然后通过蛋白质的亲和柱纯化腹水得到单克 隆抗体。也可W通过体外培养的方法制备杂交瘤细胞制备单克隆抗体。
[0144] 融合前=天小鼠静脉注射免疫原做最后加强。收获小鼠脾脏后用弗式压碎器磨 碎。脾细胞与骨髓瘤NS-I细胞按5:1的比例融合。融合后的细胞悬液，再接种在96孔板中。杂 交瘤细胞在含18 %胎牛血清的RPMI1640中生长，加入HAT和HT进行补充筛选。用AdaM-P化筛 选出的阳性克隆进行进一步培养。最后的选出有阳性有交叉的克隆。选定的克隆，注入小鼠 腹腔生产腹水。
[0145] 通过多次筛选，我们确定了具有更好的特异性并且与其他类似物的交叉较小的几 个克隆，对2株单克隆抗体的效价进行了测试，结果显示在图1:
[0146] 8、兔多克隆抗体SAM与SAH:
[0147] 用新西兰白兔做多克隆抗体生产，多次皮下注射免疫原（总体积为ImL)免疫过程 如生产单克隆抗体的免疫小鼠过程。对于抗-SAM和抗-SAH的兔抗血清的检测效价均为1: 12000。
[014引实施例2
[0149] 抗体的特异性
[0150] 为进一步测试运些克隆的特异性，84号克隆的交叉反应很低，仅1.25% (见图2)。 交叉反应中使用的S种SAM类似物为S-腺巧同型半脫氨酸（SAH)、蛋氨酸和腺巧。在竞争 ELISA中类似物的剂量高于SAM剂量约80倍。IOiiM SAH、蛋氨酸、和腺巧时，竞争反应没有出 现。当SAM加入量远低于类似物时，从图2可W见到清晰的抑制反应，抑制率超过了40%，然 而=种类似物却没有抑制现象。
[01引]118号克隆与SAH、蛋氨酸和腺巧的交叉反应也是很低（图3)。竞争化ISA中，SAM、 SAH、蛋氨酸和腺巧使用剂量与实例2中相同。结果显示，游离的SAM显著的抑制抗SAM单克隆 抗体118号与包被在ELSIA板微孔中的AdaM的结合，然而SAH、蛋氨酸和腺巧却没有抑制。
[0152] 实施例3
[0153] 竞争化SIA法
[0154] 试剂；
[0155] IB: IOmM憐酸缓冲液、150mM NaCl，0.2 %BSA，0.1 % 吐溫-20，0.1 %Procl in，抑7.4
[0156] 样本：（a) SAM甲苯横酸盐硫酸氨盐（Sigma) (b) SAH盐（分子量406.39) (C)腺巧 (Sigma) (d)甲硫氨酸（Sigma)。HRP标记羊抗鼠 IgG(H+L)二抗化arthOx，San FYancisco， CA) dHRP底物:单组份底物溶液化A-blue四甲基联苯胺底物。抗原稀释液:0.5%BSA的IB。包 被缓冲液:50mM碳酸盐缓冲液抑9.6。洗液:PBS pH7.5，0.1 %吐溫-20。
[0157] (l)、AdaM-BSA包被于化SIA板，封闭后甩干，然后与SAM、SAH、甲硫氨酸和腺巧竞 争。类似物溶于40化抗原稀释液，再加入44化0.02化g/mL纯化的抗SAM单克隆抗体和16化 IB巧ris(IOOmM P册.5)缓冲液，于37°C-起解育1-2小时。
[0158] (2)、用PBST洗板S次，甩干。
[0159] (3)、每孔加入100化合适浓度的HRP标记羊抗鼠 IgG二抗，37°C解育20分钟。
[0160] (4)、洗板S次甩干。
[0161] (5)、每孔加入10化L HRP底物，解育10-15分钟。
[0162] (6)、每孔加入50化2N出S〇4终止反应。
[0163] (7)、酶标仪读取0D4加值。
[0164] 为测量生物样本中SAM含量，开发了竞争化ISA法。
[01化]SAM、SAH竞争化ISA法标准曲线如图4所示。
[0166] L0GIT = ln[(A/A0)/(l-A/A0)]，其中A为样本或者标准品0D450值，AO为抗原为0时 的OD450值。LOG口负值表示A/A0低于50%，抑制率(1-A/A0)高于50%。
