els of S-adenosy!methionine ,S-adenosy!homocysteine and DNA methylation/'Physiologia Plantarum,Volume 93, Issue I,Article first published online:90CT 2008)。
[0080] 4、一般人的健康评估和筛选与甲基化指数的关联
[0081] 甲基转移酶(MT)在人类疾病的形成过程中起重要作用。多己胺(DA)多己胺是由患 者体内多己胺过多造成。比如，有关精神分裂症起因的多己胺(DA)假说多己胺(DA)是说精 神分裂症是由患者体内多己胺过多造成。儿茶酪氧位甲基转移酶(COMT)可降解中枢神经系 统中的儿茶酪胺类神经递质(包括多己胺类），COMT为一些精神分裂症的诊断治疗奠定了基 础（Renson J et al ('Action of the inhibitors of catechol ortho-methyl transferase on the adrenal catecholamines in the rat.''Arch Int Physiol Biochim. 1960May ;68:534-7.)。人体内有超过30种不同的甲基转移酶，其底物都是对人体 功能至关重要的多种物质。
[0082] 甲基化指数被作为人类总体健康、"活方'或"健康"的一个重要指标。
[0083] 此外，血浆中正常的SAM浓度因人而异，主要取决于性别（一般来说男性高于女 性），个体体重，还可能种族和饮食等等。SAM和SAH在代谢上关联紧密，因此SA田农度受到W 上各因素的影响与SAM相似，用两种物质（SAM和SAH)的比值应该很有可W排除或减轻运些 因素的影响。
[0084] SAH和SAM与屯、血管疾病、抑郁症、癌症W及与老化相关的疾病如阿兹海默症等的 关联是有据可查的。甲基化对于胎儿的发育、分化、蛋白质表达的表观遗传调控(主要通过 DNA，RNA和组蛋白的甲基化)十分关键。SAM和甲基化指数的高低是衡量人体"活力"的指标 或"健康"的标志。
[0085] 本发明的重大意义在于其提供了：
[0086] 1、直接、准确地定量所有各种生物样品甲基化指数的方法。
[0087] 2、在所有的实验室中都可W做到的直接、准确地定量甲基化指数的方法。
[0088] 3、直接、准确地定量甲基化指数的方法，用于评估整体的健康状况，肿瘤(癌症)预 测和预后，所有疾病的治疗(用S-腺巧蛋氨酸的治疗或其它治疗)效果的评估。
[0089] 4、直接、准确地定量生物样品甲基化指数的方法在肿瘤鉴别诊断中的应用。
[0090] 5、直接、准确地定量生物样品甲基化指数的方法在癌症化疗耐受（效果）中的应 用。
[0091] 6、直接、准确地定量生物样品甲基化指数的方法在胚胎形成，分化及衰老研究中 的应用。
[0092] 7、用试纸条或其它介质的半定量和定性免疫方法测定甲基化指数，W方便消费者 用于上述1-6方面。
[0093] 8、用试纸条或其它介质的半定量和定性测定S-腺巧蛋氨酸，W方便消费者监测S-腺巧蛋氨酸作为处方和非处方药物治疗一些疾病状态。
[0094] 9、用试纸条或其它介质的半定量和定性测定S-腺巧蛋氨酸，W方便消费者用于尿 液和血样品。
[00M] 10、定量和定性测定S-腺巧蛋氨酸，用于指导并监测S-腺巧蛋氨酸作为药物的治 疗情况。
[0096] 本发明也提供用S-腺巧蛋氨酸和包括S-腺巧蛋氨酸的综合治疗分析及方案。本发 明尤其提供了合成Aza-S-腺巧蛋氨酸半抗原的重要改进。详细阐述见下合成方案1和图5。
[0097] 合成方案1 [009引
5
[0099] 收集了病人血浆样品，用含有本发明中半抗原制备的抗体的酶联免疫吸附实验 化LI SA)方法测定了 S-腺巧蛋氨酸(SAM)和S-腺巧同型半脫氨酸(SAH)含量。ELISA形式包括 W下几种：
