壳聚糖金属配合物微粒作为基于活性氧响应给药载体的应用
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及一种材料的新应用，特别涉及壳聚糖金属配合物微粒作为基于活性氧 响应给药载体的应用。
【背景技术】
[0002] 氧化应激会导致体内活性氧(Reactive oxygen species, R0S)含量的变化，氧化 响应性材料可根据ROS含量的变化自发地改变材料的宏观或微观性质，其变化的结果主要 包括材料的溶胀、溶解或特定的收缩、硬化等。这类针对于体内氧化微环境变化的材料主要 用于增强药物载体的靶向性，现阶段研究较多的是通过化学修饰的人工合成材料，包括有 机金属聚合物、有机共辄聚合物、含杂原子的有机聚合物。人工合成的氧化响应材料，虽然 与ROS反应活性高，但是它们的制备条件、保存条件要求相对较高，对细胞毒性大，体内滞留 量大，对人体的免疫反应性强，这一系列问题一定程度上限制了合成氧化响应材料在医药 领域的使用。基于此，现在人们越来越重视一些具有氧化响应特性的天然产物，以期避免化 学合成材料的一系列缺陷。
[0003] 壳聚糖金属配合物(CS-Met)是壳聚糖或其衍生物和金属离子反应生成的一种材 料。以壳聚糖或改性壳聚糖为基质，配合金属离子所得壳聚糖基金属配合物材料具有许多 优异的性能，在酶固定化剂、分离膜、人工尿素吸附剂、纳米微晶的生长诱导剂、化学催化 剂、植物生长调节剂以及金属分离及含量检测等领域有着良好的应用前景（尹学琼，孙中 亮，林强等.壳聚糖基金属配合物材料及其应用现状[J].昆明理工大学学报）。
[0004] 杨自芳.壳聚糖及其衍生物金属配合物的合成、表征和抗菌抗癌性能研究[D].上 海师范大学，2010,采用壳聚糖及其衍生物和稀土硝酸盐及过渡金属盐为原料，运用回流冷 凝法和沉淀法，合成了一系列新型的壳聚糖及其衍生物金属配合物CTS/RE (RE=La3+，Ce3 +，Ce4+，Pr3+，Nd3+，Sm3+，Eu 3+，Y3+，Er3+，Gd3+; CTS为壳聚糖及其衍生物），发现配合物对实验用 菌都具有较好的抑制作用，属于广谱抗菌剂，具有良好的抗菌耐久性和长效性，并且配合物 对金黄色葡糖球菌的抗菌能力大于对大肠杆菌的抗菌能力。此外，还对部分配合物进行体 外抗癌活性测试研究，实验靶细胞是人慢性粒细胞性白血病K562细胞。实验中分别应用倒 置光显镜、荧光显微镜和透射电子显微镜等对K562细胞及配合物作用后的细胞进行形态观 察研究，运用MTT法进行细胞活性检测，利用流式细胞仪检测配合物作用后凋亡细胞率。抗 肿瘤实验结果表明壳寡糖铈配合物对K562肿瘤细胞的生长和增殖有明显的抑制作用，与对 照组相比有显著差异性，抑制率在一定范围内随剂量的增大而提高。
[0005] 现有的研究主要集中于壳聚糖金属配合物的抗菌、抗肿瘤活性，但是目前还未见 有使用壳聚糖金属配合物微粒作为氧化响应性药物载体的报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供壳聚糖金属配合物微粒作为基于活性氧响应给药载体的 应用。
[0007]本发明所采取的技术方案是： 一种具有活性氧(过氧化氢)响应的壳聚糖金属配合物微粒，壳聚糖的重均分子量为60 kDa~250 kDa，脱乙酰度为80~95%，金属离子为二价或三价金属离子。
[0008]微粒为微米级微粒及纳米级微粒，特别包括粒径在10 nm~1 μL?之间的微粒。
[0009] 作为上述壳聚糖金属配合物微粒的进一步改进，金属离子选自铜离子、钙离子、锌 呙子、铁呙子。
[0010] 壳聚糖金属配合物中金属离子的配合量可以根据需要进行调节，优选地，金属离 子的配合量为其最大配合量的50~100%，最佳为50~90%。最大配合量定义将壳聚糖或壳聚 糖微粒与足量对应金属离子的水溶性盐混合并充分反应后所能配合的极限。特别的，壳聚 糖与金属盐的投料质量比为（1:1)~（5 : 1)，更佳的为（1:1)~（2.5 :1)，进一步优选为 (1.67:1)~（2.5:1)〇
