件下测试微凝胶的紫外吸光情况，用紫外分光光度计检测得到纳米凝胶载体以温度对吸光值作图分析可以看到，随着温度的升高，具有温度敏感的PNIPAM从亲水性向疏水性逐渐转变，表现在紫外吸光值上逐渐增大，当温度升高到37°C以上，PNIPAM完全变成疏水结构，纳米凝胶由于疏水之间的相互作用形成聚集体，此时紫外分光光度计由于纳米凝胶形成的大的聚集体而检测得到的吸光值呈最大。因此借助温度升高吸光值的改变得到纳米凝胶发生相转变的温度(VPTT)，其值约为39°C，为后续细胞实验做好准备。
[0082]实施例6、靶向纳米微凝胶生物相容性研究
[0083]将对数生长期的人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞(购自美国ATCC)消化、离心后计数，铺96孔板，细胞数2 X 14/孔，将其与不同浓度的纳米凝胶载体进行孵育，16小时后用CCK-8试剂盒检测每孔细胞密度并计算不同浓度载体对细胞的毒性。
[0084]MDA-MB-231细胞生存率结果显示:浓度为20，40，80，160 μ g/mL单独NIPAM作用细胞后，细胞的存活率在高浓度的160 μ g/mL下仍能达到90%以上；而单独的PEI在浓度仅为20 μ g/mL时，细胞的存活率不到5%，表明单独的PEI对细胞具有显著的毒副作用；而制备得到的纳米凝胶载体在160 μ g/mL下，其细胞存活率有50%左右，相对于PEI对细胞的毒性，纳米凝胶对细胞的毒性已经很低了，为了能够更好的应用于细胞和体内实验，后续实验中所用到的纳米凝胶浓度为100μ g/mL以内，数据显示纳米凝胶浓度<100μ g/mL，其细胞存活率能达到80%以上。
[0085]实施例7、制备靶向、非靶向微凝胶包裹5-氟尿嘧啶体系:
[0086]1.BSA 和 Ant1-HER-1 巯基化
[0087]2.用 Mill1-Q water 稀释制备 6ml 0.5mg/ml 微凝胶溶液
[0088]3.精密天平称取3mg 5-FU,并加入到上述微凝胶溶液中，超声2分钟后，静止12小时，即可形成微凝胶/5-FU体系
[0089]4.12小时后，取出1.5ml微凝胶/5-FU体系，向剩余4.5ml溶液中加入1.8mgmPEGs，混匀后，室温下静止10小时
[0090]5.10小时后，采用1k MffCO离心柱离心纯化微凝胶/5_FU体系
[0091]6.向3ml凝胶/5-FU体系中加入0.7ml 9.7mg/ml巯基化抗Her-1抗体或巯基化的BSA
[0092]7.以Mill1-Q water为透析液，采用30k MffCO透析膜透析革巴向、非革巴向nanogel/5-FU 体系 12 小时
[0093]8.透析结束后，冷冻干燥该体系，采用D2O溶解，核磁共振鉴定抗体是否连接到微凝胶上面
[0094]对比分析靶向纳米药物复合体系和没有连接抗体的纳米药物复合体系的氢核磁谱不难发现，靶向纳米药物复合体系的氢核磁谱在3.6处有一个很明显的单峰，从而表明，抗体成功连接到纳米凝胶药物复合体系上。
[0095]实施例8、祀向纳米微凝胶药物装载与释放实验
[0096]1.载药量计算:载药量=体系中化疗药的浓度/载体浓度
[0097]2.靶向纳米凝胶载药体系药物释放检测:
[0098]取靶向与非靶向的纳米凝胶/5-FU复合体加入到100MffCO透析膜中，以220mlMill1-Q water为透析液,分别在37°C, 40°C条件下透析,不同时间点各取出0.5ml,紫外分光光度计在265nm波长处测试不同时间点样品的吸光值，计算对应时刻释放出的5-氟尿嘧啶浓度
[0099]结果如图4所示。5-Fu释放曲线显示:在37°C和40°C下,载药量为10.5%的微凝胶对5-Fu的释放可以起到缓空释放作用；相对于37°C下的药物释放,5-Fu在40°C下释放的速度更快。这是因为，温度敏感性微凝胶在40°C时，亲水性的外壳PNIPAM随着温度的上升向疏水转变，使得形成的核壳纳米粒子复合物在高温下会发生进一步“塌缩”，快速释放微凝胶包裹的5-Fu ；纳米凝胶药物复合物接上BSA或是抗体后，在37和40°C下对5_Fu的释放起到一定的缓释作用，药物的释放时间会略有延长，这是因为载体表面连接亲水性的BSA和抗体能够加强纳米凝胶和药物之间的相互作用，有利于药物在纳米载体中的稳定。