[0100] 形式1:(1)样品或标准品，（2)抗体，（3)半抗原-酶偶联物，（4)二抗包被的试纸条 或酶联板，二抗举例:羊抗鼠抗体或羊抗兔抗体，（5)洗涂液，（6)酶底物，（7)终止液(如果使 用"终点"模式，终止液可有可无;如果使用"速率"模式，不需要终止液）
[0101] 形式2: (1)样品或标准品，（2)抗体，（3)二抗-酶偶联物，（4)半抗原-载体蛋白包被 的试纸条或酶联板，（5)洗涂液，（6)酶底物，（7)终止液(如果使用"终点"模式终止液可有可 无;如果使用"速率"模式，不需要终止液）
[0102] 形式3: (1)针对2个决定簇的2个配对抗体，（2)样品或标准品，（3)在（1)中的一个 抗体与酶偶联，（4)洗涂液，（5)酶底物，（6)终止液(如果使用"终点"模式终止液可有可无； 如果使用"速率"模式，不需要终止液）
[0103] 本发明同时阐明基于免疫学方法化LISA等）的测定SAM的检测试剂盒(包含抗SAM 的抗体）。化ISA试剂盒可W是W上任何一种形式。例如，ELISA试剂盒可W包括W下成分： (a)二抗吸附在固相介质上，（b)包被（固化)半抗原及类似物，免疫原或其它含有免疫原的 类似的蛋白，（C) W固体或溶解形式的酶底物，（d)示踪物标记半抗原或类似物(示踪物或酶 偶联物），（e)缓冲液和洗液，（f)附加成分，主要用于防止非特异性吸附或结合或聚集。（g) 加样枪、解育器、标准品、标准曲线、结果读数仪。
[0104] SAM和SAH含量测定W后，甲基化指数即可W算出（SAM/SAH)，用于评估个体的健康 状况。从11里健康人的测定结果看，健康正常人SAM水平为147 ± 16nM，SAH水品为29 ± 1 InM, 甲基化指数为5 ± 1。癌症病人平均SAM为103 ± 52nM，动脉粥样硬化病人平均SAM为113 ± 15nM，W含有兔单抗测定SAH试剂盒初步测定动脉粥样硬化病人血浆中SAH明显升高，SAM/ SAH则明显降低。肝脏病人平均SAM为45 ± SnM(从26例样品），比正常人的SAM水平明显降低。 SAM和SAH的比值，及甲基化指数比SAM或SAH能够更精确地反映一般健康状况，疾病状态，发 展和预后。一般认为健康人的甲基化指数应该大于4(该值与检测方法有关，运个值是由高 压液相和质谱的方法算出来的）在病理状况下，由于SAM水平降低，同时SAH水平升高，甲基 化指数小于4,甚至小于1。降低的甲基化指数反过来会影响体内重要物质如DNA，RNA，多肤， 激素，神经递质等的甲基化过程，从而导致身体病变的发生或恶化。
[0105] 甲基化指数也可W用来决定化疗方案。甲基化指数明显降低的肿瘤病人可W使用 较积极的方案。甲基化指数可W用来根据癌症阶段和每个病人的具体情况选择合适的治疗 方案，显示甲基化指数在个体化治疗和用药中的应用价值。
[0106] 实施例简述
[0107] W下实施例旨在展示上述提及的部分检测方法，化合物和抗体的应用个例(所有 设及的数字均有变动范围且受具体实验条件所限，此为生物学领域实验受多方面影响的常 理)和治疗方案，不应该认为有可能限制本发明的范畴。
[010引实施例1
[0109] 制备抗S-腺巧蛋氨酸和S-腺巧同型半脫氨酸单抗隆和多克隆抗体
[0110] 试剂：
[0111] AdaM:Azaadenosyl 二氨基蛋氨酸，
[0112] ASAM: Aza-SAM,或者氮-腺巧蛋氨酸
[0113] BgG:牛丫球蛋白
[0114] BSA:牛血清白蛋白
[0115] BTG:牛thyrogloblulin
[0116] CSAM:碳-腺巧蛋氨酸或者6-甲基6-去氨西奈芬净
[0117] daH:去氨-5-腺巧同型半脫氨酸
[011引 da服0:daH横酸盐
[0119] DCC:二环己基碳二亚胺
[0120] DMF:二甲基甲酯胺
[0121] EDAC:乙基碳二亚胺盐酸盐
[0122] ELISA:酶联免疫吸附检测
[0123] GAM plate/strip:羊抗鼠免疫球蛋白包被吸附板或者条
