。横切关节内初带。用憐 酸缓冲盐溶液清洗打开的关节。使用解剖刀片解剖出完整厚度的软骨片，并将其收集在含 有IOmM Hepes和1 %青霉素-链霉素的DMEM高糖溶液中。在含有IOmM Hepes和1 %青霉素-链 霉素的DMEM高糖溶液中清洗软骨片。
[0113] 然后将软骨依次用0.5mg/mL透明质酸酶消化30分钟，用1. Omg/mL链霉蛋白酶E消 化60分钟，用1. Omg/mL胶原酶在低速揽拌下过夜消化。在酶溫育后，用70WI1细胞滤网过滤细 胞悬浮液，W分离细胞群并去除组织碎片。离屯、该细胞悬浮液W沉淀细胞。弃去培养基，离 屯、清洗细胞沉淀物，将其重新悬浮在含有IOmM肥PES的0.9%氯化钢溶液中。
[0114] 将细胞悬浮在含有1.2%海藻酸盐的0.9%化CUlOmM肥阳S溶液中，W获得4.3X IO 6个细胞/血的密度。通过针头将悬浮液逐滴加入IO2HiM化亂溶液中。10分钟后，聚合微珠 并用0.9 %化Cl、1 OmM皿PES清洗微珠。在24孔培养板中，每个孔中沉积10个微珠，并加入 1血完全培养基(含有2mM k谷氨酷胺、0.5mg/血抗坏血酸、0.2mgAiL心脯氨酸和10 %胎牛 血清的DMEM高葡萄糖溶液）。细胞在培养基中培养2天，然后在存在或不存在白细胞介素 -Ia (lOng/mL)的情况下向其中加入W下物质进行处理橄揽苦巧、l.SiiM径基酪醇、1.5咖 搬皮素、1.5iiM姜黄素、1.5iiM橄揽苦巧+1.5iiM搬皮素、1.5iiM橄揽苦巧+1.5iiM姜黄素、1.5iiM 径基酪醇+1.5iiM搬皮素、1.5iiM径基酪醇+1.5iiM姜黄素、1.5iiM搬皮素+1.5iiM姜黄素、1.5iiM 橄揽苦巧+1.5iiM搬皮素+1.5iiM姜黄素、1.5iiM径基酪醇+1.5iiM搬皮素+1.5iiM姜黄素。W上处 理中加入的物质均溶解在二甲基亚讽(DMSO)中。DMSO的最终浓度为O. I %。细胞在运些物质 中处理3天。
[0115] 处理结束时，用0.1 M巧樣酸钢和0.15M氯化钢溶液清洗并重新悬浮微珠。离屯、悬浮 液，收集含有细胞的沉淀物，用于总RNA提取。
[0116] 利用凯杰公司（Qiagen)的RNeasy试剂盒从40个微珠中提取总RNA。利用宝生物公 司（Takara)的Primescript第一链cDNA合成试剂盒（Primescript 1st strand cDNA Syn化esis kit)反转录RNA，获得cDNA。通过实时定量PCR(SY服Green)进行ADAMTS-5、C0X-2、MMP-13和GAPDH的mRNA表达的定量分析。所用引物（来自家牛(Bos I'aurus))如下表1所 示：
[0117] 表1引物
[0120] 在患病条件下，添加化P、HTY、QRC或CUR可括抗化-Ia刺激的软骨细胞并降低MMP-13的表达。组合使用OLP、HTY、QRC或CUR中的S者具有协同效应。
[0121] 结果如下所示。图1至图3示出了细胞培养3天后ADAMTS-5、C0X-2和MMP-13的mRNA 表达（WGAPDH mRNA表达进行归一化）。数据表示为相对于阴性对照(完全培养基中培养的 细胞)的基因表达倍数变化。按照2-AAET方法计算结果。
[0122] Cll-:阴性对照
[0123] OLP:橄揽苦巧
[0124] HTY :径基酪醇
[012引 QRC:搬皮素
[0126] CUR:姜黄素
[0127] ILla:白细胞介素-la(l〇ng/mL)
[0128] 数据表示为中值±中值的标准误差(每一种进行两个实验，每个实验=次平行）。 依次用Kruskal Wallis检验和Mann Whitney U检验(双尾检验），将结果与阴性对照(CU-) 或白细胞介素-Ia(ILla)进行统计学分析，卸<0.05; **p<0.0 l; ***p<0.0 Ol。
