，加入MTT(5.0 mg/ mUlO yL，继续培养4 h后每孔加入150 yL DMSO溶解生成的结晶子，用酶标仪于492 nm处 测其吸光度值(A)，以培养基空白孔调零，计算细胞存活率。
[0062] 附图8是上述载药的聚合物PEG5k-b-PCDC2.8k交联纳米粒子对Raw264.7和MCF-7 细胞的毒性结果图；从结果可以看出，载阿霉素的交联纳米粒子对Raw264.7细胞的半致死 浓度为4.89 yg/mL，载阿霉素的交联纳米粒子对MCF-7细胞的半致死浓度为2.31 yg/mL，所 以载DOX的PEG5k-b-PCDC2.8k交联纳米粒子能有效的在细胞内释放药物并杀死癌细胞。 [0063] 实施例十八聚合物纳米粒PEG5k-P(CDC3.2k-c〇-TMBPEC3.5k)的制备、交联、解交 联及细胞毒性 纳米粒子采用透析法制备。聚合物PEG5k-P(CDC3.2k-c〇-TMBPEC3.5k)溶解在N，N-二甲 基甲酰胺(5 mg/mL)中，取200 yL滴加到800 yL磷酸盐缓冲溶液（10 mM，pH 7.4，PB)中，装 入透析袋(MWCO 3500)中透析过夜，换五次水，透析介质为I3B(H) mM，pH 7.4)。最终得到的 聚合物纳米粒为胶束结构，其浓度为〇 . 2 mg/mL。附图9为聚合物PEG5k-P(CDC3.2k-c〇-TMBPEC3.5k)交联纳米粒子粒径分布图及电子投射显微镜图片图；可以看出，由动态光散射 粒度分析仪(DLS)测的形成的纳米胶束为60 nm，并且粒径分布很窄；由透射电子显微镜可 以看出，交联的纳米粒子为球状，并且分散均匀，尺寸与DLS所测相吻合。
[0064] 纳米粒的交联按加催化量的二硫代苏糖醇(DTT)进行。将聚合物纳米粒水溶液通 氮气10分钟，尽量将空气赶净。然后向密闭反应器中的纳米粒溶液（I mL，0.25 mg/mL， 3.21ΧΠΓ5 mmol)中加入10 yL溶解在二次水中的二硫代苏糖醇(DTT)(0.007 mg，4.67X HT5 mmol，硫硫五元环摩尔数10 %)，密闭室温搅拌反应1天。测定粒子的尺寸为55纳米，和 没有交联的粒径相比减少约8%。这是因为交联之后的纳米粒子相对于没有交联的纳米粒子 核内更紧实。交联后的纳米粒子在浓度稀释100倍以后其粒径和粒径分布几乎没有变化;在 生理条件下稳定，由此可以看出，双硫交联可以很大程度上提高纳米粒的稳定性。
[0065] 二硫键可以很容易在还原剂如谷胱甘肽作用下断裂。在氮气保护和37 °C条件下， 将交联纳米粒溶液通氮气10分钟后，加入谷胱甘肽(GSH)使其在聚合物纳米粒子溶液中的 最终浓度为10 mM。利用动态光散射粒度分析仪跟踪纳米粒子解交联粒径的变化情况。加 10 mM还原性物质谷胱甘肽(GSH)后，交联纳米粒子粒径随着时间的推移逐步被破坏，说明 聚合物中双硫环在大量还原物质存在下会断裂。在细胞质中也存在高浓度的GSH，因此制备 的纳米药物载体循环稳定，但被细胞内吞后能快速解离，释放药物. 采用MTT法对交联纳米粒的细胞毒性进行测试。使用到的细胞为HepG2(人肝癌细胞） 细胞和Raw 264.7(小鼠巨噬细胞）细胞。以IX IO4个/mL将MCF-7(人肝癌细胞)细胞或Raw 264.7(小鼠巨噬细胞)细胞接种于96孔板，每孔100 yL，培养至细胞贴壁后，实验组加入含 有不同浓度的聚合物纳米粒的培养液，另设细胞空白对照孔和培养基空白孔，平行4个复 孔。培养箱中培养24小时后取出96孔板，加入MTT (5.0 mg/mL)10 yL，继续培养4小时后每 孔加入150 yL DMSO溶解生成的结晶子，用酶标仪于492 nm处测其吸光度值(A)，以培养基 空白孔调零，计算细胞存活率。