[0100]实施例9、靶向纳米微凝胶载药体系对乳腺癌细胞的杀伤实验
[0101]1.用 Mill1-Q water 稀释制备 6ml 0.5mg/ml 微凝胶溶液；
[0102]2.精密天平称取3mg 5-Fu,并加入到上述微凝胶溶液中，超声2min后，静置12h，即可形成微凝胶/5-Fu体系；
[0103]3.12h后，取出1.5mL微凝胶/5_Fu (nanogel/5-Fu)复合体，想剩余的4.5ml溶液中加入1.8mg mPEGs,混勻后室温下静置1h ;用1KMffCO的离心柱离心纯化nanogel/5-Fu复合体，nanogel/5-Fu/mPEGs 复合体；
[0104]4.离心后，nanogel/5-Fu 为 0.85ml,计算得到 nanogel 浓度为 882 μ g/ml, 5_Fu 浓度为93 μ g/ml，其载药量为10.5% ；
[0105]5.离心后，nanogel/5-Fu/mPEGs 为 6ml,向 3ml gel/5-Fu/mPEGs 中加入 6.79mg疏基化抗体，向另外3ml gel/5-Fu/mPEGs中加入2.262mg巯基化的BSA，混匀后，静止12小时；
[0106]6.细胞铺板:将处于对数生长期的人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞消化、离心计数，在96孔板中每孔放置5.0XlOVmL细胞，每孔加入100μ I含10% FCS的细胞培养液，放置在7% C02，37°C的细胞培养箱中；
[0107]7.细胞铺板 12 小时后，用 10^^03分别稀释861/5411461/5411/834461/5411/mAb 至 0.156，0.3125，0.625，1.25，2.5,5,10，20，40，80 μ g/ml，之后按照每孔 100 μ I 的量将不同浓度的溶液加入到96孔板中，并放置在7 % CO2, 370C的细胞培养箱中孵育6h后；将其中2快96孔板转至40°C，7 % CO2孵箱中孵育，另两块96孔板继续在37°C，7 % CO2孵箱中孵育；48h后，弃去旧的培养基，用PBS清洗细胞两次后，每孔加入含有10% CCK-8的细胞培养液在37°C中孵育2.5h，酶标仪检测细胞活性。
[0108]结果如图5所示，随着药物浓度的增大，细胞的存活率逐渐降低；相对于非靶向纳米载体药物复合体系和药物与凝胶载体对细胞毒性作用，抗体靶向组对细胞抑制效果显著要高于非靶向组和药物与凝胶载体组，这是因为抗体对肿瘤细胞上HER-1的靶向能够明显增强细胞对纳米药物载体的内吞，增强药物在细胞内的浓度从而有效杀死肿瘤细胞；图5B中的高温组(40°C )，非靶向组和靶向组，对细胞的抑制效果均好于37°C下的非靶向组和靶向组，但是游离药物5-Fu对细胞的抑制效果基本不受温度的影响，这是因为纳米凝胶载体具有一定的温度响应性，当温度升高时，具有温度敏感的载体从亲水性向疏水性转变，而细胞膜也具有疏水性，升高的温度能够增强纳米凝胶载体与细胞膜之间的相互作用，增强细胞对药物的内吞，从而升高温度有助于纳米凝胶药物复合体系对肿瘤细胞的杀伤效果。
[0109]实施例10:靶向、非靶向荧光微凝胶载体在乳腺癌小鼠肿瘤模型中的分布
[0110]裸鼠乳腺癌肿瘤模型的建立，方法如下:
[0111]购买的雌性Balb/c裸鼠(4周龄，约20g)，在进行皮下接种肿瘤细胞实验前，先在恒温(25-27 °C )、恒湿(45-50% )、新鲜空气高度除尘除菌、无特殊病原体(SPF级)环境下适应一周，动物饲养在有机玻璃饲养盒内，安放层流式超净架内，每只饲养盒内饲养5只动物，灭菌处理的水和饲料供动物自由摄入。观察一切正常后，方可进行后续实验；取对数生长期的人乳腺癌细胞株MDA-MB-231-luc细胞，用胰酶将处于对数生长期的MDA-MB-231-1uc细胞消化，用无菌PBS重悬细胞，制备成MDA-MB-231-1uc细胞悬液，调整细胞浓度至I X 17个/mL ;选取Balb/c裸鼠(雌性，5周龄，约20g)，取细胞