[0167] 精确称量12.6mg标准品，溶于少量的DMF溶液，然后在0 . ImM HCl中完全溶解，于 250mL容量瓶中定容。W此于IOOmL容量瓶中各自配制the扣g/mL. 2.5iig/mL，1.25iig/mL， 0.625]ig/mL，0.3125iig/mL and 0.15625]ig/mL标准品溶液。
[016引实施例4
[0169] 制备了 HRP-偶联的抗SAM单克隆抗体克隆84,另外一个抗SAM的单克隆抗体与84抗 体配对，有可能建立夹屯屯LISA W便定量SAM。
[0170] 实施例5
[0171] 血样品收集步骤
[0172] 所有正常和病人样品收集前均获得知情同意。采集静脉血到抓TA抗凝管，摇匀后 马上放到含有冰水混合物的容器中。在采血后的30分钟内，做W下步骤:预先将离屯、机冷却 到4摄氏度，将采血管直接放到合适的转头中，W2000g离屯、30分钟。迅速将血浆全部转移到 Eppendo计管中，每10化L血浆加入10化IN醋酸。样品或者立即测定SAM和SAH或者标记，分 装，置于-20°C或-70°C冻存待W后测定。移除血浆后剩余的全血细胞分装冻存用于测定 SAM，SAH或DNA，有些样品，专口分出白细胞层，冻存W便将来从白细胞中提取DNA。
[0173] 实施例6
[0174] 11例20-50岁的身材正常的亚裔男性和女性血样品，按W上竞争性化ISA方法测定 SAM和SAH含量。平均SAM水平为147 ± 16nM，SAH水品为29± 1 InM，甲基化指数为5 ± 1。将会有 更多血浆样品用于SAM和SAH的免疫测定，W观察不同种族，年龄，性别，体重，饮食，生活方 式对SAM和SAH的影响。随着大规模的针对SAM/SAH的流行病学研究的开展，与不同疾病状态 下SAM/SAH的比较，用甲基化指数作为一般健康指征将会更加明确。
[0175] 实施例7
[0176] W直接法竞争化ISA测定住院准备化疗的病人的血样品SAM和SAH含量。12例癌症 病人平均SAM为103±52nM，平均SAH为250±90nM，平均甲基化指数为0.5。更多的诊断信息 明确，症状，资政分期，病情进展，治疗，复发，预后明确的临床样品的分析工作正在进行，W 期得到完整的甲基化指数与癌症各个方面的关系的资料来进一步验证。多种癌症化疗前后 样品已经收集。测定人血白细胞的DNA甲基化程度。癌症病人的DNA甲基化异常和甲基化指 数或整体DNA甲基化程度的关系也将为健康状况和治疗方案有指导作用。
[0177] 实施例8
[0178] 动脉粥样硬化和屯、脏病患者（重症监护病人）的血浆样品也用我们建立的竞争性 ELISA来分析SAM和SAH含量，商业化ISA试剂盒测定同型半脫氨酸化CY)含量。10例动脉粥样 硬化病人样品平均SAM为113±15nM，SAH含量为680±258nM，W含有兔单克隆抗SAH抗体 (ablll903 ,abeam, Cambridge, MA，USA)建立的SAH试剂盒初步测定屯、脏突发病人血浆中SAH 明显升高。更多的数据证明SM/SAH在动脉粥样硬化病(包括冠状动脉，脑血管和外周血管） 中明显降低。甲基化指数和被认为与屯、血管疾病死亡率有正相关的同型半脫氨酸含量的关 系很明确（因为SAH是HCY的来源）。SAM/SAH可能比肥Y更好，能更直接地反映屯、脏病的发作 和评估治疗有效性的指标。
[0179] 实施例9
[0180] 肝脏疾病比如传染性肝炎(有些伴有胆管狭窄），肝硬化，肝纤维化等的血浆样品 也用我们建立的竞争性ELISA来分析SM和SAH含量。26例病人样品平均SAM为45 ± 8nM，远比 正常人的SAM水平低;但是SAH水平则明显高于正常人，为342 ± 129nM，甲基化指数平均值大 约为0.13.