[0129] 图IA示出了不存在ILla时（模拟正常细胞状态)ADAMTS-5mRNA相对于GAPDH的表 达。各条件与(：化-进行了统计比较。图1B示出了存在IL1 a时（模拟患病细胞状态)ADAMTS-SmRNA相对于GAPDH的表达。各条件与ILla进行了统计比较，而ILla与CTk进行了比较(实验 验证）。
[0130] 在正常条件下，添加化P、HTY、QRC或CUR可降低ADAMTS-5(软骨破坏的标志物）的表 达。组合使用运些不同的多酪具有协同效应。
[0131] 在患病条件下，添加化P、HTY、QRC或CUR可括抗IL-Ia刺激的软骨细胞并降低 ADAMTS-5的表达。组合使用运些不同的多酪具有协同效应。
[0132] 图2A示出了不存在ILla时(模拟正常细胞状态)C0X-2mRNA相对于GAPDH的表达。各 条件与Cll-进行了统计比较。
[0133] 图2B示出了存在ILla时(模拟患病细胞状态)C0X-2mRNA相对于GAPDH的表达。各条 件与ILla进行了统计比较，而ILla与CU-进行了比较(实验验证）。
[0134] 在正常条件下，添加 QRC可降低C0X-2(炎症状态的标志物）的表达。组合使用化P、 HTY、QRC或CUR中的两者或S者具有协同效应。在患病条件下，添加 QRC或CUR可括抗化-化刺 激的细胞并降低C0X-2的表达。组合使用0LP、HTY、QRC或CUR中的两者或S者具有协同效应。
[0135] 图3A示出了不存在ILla时（模拟正常细胞状态)MMP-13mRNA相对于GAPDH的表达。 各条件与CTk进行了统计比较。
[0136] 图3B示出了存在ILla时(模拟患病细胞状态)MMP-13mRNA相对于GAPDH的表达。各 条件与ILla进行了统计比较，而ILla与Cll-进行了比较(实验验证）。
[0137] 在正常条件下，单独或组合添加化P、HTY、QRC或CUR可降低MMP-13(参与细胞外基 质(与骨关节炎中的关节软骨转换有关)的分解)的表达。 巧13引 实例2
[0139] 在Dunkin^ladl巧豚鼠中进行骨关节炎的自发性发展的体外研究。从己黎查尔斯 河实验室（Qiarles River Laboratories)获得65只3周龄的雄性Dunkin-化；Ttley豚鼠。将 豚鼠分为5只一组，关在底部坚固的笼子中，豚鼠可自由进食标准豚鼠饮食和水。在施用植 物营养素之前，让所有动物适应居住条件一周。笼子加有PVC管，W改善居住条件并使应激 尽可能小。
[0140] 一周后，将65只4周龄的雄性Dunkin^ladl巧豚鼠随机分为3个处理组，分别接受 含有0.025%橄揽苦巧、0.5%芦下、0.5%芦下+0.25%姜黄素的饮食，对照组接受标准饮 食，连续喂养31周。基本纯化的橄揽苦巧（>90 % )从法国热奈的ExtrasyntheSe公司 化Xtrasynthese(Genay ,France))购得。基本纯化的芦下（>94% )从瑞：t布克斯的西格玛奥 德里奇公司（Sigma-Al化ich, Buchs, Switzer land)购得。基本纯化的姜黄素（>70 % )从瑞:t 布克斯的西格玛奥德里奇公司（Sigma-Al化ich, Buchs ,Switzer land)购得。
[0141] A组(n = 15)在31周中接受日剂量的橄揽苦巧。
[0142] B组(n = 15)在31周中接受标准饮食(对照组）。
[0143] C组(n = 15)在31周中接受日剂量的芦下。
