悬液接种至裸鼠右背部皮下，每只裸鼠接种的细胞数为IXlO7个；裸鼠精心饲养2周后，选择肿瘤生长良好，肿瘤体积长至约50mm3的裸鼠，作为实验模型，然后每只荷瘤裸鼠注射D-Luciferase底物的剂量为150mg/kg,通过小动物活体成像仪(Caliper LifeSciences,Hokpinton,MA)初步观察裸鼠乳腺癌模型的构建情况。
[0112]肿瘤体积计算公式:体积V =长X宽X宽/2。
[0113]当裸鼠的肿瘤体积达到50-60_3时，即可进行体内分布实验。
[0114]将荷瘤裸鼠随机分成3组，每组3只，分别通过尾静脉注射100 μ I/只包裹FITC的 PEI 溶液(PE1-FITC)和 100 μ I/ 只包裹 FITC 的纳米凝胶(PNIPAM/PE1-FITC，1.ν.)，以及通过瘤内给药100 μ I/只样品包裹FITC的纳米凝胶(PNIPAM/PE1-FITC，1.t.)，每只荷瘤裸鼠注射FITC荧光素的剂量为5mg/kg。每天注射I次，连续注射3天。
[0115]麻醉荷瘤裸鼠，分别在Oh (未注射样品前，作为空白对照)、6h、8h、12h和24h五个不同时间点用小动物活体成像仪考察三组纳米凝胶样品在裸鼠体内分布情况并拍照，激发波长为500nm。
[0116]24h后，对荷瘤裸鼠实施安乐死，取出裸鼠的肿瘤组织及心、肝脏、脾脏和肾脏主要组织，同时用小动物成像系统拍照，考察荧光高分子在主要组织的分布，激发波长为500nm。小鼠脏器冷冻包埋后，做冰冻切片DAPI染色5分钟、封片，之后采用confocal观测荧光高分子在肿瘤小鼠脏器内的分布。实验结果如图6所示:非靶向荧光微凝胶注射乳腺癌小鼠模型后，I小时的时间可以分布到全身部位。随着时间的延长，小鼠血液循环，3至6小时这一时间段，荧光高分子由体表位置开始进入机体内部。12至24小时后，非靶向荧光微凝胶仅在小鼠局部部位残留，肿瘤部位也未显示富集；靶向荧光微凝胶注射乳腺癌小鼠模型后，I小时的时间可以分布到全身部位，随着时间延长，小鼠血液循环，3至6小时这一时间段，荧光高分子由体表位置开始进入机体内部，12小时后，靶向荧光微凝胶明显富集在肿瘤部位，肾脏也有少量聚集，这是因为肾脏是机体主要的排泄器官。随着时间的延长至24小时，肾脏部位的微凝胶被代谢掉，而肿瘤部位仍然有较明显的富集。本实验在小鼠整体水平验证了靶向荧光微凝胶主要富集在小鼠肿瘤部位。
[0117]实施例11:靶向、非靶向5-氟尿嘧啶/微凝胶复合体抑瘤的研究
[0118]裸鼠乳腺癌肿瘤模型的建立，实验方法如实施例10所示:
[0119]当裸鼠肿瘤体积达到50-60_3时(即肿瘤生长进入增生阶段)，即可进行体内肿瘤生长抑制实验，体积计算公式如前所述；
[0120]将荷瘤裸鼠随机分成4组，包括对照组、靶向和非靶向nanogel/5-Fu和5_Fu组；通过尾静脉注射的方式将上述四组药物打入老鼠体内，每组5只。连续3天，每天注射一次，共计给药3次。注射药物后，每天测量小鼠肿瘤体积大小和体重变化，连续观测3周。根据每日测量肿瘤体积绘制小鼠肿瘤生长曲线图，评价靶向纳米凝胶载药体系体内肿瘤杀伤效果。
[0121]实验结果如图7所示:靶向5-氟尿嘧啶/微凝胶组可以明显抑制肿瘤的生长，3周之后，靶向5-Fu/微凝胶处理组小鼠体内的肿瘤完全被抑制了 ；而非靶向5-氟尿嘧啶/微凝胶组和单纯5-氟尿嘧啶组有一定的抑瘤效果，与阴性对照相比，肿瘤体积减小3倍左右，这是因为5-氟尿嘧啶是临床常用的化疗药物，其杀死肿瘤细胞能力比较强。非靶向组对肿瘤的抑制作用要好于游离药物组，是因为非靶向组纳米粒子在肿瘤体内具有EPR效应，增强纳米粒子在肿瘤的富集。
[0122]以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
【主权项】
1.一种双靶向递送化疗药物纳米体系，其特征在于，所述的药物纳米体系包括: 药物载体，以温度敏感性的聚N-异丙基丙烯酰胺为内核，以带正电荷的聚乙烯亚胺为夕卜壳; 化疗药物，为5-氟尿嘧啶； 药物载体通过电荷间的相互吸附装载5-氟尿嘧啶； 药物载体通过马来酰亚胺-聚乙二醇-琥珀酰亚胺乙酸酯连接抗Her-1抗体。2.根据权利要求1所述的一种双靶向递送化疗药物纳米体系，其特征在于，马来酰亚胺-聚乙二醇-琥珀酰亚胺乙酸酯通过mPEGs上马来酸酐中双键与巯基化抗Her-1抗体上的巯基发生加成反应，将抗Her-1抗体连接到mPEGs上，同时mPEGs上的琥珀亚酰胺与药物载体材料中的游离氨基发生取代反应。3.根据权利要求1或2所述的一种双靶向递送化疗药物纳米体系，其特征在于，所述的温度敏感性的聚N-异丙基丙烯酰胺，在32度是发生临界相转变行为。4.根据权利要求1或2所述的一种双靶向递送化疗药物纳米体系，其特征在于，所述的聚乙烯亚胺,分子量25KD,为分枝状。5.根据权利要求1或2所述的一种双靶向递送化疗药物纳米体系，其特征在于，所述的纳米粒径为300nm±25nm。6.一种如权利要求1所述的双靶向递送化疗药物纳米体系的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤: A、阳离子纳米凝胶PNIPAM/PEI的制备 先将PE1、NIPAM、N，N-亚甲基双丙烯酰胺溶于PBS中，向该PBS体系中通入N2除氧后，加入叔丁基过氧化氢，在80°C的油浴封闭环境下搅拌反应2-6h ;反应结束后，通入O2搅拌停止反应；37°C下，15000rpm离心纯化凝胶10—20min ;用去离子水重新溶解凝胶；用30KD的透析膜在Mill1-Q water中透析5_10天,制得阳离子纳米凝胶PNIPAM/PEI ； 所述的PE1、NIPAM、N，N-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)这三者的重量比例为4/6/0.1?6/4/0.1 ； B、靶向纳米凝胶包裹化疗药物5-Fu的制备 步骤A制备得到的阳离子纳米凝胶PNIPAM/PEI与带有一定负电荷的5-氟尿嘧啶溶于纳米凝胶溶液中，所述的纳米凝胶与5-氟尿嘧啶的质量比为1:1至1:5 ;然后再通过mPEGs将巯基化的抗Her-1抗体和纳米凝胶载体交联起来。7.根据权利要求6所述的双靶向递送化疗药物纳米体系的制备方法，其特征在于，步骤B中:所述的纳米凝胶与5-氟尿嘧啶的质量比为1:1至1:3 ;所述的巯基化抗Her-1抗体的质量与药物载体的质量比为1:10。8.根据权利要求6所述的双靶向递送化疗药物纳米体系的制备方法，其特征在于，所述的步骤B具体为: 步骤A制备得到的阳离子纳米凝胶PNIPAM/PEI与带有一定负电荷的5-氟尿嘧啶溶于纳米凝胶溶液中，超声2min，静置12小时后，形成粒径为300nm±25nm的微凝胶/5-FU体系；然后向微凝I父/5-FU体系中加入mPEGs,混勾后，室温下静止10小时；再加入疏基化抗Her-1抗体,将巯基化的抗体和纳米凝胶载体交联起来，形成抗体修饰的纳米凝胶载药复合体系。9.一种如权利要求1所述的双靶向递送化疗药物纳米体系在制备抗肿瘤药物中的应用。10.根据权利要求9所述的双靶向递送化疗药物纳米体系在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的肿瘤为对Her-1阳性的肿瘤。
【专利摘要】本发明涉及医药技术领域，本发明公开了一种双靶向递送化疗药物纳米体系、制备方法及其增强抗肿瘤应用。本发明的双靶向递送化疗药物纳米体系，其药物载体以温度敏感性的聚N-异丙基丙烯酰胺为内核，以带正电荷的聚乙烯亚胺为外壳；所装载的化疗药物为5-氟尿嘧啶；药物载体通过马来酰亚胺-聚乙二醇-琥珀酰亚胺乙酸酯还连接抗Her-1抗体。本发明的双靶向递送化疗药物纳米体系经实验结果表明具有良好的生物相容性，与游离药物相比，能够通过EPR效应、温敏和抗体多重靶向，增强药物在肿瘤部位的富集，增强其抗肿瘤作用的同时，大大降低了化疗药物的毒副作用。
【IPC分类】A61K47/32, A61K47/48, A61P35/00, A61K9/50, A61K31/513, A61K47/42
【公开号】CN105535988
【申请号】CN201410606230
【发明人】李威, 张歌, 张莉, 孙赟, 蒋成, 陈迪, 赵梦鑫, 柯长洪
【申请人】中国人民解放军第二军医大学
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2014年10月31日