[0181] 实施例10
[0182] 抑郁症病人的血液样品也用来测定SAM含量。预计运类病人样品由湘雅第二附属 医院精神健康研究所(无明显器质性病变的抑郁症)和宁波第第二医院神经内科和康复科 (有明显器质性病变的抑郁症)提供。尤其要比较用SAM-e或其它药物治疗前后样品中SAM和 SAH含量。10例样品中SAM水平为20±18nM，SAH为340±180nM.甲基化指数平均约为0.064。 SAM和甲基化指数是指导个体化用药治疗抑郁症的有益的武器(指标），并对预后有指导意 义。定性和半定量SAM试纸条将对于抑郁症病人是否使用SAM或其它抗抑郁药物治疗，使用 多少剂量等，提供了简单方便的评判方法。运将帮助病人合理地选择对自己有利的药物与 剂量。
[0183] 实施例11
[0184] 己金森氏病人的血液样品也用来测定SAM含量。样品由宁波第二医院神经内科和 康复科确诊后提供。同样用本发明中建立的竞争性化ISA方法测定血浆样品中SAM和SAH水 平。
[0185] 实施例12
[0186] 风湿性关节炎和多发性硬化病人的血液样品也用来测定SAM含量。样品由宁波第 二医院康复科确诊为骨关节炎和多发性硬化后提供。同样用本发明中建立的竞争性化ISA 方法测定血浆样品中SAM和SAH水平。研究发现，SAM水平和甲基化指数在骨关节炎和多发性 硬化病人中有明显改变。骨关节炎和多发性硬化病人的SAM和SAH水平在服用SAM或其它有 效治疗药物前后进行比较会有变化。SAM和甲基化指数也将会是骨关节炎和多发性硬化病 个体化用药和知道预后的有效指征。定性和半定量SAM试纸条将对于运些病人是否使用SAM 或其它治疗骨关节炎和多发性硬化病药物进行治疗，使用多少剂量等，提供了简单方便的 评判方法。运将帮助病人合理地选择对自己有利的药物与剂量。
[0187] 实施例13
[0188] 实施例子6-12中样品的甲基化指数测定方法如下：用本发明中建立的免疫测定方 法如竞争性化ISA方法同时测定SAM和SAH的含量，计算SAM和SAH的比值，就是甲基化指数。 甲基化指数应该比单一的SAM或SAH或HCY指标更能精确地更有说服力地评估健康状况，疾 病状态，病情发展和预后。一般认为正常人甲基化指数大于4。在病理情况下，会小于4，甚至 小于1，原因是在病理状况下SAM水平减低同时SAH水平升高。降低的甲基化指数反过来同时 会进一步影响DNA，RNA，多肤，激素，神经递质等重要生命分子的甲基化过程的正常进行。所 W把甲基化指数调整到正常范围内对人体健康有益。
[0189] 实施例14
[0190] 化合物1:2'，3'-0-异丙叉腺巧（25克，82毫摩尔，反应式1)和除水干燥的化晚 (200mL) -起倒入500毫升单口圆底烧瓶中，在氮气的保护下使用磁子强力揽拌。圆底烧瓶 在热烘干器上加热并强力揽拌使腺巧溶解，5分钟后所用固体物完全溶解。将混合物溶液放 置在冰水浴中20分钟左右。对甲苯横酷氯固体分8次在一个小时左右加完，W防止反应明显 放热。混合物在(TC保持反应5天，使用薄层色谱检测反应完全后，往产物中加入IOOmL纯水 和300mL乙酸乙醋。混合物转移到分液漏斗中，加入IOOmL的3摩尔每升的盐酸，分离出来的 有机层分五次每次使用200mL纯水冲洗，W除掉有机层中过量的化晚盐酸盐。有机层使用减 压蒸馈旋干，再使用IOOmL的二氯甲烧溶解，然后缓慢的加入1.1化庚烧并不停的揽拌，通过 分液漏斗分离出31.1克的白色沉淀，使用质谱和核磁共振谱确定其结构。
[0191] 实施例15
[0192] 化合物2:化合物1 (32.2克，70毫摩尔）放入300mL带密封的磁性揽拌装置中，然后 加入200mL含有2M的甲胺四氨巧喃溶液，然后将反应装置密封。反应装置浸入到50摄氏度的 油浴中反应两天并不停揽拌，然后将反应装置带出油浴，最后放置在冰水浴中反应30分钟。 打开密封盖，使用氮气将多余的甲胺吹干。将产物使用旋转蒸发器旋干。使用5%甲醇二氯 甲烧溶液过色谱柱纯化产物，收集到3.51可得化合物2，使用核磁共振确定其结构。
[0193] 实施例16
[0194] 化合物3:5.0克（15.6毫摩尔)氨基化合物2放置在SOOmL的单口瓶中，往单口瓶中 加入150血干燥的乙腊和2.1克（16.38毫摩尔）的二异丙基乙胺，在35°C揽拌30分钟，再加入 2.55克漠下烧，然后加入288mg舰化四下锭，混合物在40°C反应5天。反应产物使用减压蒸馈 浓缩，浓缩物使用5%的甲醇二氯甲烧溶