、聚碳酸醋、聚对苯二甲酸乙二醋构成的容器。容器 底面的形状优选为平底型、U字型、V字型。
[0161 ]上述方法中所得到的镶嵌状细胞构建体例如能够通过
[0162] (a)使个别调整的镶嵌状细胞块彼此融合、或
[0163] (b)在分化培养基或增殖培养基中增加体积
[0164] 等方法来制造所希望大小的细胞构建体。融合方法、增加体积的方法并没有特别 限定。
[0165] 例如，在对生物相容性高分子块体与含细胞的培养液的混合物进行解化的工序 中，能够通过将培养基更换为分化培养基或增殖培养基来使细胞构建体的体积增加。优选 在对生物相容性高分子块体与含细胞的培养液的混合物进行解化的工序中，能够通过进一 步添加生物相容性高分子块体来制造所希望的大小的细胞构建体中细胞均匀地存在的细 胞构建体。
[0166] 所述使个别调整的镶嵌状细胞块彼此融合的方法具体是指包含使多个细胞构建 体融合的工序的细胞构建体的制造方法，该细胞构建体含有多个生物相容性高分子块体及 多个细胞，且在由所述多个细胞形成的多个间隙的一部分或全部中配置有一个或多个所述 生物相容性高分子块体。
[0167] 本发明的细胞构建体的制造方法所设及的"生物相容性高分子块体（种类、大小 等r、"细胞'、"细胞间的间隙"、"所得到的细胞构建体化小等r、"细胞与高分子块体的比 率"等的优选范围与本说明书中前述的范围相同。
[0168] 并且，优选所述融合前的各细胞构建体的厚度或直径为10皿W上且IcmW下，所述 融合后的厚度或直径为400皿W上且3cmW下。在此，作为所述融合前的各细胞构建体的厚 度或直径更优选为10皿W上且2000皿W下，进一步优选为15皿W上且1500皿W下，最优选 为20皿W上且1300皿W下，并且，作为所述融合后的厚度或直径范围更优选为500皿W上且 2cmW下，进一步优选为720皿W上且IcmW下。
[0169] 前述通过进一步添加生物相容性高分子块体来制造所希望大小的细胞构建体的 方法具体是指包含在细胞构建体中进一步添加第二生物相容性高分子块体来进行解化的 工序的细胞构建体的制造方法，该细胞构建体含有多个第一生物相容性高分子块体及多个 细胞，且在由该多个细胞形成的多个间隙的一部分或全部中配置有一个或多个所述生物相 容性高分子块体。在此，"生物相容性高分子块体（种类、大小等)"、"细胞"、"细胞间的间 隙"、"所得到的细胞构建体(大小等r、"细胞与高分子块体的比率"等的优选范围与本说明 书中前述的范围相同。
[0170] 在此，欲融合的细胞构建体彼此优选WOW上且50皿W下的距离设置，更优选为0 W上且20皿W下的距离，进一步优选为OW上且5皿W下的距离。认为在使细胞构建体彼此 融合时，通过细胞的增殖、伸展，细胞或细胞所产生的基质发挥粘附剂的作用而使细胞构建 体接合，通过设为上述范围，细胞构建体彼此容易粘附。
[0171] 作为通过本发明的细胞构建体的制造方法而得到的细胞构建体的厚度或直径范 围，优选为400皿W上且3cmW下，更优选为500皿W上且2cm W下，进一步优选为720皿W上 且IcmW下。
[0172] 向细胞构建体中进一步添加第二生物相容性高分子块体来进行解化时的、第二生 物相容性高分子块体的添加速度优选根据所使用的细胞的增殖速度适当选择。具体而言， 若添加第二生物相容性高分子块体的速度较快，则细胞向细胞构建体的外侧移动，细胞的 均匀性降低，若添加速度较慢，则会形成细胞的比例增加的部位，细胞的均匀性降低，因此 考虑所使用的细胞的增殖速度来进行选择。
[0173] 作为含有非血管系细胞及血管系细胞运两者时的细胞构建体的制造方法，例如可 W优选举出下述(a)~(C)的制造方法。