[0124] GAR plate/strip:羊抗兔免疫球蛋白包被吸附板或者条 [01巧]HRP:辣根过氧化物酶
[0126] IB:解育缓冲液
[0127] KLH:血蓝蛋白
[012引畑S: N-径基班巧酷亚胺 [01巧]PBS:憐酸盐缓冲盐水
[0130] RT:保留时间（高效液相色谱），或室溫
[0131] SAH: S-腺巧同型半脫氨酸
[0132] SAM: S-腺巧蛋氨酸
[0133] 1、制备AdaM-NHS:把21.7mg(0.107mmole)的DCC 和7.2mg(0.061mmole)NHS 加入到 装有AdaM(15. lmg，ca.0.041mmole)e的瓶子中过夜，残留固体真空干燥3-4小时，在氮气环 境中加入大约105毫升干燥的DMF，然后将瓶子密封。该溶液在室溫环境下揽拌过夜。薄层色 谱分析显示有N服醋形成。
[0134] 2、准备AdaM-BSA:称取59.Smg BSA加入圆底烧瓶中，加入5毫升新鲜制备的IOOmm 的憐酸钢缓冲溶液，pH值为8.25。在4度水浴中剧烈揽拌，将上述方法制备的NHS每隔几分钟 缓慢加入10化。共加入150化后，混合物变为色。再加一毫升的DMSO溶液助溶。另外加50化的 NHS到DMF中，溶液再次变色。采用水浴超声处理5分钟后分5次各加入10化的畑SdDMF中共加 入15化L的N服后，超声混合20分钟。为了确保无游离半抗原，用PBS缓冲液透析（1.5升X 4) 2 天W上。最终体积约36毫升，估算BSA浓度为1.66mg/mL。
[0135] 3、准备AdaM-KLH:利用上述方法，称出17.5毫克KLH，15.1毫克AdaM。透析后的最终 体积为29.5毫升，浓度为0.6毫克/毫升。
[0136] 4、准备AdaM-PlX:称取4.72mg AdaM溶于ImL DMF中，再加入6.5毫克抓C. HC巧口 4. Omg的NHS，密封揽拌混合均匀，置于暗处室溫过夜。称取1.5mg的PlX溶于pH 8.2的ImL IOmM PBS中，随后将活化的AdaM缓慢的加入至化化缓冲液中，暗处混合揽拌过夜。混合物用 IOmm抑7.3的PBS透析48小时，透析后的最终体积为3.5毫升，浓度为1.4毫克/毫升。
[0137] 5、准备SAH-BSA:称取SAH(Sigma)3. Smg溶于1.5mL DMF中，再加入 10毫克抓C.HCl 和4.5mg的NHS，密封揽拌混合均匀，置于暗处室溫24小时。称取12.9毫克BSA溶于2mL pH 7.810mm的PBS中。将SAH溶液缓慢加入到BSA溶液中混合，4度暗处混合揽拌过夜。反应混合 物化Omm抑7.3的PBS透析72小时。透析后的最终体积为8.4毫升，浓度为1.4毫克/毫升。 [0 13引 6、准备SAH-化L:称取1.5mg的SAH溶于ImL DMF，再加入4毫克抓C ? HC巧日2mg的 NHS，密封揽拌混合均匀，置于暗处室溫过夜。称取1.5mg的化L溶于4.7血50mM pH 9.6PBS 中，随后将活化的SAH缓慢的加入到化L缓冲液中，暗处混合揽拌过夜。混合物用IOmm pH 7.3的PBS透析48小时，透析后的最终体积为7.0毫升，浓度为0.93毫克/毫升。
[0139] 7、制备单克隆抗体SAM和SAH的一般流程：
[0140] 基于Kolher和Milstein的方法（自然，1975,第256期，495-497页），目前常见的方 法是用小鼠制备单克隆抗体。
[0141] 用Ba化/c小鼠做单克隆抗体的免疫和腹水生产，多次皮下注射免疫原（总体积为 ImL)初始注射用完全弗氏佐剂和AdaM-BSA或AdaM-KLH按照1:1的比例完全混合并在PBS中 充分乳化。随后的注射用弗氏不完全佐剂。
[0142] 定期收集免疫动物的血液离屯、分离细胞。将获得的抗血清进行检测评估，W确定 免疫反应和抗体效价。根据应用程序，抗体可直接使用。在必要时，可W进一步纯化免疫球 蛋白，用硫酸锭或硫酸钢或蛋白A的柱层析。
[0143] 可W通过注射到宿主体内获得腹水，