生或者恒定外加磁场。
[0014]本发明提供的一种同时实现促进树突细胞迀移至淋巴结和多模式成像的方法，具有以下优点:
[0015](1)生物相容性好:本发明方法中所选用的材料，磷脂、ICG、氧化铁颗粒和抗原融合肽，这些原材料都已用于临床或临床试验，具有良好的生物相容性。
[0016](2)操作工艺简单，有望应用于临床。
[0017](3)能大幅提尚DC的活体迁移效率。
[0018](4)能同时进行DC的活体多模示踪和肿瘤免疫治疗:mDCs摄取磁性荧光纳米颗粒后，其活体分布可以采用近红外光学成像和磁共振成像进行示踪；由于磁性荧光纳米颗粒含有抗原融合肽，因此可以用于肿瘤的预防和治疗。
[0019](5)采用磁力牵引能显著增强mDCs的抗癌功效。
[0020](6)功能可扩展:该系统除了直接应用于DC疫苗外，还可以在其表面装载免疫佐剂直接作为纳米疫苗，同时实现在体免疫细胞的激活、抗原高效递送、磁力牵引和多模成像。
【附图说明】
[0021]图1为所述磁性荧光纳米颗粒的透射电子显微镜成像图像和动态激光光散射(DLS)图。
[0022]图2为磁性荧光纳米颗粒的磁共振信号和荧光信号成像图。
[0023]图3为mDCs摄取磁性荧光纳米颗粒的流式细胞图。
[0024]图4为摄取磁性荧光纳米颗粒对DC生存率的影响。
[0025]图5为摄取磁性荧光纳米颗粒的mDCs的荧光成像图。
[0026]图6为摄取磁性荧光纳米颗粒的mDCs的普鲁士蓝染色图。
[0027]图7为磁力牵引对DC迀移能力的影响研究。
[0028]图8为小鼠足垫回输mDCs在24后的多模式成像(近红外和磁共振)图。
[0029]图9为mDCs后的近红外荧光成像图以及磁力牵引实施24小时后的荧光成像图。
[0030]图10为实施磁力牵引前后小鼠腿弯淋巴结荧光成像对比图。
[0031]图11为流式检测含磁性荧光纳米颗粒的DC在促进特异性淋巴细胞增值方面的能力。
[0032]图12为在有无磁场作用下DC抗肿瘤疫苗功效的对比研究。
【具体实施方式】
[0033]本发明实施例提供一种同时实现促进树突细胞迀移至淋巴结和多模式成像的方法。具体步骤如下:
[0034]l)mDCs的制备:DC的制备来源性骨髓提取分离，mDCs的制备采用常规培养方法获得，可以携带肿瘤抗原，也可以不含肿瘤抗原。DC可以是来源于骨髓提取，也可以是DC2.4细胞系。
[0035]2)mDCs携带多肽抗原和磁性物质:mDCs与一种磁性荧光纳米颗粒在37°C下孵育6小时即可完成。
[0036]所述磁性荧光纳米颗粒是由油酸酯-氧化铁颗粒、两种磷脂、近红外探针和一种具有脂质结合能力的抗原融合肽通过自组装有机结合形成。
[0037]所述油酸酯-氧化铁颗粒是油酸修饰氧化铁后的纳米颗粒，该物质已经投入商业化生产(见http: //www.nanoeast.net/cxnmklfzxs.html，油酸修饰的四氧化三铁磁性纳米颗粒(0A@Fe304，共沉淀法或高温热解法)
[0038]【产品名称】
[0039]油酸修饰的四氧化三铁磁性纳米颗粒
[0040]【英文名称】
[0041 ] 0A coated Fe304nanopartic 1 es
[0042]【成分】
[0043]油酸修饰的Fe304磁性纳米颗粒
[0044]【特点】
[0045]油溶性，可分散在环己烷、氯仿、四氢呋喃等溶剂中.
[0046]【用途】
[0047 ]用于掺杂水包油纳米乳、修饰纳米脂质体、构建磁性纳米药物等。
[0048]【技术参数】
[0049]TEM 尺寸:约 10nm
[0050]饱和磁化强度:约75emu/g Fe。
[0051 ]优选地，所述磷脂为DMPC (1,2-dimyristoyl-sn-glycero_3-phosphocholine)和MHPC(lipidsl-myristoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine)。
[0052]优选地，所述近红外探针为ICG分子(吲哚氰绿/心脏绿)。
[0053]所述具有脂质结合能力的抗原融合肽，是由α螺旋多肽、连接序列和抗原肽以共价键的形式串连而成，所述α螺旋多肽的氨基酸序列为FAEKFKEAVKDYFAKFWD，所述连接序列的氨基酸序列为GSG，所述抗原肽的氨基酸序列为KVPRNQDWL、KTWGQYWQV、ISQAVHAAHAEINEAGR或其它抗原多肽序列。
[0054]3)磁场作用下促进DCs活体迀移至淋巴组织:本发明使用圆形的磁铁N35(40X10mm；Gauss,11.7-12.1k)用来引导含磁性焚光纳米颗粒的mDCs的迀移，但不局限于磁铁发出的磁场，恒定的磁场也可以用于上述应用。
[0055]下面结合附图和实施方式对本发明做进一步详细的说明。
[0056]实施例1
[0057]组成磁性荧光纳米颗粒的抗原融合多肽，该肽是由α螺旋多肽(R4F)、连接序列和抗原肽(ΑΡ )以共价键的形式串连而成。其中α螺旋多肽的氨基酸序列为:FAEKFKEAVKDYFAKFWD，连接序列的氨基酸序列为GSG，抗原肽的氨基酸序列为:KVPRNQDWL。该多肽的氨基酸序列为序列表中SEQ ID N0.1所述。
[0058]制备磁性荧光纳米颗粒，其步骤为:
[0059]磁性荧光纳米颗粒的制备:称取DMPC和羟丙基甲基纤维素醚(MHPC)各5mg分别置于EP管中，然后在EP管中加入200μ1的三氯甲烷进行溶解，将溶解好的DPMC和MHPC转移至体积为约为400μ1含氧化铁的氯仿溶液中(10mg/mL)，再按氯仿: