甲醇= 20:1的比例加入甲醇进行混合。取约6ml的超纯水放入一个小的玻璃瓶中，加热至80°C左右，然后将混合好的溶液逐滴慢慢加入玻璃瓶中，边搅拌边加入，此过程持续约30分钟，加完溶液之后，继续搅拌30min，使甲醇和三氯甲烷完全蒸发掉。然后，停止加热，室温下冷却，将其转移至10ml离心管中，在4°C和3000rpm条件下离心10分钟，去掉底部沉淀，收集上清液，此过程重复三次。分别称取荧光染料ICG 5mg和多肽R4F-AP 8mg，其中ICG用500μ1的ddH20进行溶解，R4F-AP用2ml的ddH20溶解。然后把溶解好的ICG、R4F-AP和FAM溶液加入到上面溶液中，避光放置4°C冰箱中过夜。将此混合物在4°C、3000rpm条件下浓缩至约2ml时，加满PBS再进行浓缩3次，最后纳米颗粒的体积约为3ml左右。在无菌操作台上用无菌过滤器过滤，避光保存在4°C冰箱中。
[0060]磁性荧光纳米颗粒的纳米粒径图参见图1。图1(左)为磁性荧光纳米颗粒的电镜图，显示该材料为近球形且分散性较好。图1 (右)为磁性荧光纳米颗粒的水合粒径图，显示为30nm左右。图2为磁性荧光纳米颗粒的近红外和磁共振成像图，表明该材料具备多模成像的特性。这些实验结果表明，磁性荧光纳米颗粒是一种单分散性、粒径均一且具有多模成像特性的纳米颗粒。
[0061 ] 实施例2
[0062]实施例1中制备得到的磁性荧光纳米颗粒对成熟DC(mDC)的标记能力见图3。图3显示磁性焚光纳米颗粒能对mDC进行高效焚光标记，且在50yg/mL时对mDC的形态没有大的影响(20%以内)，而实验选择的浓度为20yg/mL。图4显示了不同浓度的磁性荧光纳米颗粒与mDC共孵育后的细胞存活实验，结果表明在50yg/mL的浓度范围内，磁性荧光纳米颗粒对mDCs的生长没有显著性影响。摄取磁性荧光纳米颗粒的mDCs具有荧光特性(图5)，荧光强度随着细胞个数的增加而升高。同时，普鲁士蓝染色证明，摄取磁性荧光纳米颗粒的mDCs胞内含有大量的磁性氧化铁物质(图6)。这些结果表面磁性荧光纳米颗粒能赋予DC荧光和磁感应特性。
[0063]实施例3
[0064]实施例1中制备得到的磁性荧光纳米颗粒在有无磁场作用下促进DCs迀移能力的比较参见图7。该步骤如下:
[0065]1)消化DC2.4，接种细胞至六孔板中，每孔1X106个细胞，体积为2ml;2)在接种细胞的第二天加60μ1的FMP-AP至其中一个孔中，另一个加60μ1 PBS作为对照，孵育时间为6小时；3)收集DC2.4，计数之后，调整细胞浓度至2 X 106个/mL; 4)将1 X 106个上述细胞放入25 cm2的细胞培养瓶中培养(体积为10ml),并在培养瓶的一侧放置一块磁铁作用24小时;5)用剪刀剪下培养瓶的两侧(培养基覆盖的区域)，采用正置显微镜进行成像。
[0066]结果发现，在培养瓶测试中，放置磁铁24小时后迀移至磁铁端的壁上的DC细胞数量是对照组的9倍(图7)。这些实验结果均证实，采用磁力牵引能极大地增强DC的迀移能力。
[0067]实施例4
[0068]实施例1中制备得到的磁性荧光纳米颗粒在有无磁场作用下的迀移至淋巴组织的效率比较。
[0069]l)C57BL/6小鼠的预处理:
[0070]取5只C57BL/6小鼠，分为两组，其中实验组3只，对照组2只。在实验组小鼠右侧足垫处分别注射25μ1 (lng/yL)TNF-a进行预刺激;在对照组的小鼠左侧和右侧足垫各注射25μ1的(lng/yL) TNF-a进行预刺激。
[0071 ] 2)EGFP小鼠来源的BMDC的提取:
[0072]提取EGFP小鼠来源的BMDC，培养至第六天的时候，加入含有lyg/mL的LPS新鲜培养基10ml培养24小时，使其变为成熟DC。然后，收集细胞，经两遍清洗后，从新悬浮细胞至dish中，体积为5ml。在每个dish中加入ΙΟΟμΙ的FMP-AP共孵育6小时。
[0073]3)将DC由小鼠足垫处注射:
[0074]6小时后，收集DC，用无菌PBS洗两遍，计数并调整其浓度至2.4X107cell/mL。用异氟烷吸入麻醉剂使小鼠处于麻醉状态时，在实验组小鼠的右侧足注射体积50μ1的DC( 1.2 X106个)。在对照组的2只小鼠的右侧足垫注射50μ1的DC(1.2X 106个)，并在其左侧足垫注射50μ1 PBS，最后分别在实验组小鼠的右侧大腿处套上一个磁铁，放置24小时。对照组不做处理。
[0075]4)采用近红外整体成像和MRI成像对腿弯淋巴结进行活体成像。
[0076]结果显示，含有磁性荧光纳米颗粒的mDCs经足垫注射，在经过磁场作用后，在腿弯淋巴结显示出较强的荧光信号和磁共振信号(图8)。通过荧光强度计算表明，在磁场作用下mDCs的迀移效率是未加磁场作用的16倍(图9)。在此实验中，进一步使用EGFP-mDCs代替没有荧光的mDCs，磁力牵引后将腿弯淋巴组织进行分离，继而进行活体显微成像，结果显示，磁力牵引组具有较强的EGFP荧光信号，表明该组织中具有大量的EGFP-mDCs存在，该结果与图8的活体成像结果基本一致(图10)。
[0077]实施例5