[0066] 式中At为试验组490 nm处的吸光度，Ac为空白对照组492 nm处的吸光度。聚合物浓 度分别为〇 .3，0.6,0.9,1.2,1.5 mg/mL。附图10为纳米粒细胞毒性结果，从图中可以看出， 当聚合物纳米粒的浓度从0.3 mg/mL增大到1.5 mg/mL时，孵育24小时后HepG2和MCF-7细胞 的存活率仍高于85%，说明PEG5k-P(CDC3.2k-c〇-TMBPEC3.5k)聚合物纳米粒具有良好的生 物相容性。
[0067] 实施例十九交联纳米粒PEG5k-P(CDC3.2k-c〇-TMBPEC3.5k)的载阿霉素、体外释 放及细胞毒性 PEG5k-P(CDC3.2k-c〇-TMBPEC3.5k)交联纳米粒装载阿霉素、体外释放方法同实施例十 七。采用MTT法对其形该交联载药纳米粒对Raw264.7和HepG2等细胞的毒性进行测试，载药 的未交联纳米粒及游离药物作为对照。以Raw264.7为例，将Raw264.7以I X IO4个/mL接种于 96孔板，每孔100 yL，培养至细胞贴壁后，实验组分别加入含有0.01、0.1、1、5、10、50和100 yg/mL的载阿霉素交联纳米粒溶液，载阿霉素未交联纳米粒溶液及游离阿霉素的新鲜培养 液，另设细胞空白对照孔和培养基空白孔，每孔设4个复孔。培养箱中培养48小时后取出96 孔板，加入10 yL的MTT(5.0 mg/mL)，继续培养4 h后每孔加入150 yL的DMSO溶解生成的 结晶子，用酶标仪于492 nm处测其吸光度值(A)，以培养基空白孔调零，计算细胞存活率，结 果见附图11，载阿霉素的交联纳米粒对Raw264.7细胞的半致死浓度为12.8 yg/mL，相对于 游离阿霉素，只增大了不到十倍，所以载药的PEG5k-P (CDC3.2k-c〇-TMBPEC3.5k)交联纳米 粒能有效在细胞内释放药物并杀死癌细胞，而对应的空交联纳米粒对HepG2和Raw264.7细 胞有很好的生物相容性。
[0068] 实施例二十cRGD修饰的肿瘤靶向的载药聚合物纳米粒cRGD-PEG5k_P(CDC3.2k_ c〇-TMBPEC3.5k )的制备及细胞毒性 按照实施例九中方法合成Mal-PEG6k-P(CDC3.8k-c〇-TMBPEC3.5k)聚合物，并按照实施 例十五中所述方法制备装载DOX的纳米粒，并按照实例十六中所述方法制备交联载药纳米 粒。之后用cRGD-SH短肽通过迈克尔加成反应制备表面偶联cRGD的纳米粒子，其能被恶性胶 质瘤细胞特异性内吞，从而更有效地杀死肿瘤细胞，达到化学治疗的效果。按照实施例十九 细胞毒性的实验方法，此处我们选用恶性脑胶质瘤(U87MG细胞)细胞做MTT毒性试验，这是 因为这种细胞表面有对cRGD过度表达的整合蛋白，通过细胞毒性试验结果可知，纳米粒子 中cRGD- PEG6k-P(CDC3.8k-c〇-TMBPEC3.5k)在整个聚合物重量比为20%时，孵育了48小时， 并在加入载药纳米粒子4小时后吸走样品，继续孵育44小时，其药物半致死量相对于没有 cRGD的载药纳米粒子减少了六倍，由此结果可知，表面修饰cRGD的载药纳米粒子可以与细 胞表面特殊的受体结合并内吞进入细胞，相对于没有靶向的纳米粒子，其主动靶向性很强， 能有效的杀死肿瘤细胞，在载药纳米粒子对肿瘤的靶向治疗中有广泛的应用前景。