[0174] (a)为在使用非血管系细胞并利用前述方法来形成细胞构建体之后具有加入血管 系细胞及生物相容性高分子块体的工序的制造方法。在此，"加入血管系细胞及高生物相容 性分子块体的工序"包含前述的、使经调整的镶嵌状细胞块彼此融合的方法及在分化培养 基或增殖培养基中增加体积的方法中的任何一种。通过该方法，能够制造如下细胞构建体： (i)在细胞构建体的中屯、部，非血管系细胞的面积大于血管系细胞，且在周边部，血管系细 胞的面积大于非血管系细胞的细胞构建体；（ii)细胞构建体的中屯、部的非血管系细胞的面 积大于周边部的非血管系细胞的面积的细胞构建体、（iii)细胞构建体的中屯、部的血管系 细胞的面积小于周边部的血管系细胞的面积的细胞构建体。
[0175] (b)为在使用血管系细胞并利用前述方法来形成细胞构建体之后具有加入非血管 系细胞及生物相容性高分子块体的工序的制造方法。在此，"加入非血管系细胞及生物相容 性高分子块体的工序"包含前述的、使经调整的镶嵌状细胞块彼此融合的方法及在分化培 养基或增殖培养基中增加体积的方法中的任何一种。通过该方法，能够制造如下细胞构建 体：（i)在细胞构建体的中屯、部，管系细胞的面积大于非血管系细胞，且在周边部，非血管系 细胞的面积大于血管系细胞的细胞构建体；（ii)细胞构建体的中屯、部的血管系细胞的面积 大于周边部的血管系细胞的面积的细胞构建体；（iii)细胞构建体的中屯、部的非血管系细 胞的面积小于周边部的非血管系细胞的面积的细胞构建体。
[0176] (C)为实际上同时使用非血管系细胞及血管系细胞并利用前述方法来形成细胞构 建体的制造方法。该方法能够制造在细胞构建体的任何部位非血管系细胞及血管系细胞中 的任意一者均不会大幅偏在的细胞构建体。
[0^7]从移植后在移植部位形成血管的观点考虑，优选为:在细胞构建体的中屯、部，血管 系细胞的面积大于非血管系细胞，且在周边部，非血管系细胞的面积大于血管系细胞的细 胞构建体;或中屯、部的血管系细胞的面积大于周边部的血管系细胞的面积的细胞构建体， 通过设为该细胞构建体，能够更加促进血管形成。并且，在该细胞构建体中，存在于中屯、部 的细胞数量较多时能够更加促进血管形成。
[0178] 同理，优选在由血管系细胞形成细胞构建体之后具有加入非血管系细胞及生物相 容性高分子块体的工序的制造方法。而且，进一步优选增加血管系细胞数量。
[0179] (8)细胞构建体的用途
[0180] 本发明的细胞构建体例如可W W对重症屯、力衰竭、重度屯、肌梗塞等屯、脏疾病、脑 缺血、脑梗塞等疾病部位移植细胞的目的进行使用。并且，也可W针对糖尿病性肾、膜、末梢 神经、眼、四肢的血液循环障碍等疾病进行使用。作为移植方法，可W使用切开、注射、内窥 镜等方法。本发明的细胞构建体与细胞片等细胞移植物不同，能够减小构建体的尺寸，因此 能够实现基于注射的移植等低侵入的移植方法。
[0181 ]并且，根据本发明，提供一种细胞移植方法。本发明的细胞移植方法的特征在于使 用所述本发明的细胞构建体。细胞构建体的优选范围与前述的范围相同。
[0182] 通过W下实施例对本发明进行进一步具体的说明，但本发明并不受实施例的限 定。
[0183] 实施例
[0184] [材料及容器]
[018引[重组肤(重组明胶）]
[0186] 作为重组肤(重组明胶），准备W下所记载的CBE(记载于W02008-103041中）。
[0187] C邸 3
[018引分子量：51.化D
[0189] 结构:GAP[(GXY)63]3G
[0190] 氨基酸数量:571个
[0191] RGD序列：12个
[0192] 亚氨基酸含量:33%
[0193] 大致100%的氨基酸为GXY的重复结构。CBE3的氨基酸序列中不含丝氨酸、苏氨酸、 天冬酷胺、酪氨酸及半脫氨酸。CBE3具有ERGD序列。
[0194] 等电点：9.34、GRAVY值：-0.682、1/10B值：0.323
[0195] 氨基酸序列(序列表的序列号1)(与W02008/103041号公报的序列号3相同。但末尾 的X修正为甲'）