[0144] D组(n = 15)在31周中接受日剂量的芦下和姜黄素。
[0145] E组(n = 5，参照组)实施安乐死且不接受任何干预。
[0146] 将橄揽苦巧、芦下和姜黄素添加在饮食中。每周对动物进行称重并用微忍片进行 鉴定。第9、15、21、26、34周时，每天对所添加食物和剩余食物进行称重，W控制豚鼠的食物 摄入量。
[0147] 在早晨对豚鼠注射氯胺酬/甲苯嚷嗦使其保持镇定状态，在耳表静脉处采集空腹6 小时的血液，每6周进行一次:第4周（=TO)、第10周、第16周、第22周、第28周。第35周时，对 豚鼠实施全身麻醉，通过屯、脏穿刺采集血液，然后对其实施安乐死。
[014引完成屯、脏穿刺血液采集后，对豚鼠进行称重，然后WlOOmg/kg戊己比妥钢对动物 实施安乐死。观察主要器官（屯、脏、消化道和泌尿道、肾上腺），检测是否有异样。对肝脏和肾 上腺进行称重。将每只动物的右膝关节在4%多聚甲醒缓冲液中固定24小时，然后4°C下在 盐酸(DC2，比利时Labonord公司）中脱巧4小时，最后用石蜡包埋。
[0149] 按照国际骨关节炎研究学会(OARSI)推荐的CusMn平面(Cushin plane),在未被 半月板覆盖的中屯、区域，用超薄切片机(妹卡公司化eica))将石蜡包埋后的右膝切为6皿厚 的切片。将S个间距为200WI1的切片用苏木精、固绿和番红0染色，另取一张中屯、切片，用甲 苯胺蓝染色。盲选两位经过训练的专家，按照OARSI的推荐对切片的每个隔室(腔骨内侧、腔 骨外侧、股骨内侧和股骨外侧)进行评分，并综合每个隔室的评分来评估软骨总评分。结果 示于图4和图5中。两位盲选的经过训练的专家按照OARSI的推荐对外侧滑膜和内侧滑膜进 行了评分，并计算外侧滑膜和内侧滑膜的平均值W评估滑膜总评分。结果示于图11至图13 中。
[0150] 如图5所示，与对照组相比，橄揽苦巧组、芦下组和芦下+姜黄素组的骨关节炎评分 显著降低(P<〇.〇l)。
[0151] 明显地，如图11A、图12A和图13A所示，与对照组相比，橄揽苦巧组的滑膜评分显著 降低(p<0.05)。在对照组中，滑膜评分与骨关节炎评分正相关（图11B、图12B和图13B)。
[0152] 使用竞争法化ISA试剂盒(美国Arbor Assays公司）测量豚鼠血清中的PGE2。结果 示于图6中。用橄揽苦巧处理35周后，可降低血浆中的PGE2水平。但是，芦下和姜黄素对PGE2 水平仅具有非显著的影响，表明芦下和姜黄素主要对软骨分解起作用。
[0153] 血浆中的PGE2水平可与骨关节炎评分正相关。运表明，在豚鼠模型中，PGE2是与骨 关节炎发生和发展有关的生物标志物，并且可用于评估处理效果。
[0154] 亚硝基化表位Co 112-1N02位于II型胶原的螺旋结构域，其在豚鼠血清中的含量通 过兔多克隆抗血清的竞争法化ISA(D37)(比利时Artialis公司）来定量，进行S次平行实 验。CO112-1N02免疫分析W高度的特异性和亲和性对硝化氨基酸序列进行定量。结果示于 图巧P图8中。
[0155] 用橄揽苦巧、芦下和芦下+姜黄素处理可减少胶原降解(通过血浆中的CO112-1N02 水平测定）dCo112-1N02含量与骨关节炎评分正相关。运表明，在豚鼠模型中，CO112-1N02是 与骨关节炎发生和发展有关的生物标志物，并且可用于评估处理效果。
[0156] Fib3-1是Fibul in-3的片段，其含量在骨关节炎患者的血清中有所增加。門b3-l在 豚鼠血清中的含量通过兔多克隆抗血清的竞争法化ISA(ASSS)(比利时Artialis公司）来定 量，进行=次平行实验。结果示于图9和图10中。
[0157] 用芦下处理和用芦下+姜黄素处理可