[0011] 上述壳聚糖金属配合物微粒的制备方法，包括如下步骤： 1)将壳聚糖微粒与一种金属离子的水溶性盐溶液混合，制备得到壳聚糖金属配合物微 粒，其中，壳聚糖的重均分子量为60 k~250 kDa，脱乙酰度为80~95%(Α型载体）； 或 a) 将壳聚糖与一种金属离子的水溶性盐溶液混合，制备得到壳聚糖金属配合物； b) 将壳聚糖金属配合物与多聚磷酸钠混合，通过离子交联法制备得到壳聚糖金属配合 物微粒(B型载体）； 其中，壳聚糖的重均分子量为60 k~250 kDa，脱乙酰度为80~95%。
[0012] 作为上述制备方法的进一步改进，制备壳聚糖金属配合物或壳聚糖金属配合物微 粒时，壳聚糖或壳聚糖微粒与金属盐的投料质量比为（1:1)~(5:1)，优选为（1:1)~（2.5: 1 )，进一步优选为（1.67:1)~（2.5:1)，反应温度为20~30°C，磁力搅拌器转速为100~200 rpm，反应时间为1~4 h。质量比指干重时的质量比。
[0013]作为上述制备方法的进一步改进，步骤1)制备壳聚糖微粒或步骤b)制备壳聚糖金 属配合物微粒时，壳聚糖与多聚磷酸钠的质量比为6.25:1，反应温度为20~30°C，磁力搅拌 器转速为500~600 rpm，反应时间为20 min~60 min，pH为5.3~5.5。
[0014] 特别地，壳聚糖金属配合物微粒的制备方法，包括如下步骤： 1) 将壳聚糖溶于1%醋酸溶液中充分搅拌Ih，用1.0 moI/L的氢氧化钠溶液调节pH值至 5.3~5.5后搅拌0.5 h，将8.0 mL多聚磷酸钠溶液(1.0 mg/mL)在500~600 rpm转速下缓慢 滴加到20 mL壳聚糖醋酸溶液(2.5 mg/mL)中，混合反应0.5 h后，3000 rpm离心10 min取上 清液，冷冻干燥后即得壳聚糖微粒； 2) 将壳聚糖微粒溶液和金属盐溶液混合反应3h后，3000rpm离心10min取上清液，冷冻 干燥后即得壳聚糖金属配合物微粒(A型载体）。
[0015] 或包括如下步骤： a) 壳聚糖水溶液与金属盐溶液反应3h，然后室温静置，抽滤取沉淀，用3倍体积蒸馏水 和3倍体积无水乙醇依次洗涤3次，产物真空干燥即得壳聚糖金属配合物； b) 将壳聚糖金属配合物溶解在1%醋酸溶液中充分搅拌lh，然后用1.0m〇l/L的氢氧化钠 溶液调节pH值至5.3~5.5后搅拌0.5 h，再将8.0 mL多聚磷酸钠溶液（1.0 mg/mL)在500~ 600 rpm转速下缓慢滴加到20 mL壳聚糖金属配合物溶液（2.5 mg/mL)中，混合反应0.5 h 后，3000 rpm离心10 min取上清液，冷冻干燥即得壳聚糖金属配合物微粒(B型载体）。
[0016] 壳聚糖金属配合物微粒作为基于活性氧响应给药载体的应用，其中壳聚糖金属配 合物微粒如上所述，或上述的制备方法制备得到。
[0017] 本发明的有益效果是： 根据体外紫外浊度测定、尼罗红体外释放试验试验结果，发现不同方法制备得到的壳 聚糖金属配合物微粒均具有很好的氧化响应性，在金属离子的存在条件下两种微粒的氧化 响应速率和体外释放效率都有显著的提高;并且A型载体的氧化响应能力较B型载体强;各 金属离子配位的氧化敏感性也有所不同，以铜离子配合后的敏感性最强。根据细胞毒性实 验和组织相容性实验结果，A型载体和B型载体对组织器官均无明显的炎症反应，显示出良 好的组织相容性。
[0018] 壳聚糖金属配合物微粒有望开发为基于活性氧的智能响应性新型药物载体。
【附图说明】
[0019] 图1~9是不同壳聚糖金属配合物微粒在过氧化氢下紫外浊度的检测结果； 图10~12是不同壳聚糖金属配合物微粒包载尼罗红后在过氧化氢条件下的荧光强度 检测结果； 图13~21是不同分子量壳聚糖金属配合物微粒包载尼罗红后在过氧化氢条件下的荧 光强度检测结果； 图22和23是不同壳聚糖金属配合物微粒的细胞毒性实验结果； 图24和25是壳聚糖钙离子配合物微粒A型载体和B型载体的组织相容性实验结果。
【具体实施方式】
[0020] 壳聚糖微粒的制备 参考Fan, ff. , et al. ,