[0078]实施例1中制备得到的磁性荧光纳米颗粒在研究比较了mDC摄取单独抗原多肽gplOO和装载gplOO磁性焚光纳米颗粒运载(FMP-gplOO)后的抗原提呈能力，主要是通过比较两者激活抗原特异性CD8+T细胞的能力。该实验主要从gplOO多肽免疫的小鼠腹股沟淋巴结和脾脏中分离获取CD8+T细胞。如图11所示，T细胞的增值随着CD8+T/DC比例的增加而增加，并且FMP-gpl00-DC较gpl00-DC具有明显增强的促T细胞增值能力。
[0079]实施例6
[0080]比较研究了在有无磁场作用下，摄取磁性荧光纳米颗粒的mDCs的抗癌能力。具体方法如下
[0081 ] 1)待DC成熟之后，收集mDC，并再用PBS洗两遍。计数之后，按照每个dish中加入5ml培养基、3 X106个DC进行培养。然后在其中的三个dish中加入ΙΟΟμΙ PBS作为空白对照组进行孵育，其余的dish分别加入ΙΟΟμΙ的FMP-AP(铁的浓度为780yg/mL)与DC共孵育6小时。最后用PBS调节细胞浓度至2.4X107个/mL。
[0082]2)从小鼠足垫处注射体积为50μ1，细胞数量为1.2 X 106个DC:其中5只小鼠注射PBS对照的DC，另外10只小鼠均注射孵育过FMP-AP的DC，且在其中5只鼠的大腿处放置一磁铁作用24小时，接着取下磁铁。
[0083]3)—个星期后，再以相同的方式免疫小鼠一次。
[0084]4)接种E.G7-0VA肿瘤细胞:在小鼠第二次免疫的一个星期后，在免疫过的一侧接近腿弯淋巴结处皮下接种数量为5X106、体积为ΙΟΟμΙ的E.G-7-0VA肿瘤细胞。
[0085]5)肿瘤体积的测量:待肿瘤体积长到肉眼可见的时候开始测量肿瘤的长、宽、高。然后每隔一天测量一次，测量周期为2周，2周后处死小鼠。肿瘤体积按照下面的公式进行计算:体积=长X宽2/2。
[0086]如图12所示，空载DC的肿瘤体积随着天数的增加而逐渐增大，FMP-gpl00-DC免疫的小鼠的肿瘤体积一直保持在较低的状态，说明了负载0VA多肽的DC能在体激活机体的免疫响应。值得注意的是，磁场作用能显著增强FMP-gpl00-DC的抗癌功效，并且有2只小鼠(每组共5只小鼠)在第14天时肿瘤已完全消失，从而首次在活体上证实了通过磁力作用可以增强DC的肿瘤预防功效。
[0087]实施例7
[0088]实施例1中的抗原肽序列不只局限于KVPRNQDWL，其它抗原多肽也适用于该体系，比如KTWGQYWQV、SII NFEKL和I SQAVHAAHAE I NEAGR。该促进树突细胞摄取抗原肽的多肽的氨基酸序列为序列表中SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所述。
[0089]以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
【主权项】
1.一种同时实现促进树突细胞迀移至淋巴结和多模式成像的方法，其特征在于，所述方法由成熟树突细胞携带磁性荧光纳米颗粒在外加磁场下实现。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磁性荧光纳米颗粒是由油酸酯-磁性氧化铁颗粒、两种磷脂、近红外探针和一种具有脂质结合能力的抗原融合肽通过自组装有机结合形成。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的磷脂为DMPC和MHPC。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的近红外探针为ICG分子。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的具有脂质结合能力的抗原融合肽是由α螺旋多肽、连接序列和抗原肽以共价键的形式串连而成。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述α螺旋多肽的氨基酸序列为FAEKFKEAVKDYFAKFWD，所述连接序列的氨基酸序列为GSG，所述抗原肽的氨基酸序列为KVPRNQDWL、KTWGQYWQV、SIINFEKL或ISQAVHAAHAEINEAGR。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述外加磁场为磁铁产生或者恒定外加磁场。
【专利摘要】本发明公开了一种同时实现促进树突细胞迁移至淋巴结和多模式成像的方法，由成熟树突细胞(mDCs)携带磁性荧光纳米颗粒在外加磁场下实现。所述磁性荧光纳米颗粒是由油酸酯-磁性氧化铁颗粒、两种磷脂、近红外探针和一种具有脂质结合能力的抗原融合肽通过自组装有机结合形成。本发明能有效提高DC活体迁移至淋巴组织的效率，促进DC摄取抗原肽后的肿瘤防治功效，以及可以进行活体多模式成像检测。
【IPC分类】A61K38/10, A61K49/18, A61K47/48, A61P35/00, A61K49/00, A61K38/08, A61K41/00, A61K39/00
【公开号】CN105477630
【申请号】CN201510788151
【发明人】张智红, 金红林, 张宇, 戴艳锋
【申请人】华中科技大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年11月17日