[0197] [PIPE厚?圆筒形容器]
[019引准备底面厚度3mm、直径51mm、侧面厚度8mm、高度25mm的聚四氣乙締(PT阳）审麵筒 杯状容器。就圆筒杯而言，将曲面作为侧面时，侦晒由8mm的PTFE封闭，底面(平板的圆形状） 也由3mm的PTFE封闭。另一方面，上面呈开放的形状。因此，圆筒杯的内径成为43mm。W下，将 该容器称作PTFE厚?圆筒形容器。
[0199] [侣玻璃板?圆筒形容器]
[0200] 准备厚度1mm、直径47mm的侣制圆筒杯状容器。就圆筒杯而言，将曲面作为侧面时， 侧面由Imm的侣封闭，底面（平板的圆形状）也由Imm的侣封闭。另一方面，上面呈开放的形 状。并且，仅在侧面的内部均匀地敷满壁厚Imm的特氣龙(注册商标)的结果，圆筒杯的内径 成为45mm。并且，使该容器的底面呈在侣的外侧接合2.2mm的玻璃板的状态。W下，将该容器 称作侣玻璃?圆筒形容器。
[0201] [实施例1]
[0202] [差溫较小的冷冻工序及干燥工序]
[0203] 向PTFE厚?圆筒形容器、侣玻璃板?圆筒形容器中流入CBE3水溶液，在真空冷冻 干燥机(T巧-85ATNNN:TAKARA Co. ,Ltd.)内，使用冷却搁板从底面开始冷却CBE3水溶液。
[0204] 如W下所记载，准备此时的容器、C肥3水溶液的最终浓度、液量及搁板溫度的设定 的组合。
[0205] "A"PWE厚?圆筒形容器、C肥3水溶液的最终浓度4质量％、水溶液量4mL。就搁板 溫度的设定而言，冷却至-10°C，在-10°c下进行1小时冷冻，其后在-20°c下进行2小时冷冻， 进而在-40°C下进行3小时冷冻，最后在-50°C下进行1小时冷冻。其后，使搁板溫度恢复-20 °C设定之后，在-2(TC下进行24小时的真空干燥，24小时后直接W继续进行真空干燥的状态 使搁板溫度上升至20°C，进而在20°C下实施48小时的真空干燥直至真空度充分下降（1.9X IO 5Pa)之后，从真空冷冻干燥机中取出本冷冻品。由此得到多孔体。
[0206] "B"侣玻璃板?圆筒形容器、C肥3水溶液的最终浓度4质量％、水溶液量4mL。就搁 板溫度的设定而言，冷却至-10°C，在-10°c下进行1小时冷冻，其后在-20°c下进行2小时冷 冻，进而在-40°C下进行3小时冷冻，最后在-50°C下进行1小时冷冻。其后，使搁板溫度恢复-20°C设定之后，在-2(TC下进行24小时的真空干燥，24小时后直接W继续进行真空干燥的状 态使搁板溫度上升至20°C，进而在20°C下实施48小时的真空干燥直至真空度充分下降（1.9 X IO5Pa)之后，从真空冷冻干燥机中取出本冷冻品。由此得到多孔体。
[0207] "C'PTFE厚?圆筒形容器、CBE3水溶液的最终浓度4质量％、水溶液量lOmL。就搁板 溫度的设定而言，冷却至-10°C，在-10°c下进行1小时冷冻，其后在-20°c下进行2小时冷冻， 进而在-40°C下进行3小时冷冻，最后在-50°C下进行1小时冷冻。其后，使搁板溫度恢复-20 °C设定之后，在-2(TC下进行24小时的真空干燥，24小时后直接W继续进行真空干燥的状态 使搁板溫度上升至20°C，进而在20°C下实施48小时的真空干燥直至真空度充分下降（1.9X IO 5Pa)之后，从真空冷冻干燥机中取出本冷冻品。由此得到多孔体。
[020引[比较例1]
[0209] [差溫较大的冷冻工序及干燥工序]
[0210] 向侣玻璃板.圆筒形容器中流入CBE3水溶液4mL，在冷冻库内，使用冷却搁板从底 面开始冷却CBE3水溶液。如W下所记载，准备此时的容器、CBE3水溶液的最终浓度、液量及 搁板溫度的设定的组合。并且，在预先充分冷却至搁板溫度成为设定溫度的部位设置装有 CBE3水溶液的容器，由此实施冷冻。