[0069] 实施例二^^一载药PEG5k-PLGA7.8k-PCDCl.7k修饰纳米金棒表面、及NIR触发的 药物释放 三嵌段聚合物PEG5k-PLGA7.8k-P⑶Cl. 7k纳米粒修饰的纳米金棒的制备 在剧烈搅拌下，溶解在DMSO中的聚合物溶液(2 mL，5mg/mL)滴加到纳米金棒的分散液 中（5 mL，O.lmg/mL)搅拌4小时，离心两次除去没有接上去的聚合物，再次分散在磷酸缓冲 溶液中，通过TGA来检测修饰上金棒的聚合物产率，通过与单独的聚合物相比，聚合物修饰 的金棒的产率为80%(理论按百分之一百投料）。聚合物修饰的纳米金棒的载药。在上述得到 的聚合物修饰的纳米金棒溶液中，逐滴滴加10%，20%，30%的溶解在DMSO中的药物，搅拌半小 时之后在室温下孵育12 h，并通过透析12小时除去游离的小分子药物，透析介质为pH为7.4 的磷酸缓冲溶液，之后通过荧光检测其对药物的包裹效率为70~90%，由此可知，聚合物修饰 的纳米金棒可以高效的包裹小分子疏水药物。
[0070] NIR触发的聚合物修饰的纳米金棒的药物释放。聚合物修饰的纳米金棒分散在10 mL磷酸缓冲溶液中，隔一小时用强度为0.2 W/cm2,波长为808 nm的红外光照射5 min，在 特定的时间间隔内取500 nL溶液出来，离心，测上清液的荧光，由此分析释放出来的小分子 药物含量。通过荧光检测可知，光照过后的聚合物修饰的纳米金棒的药物释放为92%，远远 快于没有光照的对照组(释放仅为18%)，由此可知，此类聚合物修饰的纳米金棒材料可应用 于近红外触发的药物释放。
【主权项】
1. 一种侧链含双硫五元环功能基团的碳酸醋聚合物在制备药物控制释放载体中的应 用;所述侧链含双硫五元环功能基团的碳酸醋聚合物的化学结构式如下：其中，R1选自W下基团中的一种：所述侧链含双硫五元环功能基团的碳酸醋聚合物的分子量为3000~70000 Da。2. 根据权利要求1所述侧链含双硫五元环功能基团的碳酸醋聚合物在制备药物控制释 放载体中的应用，其特征在于:所述侧链含双硫五元环功能基团的碳酸醋聚合物分子链上 含有双硫五元环功能基团的环碳酸醋单体的单元数为4~50。
【专利摘要】本发明公开了一种侧链含双硫五元环功能基团的碳酸酯聚合物在制备药物控制释放载体中的应用。所述侧链含双硫五元环功能基团的碳酸酯聚合物基于含有双硫五元环功能基团的环碳酸酯单体通过活性可控开环聚合得到，其分子量可控、分子量分布较窄，无需保护和脱保护过程；利用本发明所述的环碳酸酯单体开环聚合得到的聚合物具有生物可降解性，可用于控制药物释放体系，制备的肿瘤靶向的还原敏感可逆交联的纳米药物载体支持体内长循环，但在癌细胞高富集并细胞内快速解交联、释放出药物，高效特异性地杀死癌细胞。同时该碳酸酯聚合物在组织工程支架和生物芯片涂层等方面具有应用前景。
【IPC分类】A61P35/00, A61K47/34, A61K31/704
【公开号】CN105535983
【申请号】CN201510973768
【发明人】孟凤华, 邹艳, 钟志远
【申请人】苏州大学
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2014年5月28日
【公告号】CN104031248A, WO2015180656A1