[0211]"护侣玻璃板?圆筒形容器、C肥3水溶液的最终浓度4质量％、水溶液量4mL。就搁 板溫度的设定而言，设为在预先冷却至-60°C的部位放置装有CBE3水溶液的侣玻璃板?容 器的形式，搁板溫度仍维持-60°C来进行冷冻。其后，对本冷冻品进行冷冻干燥，从而得到多 孔体。
[0引引"护侣玻璃板?圆筒形容器、C邸3水溶液的最终浓度7.5质量％、水溶液量4mL。就 搁板溫度的设定而言，设为在预先冷却至-60°C的部位放置装有CBE3水溶液的侣玻璃板? 容器的形式，搁板溫度仍维持-60°C来进行冷冻。其后，对本冷冻品进行冷冻干燥，从而得到 多孔体。
[0213] 叩"侣玻璃板e圆筒形容器、C肥3水溶液的最终浓度4质量％、水溶液量4mL。就搁板 溫度的设定而言，设为在预先冷却至-40°C的部位放置装有CBE3水溶液的侣玻璃板?容器 的形式，搁板溫度仍维持-40°C来进行冷冻。其后，对本冷冻品进行冷冻干燥，从而得到多孔 体。
[0214] [实施例2]
[0215] [各冷冻工序中的差溫测定]
[0216] 对于"A"~"F"的每一个，测定容器内的圆中屯、部的水表面液溫作为溶液内最远离 冷却侧的部位的液溫(非冷却面液溫），并且测定容器内的底部的液溫作为溶液内最靠近冷 却侧的液溫(冷却面液溫）。
[0217] 其结果，各自的溫度与其差溫的轮廓如图1~图6所示。
[0引8]由该图1、图2、图3可知，"A"、"B"、中，在搁板溫度-10°C设定区间（下降至-20°C 度之前)液溫低于烙点即(TC,且处于在该状态下不会发生冷冻的（未冷冻?过冷却)状态。 并且，在该状态下，冷却面液溫与非冷却面液溫的差溫为2.5°C W下。其后，通过使搁板溫度 进一步下降至-20°C，可确认到液溫急剧上升至(TC附近的时刻，可知在此处产生凝固热而 开始冷冻。并且，也能够确认到在该时刻实际开始形成冰。其后，溫度在(TC附近经过一定时 间。在此，处于存在水与冰的混合物的状态。最后，溫度从(TC再次开始下降，此时，液体部分 消失，成为冰。因此，测定的溫度成为冰内部的固体溫度即并非液溫。
[0219] W下，关于"A"、"B"、"C"，记载非冷却面液溫成为烙点（(TC)时的差溫、搁板溫度 由-10°C即将下降至-20°c之前的差溫、及即将产生凝固热之前的差溫。另外，本发明中所说 的"即将~之前的差溫"表示能够在该事件的1秒前~20秒前期间检测的溫度差之中最高的 溫度。
[0220] X
[0221 ]非冷却面液溫成为烙点((TC)时的差溫:1. rc
[0222] 由-1 (TC即将下降至-20°C之前的差溫:0.2°C
[0223] 即将产生凝固热之前的差溫:1. rc
[0224] '屯"
[022引非冷却面液溫成为烙点((TC)时的差溫:1.(TC
[0226] 由-1 (TC即将下降至-20°c之前的差溫:0. rc
[0227] 即将产生凝固热之前的差溫:0.9°C
[022引（'C'
[0229] 非冷却面液溫成为烙点((TC)时的差溫:1.8°C
[0230] 由-10 r即将下降至-20 r之前的差溫:1. rc
[0231] 即将产生凝固热之前的差溫:2.rc
[0232] W下，将运些称作"差溫较小的冷冻工序.多孔体"。
[0233] 并且，关于"护、"护、T'，由图4~图6可知，通过在-40°C或-60°C的搁板上急速冷 却，在液溫成为烙点即〇°CW下的状态(未冷冻状态?过冷却状态)下，差溫为4°CW上，在即 将产生凝固热之前处于差溫较大的状态。
[0234] W下，关于"护、吧'、"户'，记载非冷却面液溫成为烙点（(TC)时的差溫和即将产生 凝固热之前的差溫。
[0235]
[0236] 非冷却面液溫成为烙点((TC )时的差溫:5.4°C
[0237] 即将产生凝固热之前的差溫:4.2°C [023引"护