Formation mechanism of monodisperse, low molecular weight chitosan nanoparticles by ionic gelation technique[J]. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2012. 90(21): p. 21-27.公开的方法，依据离子凝胶法原 理制备壳聚糖微粒(CSNPs)的具体步骤为:将50 mg壳聚糖溶解在1%醋酸溶液中形成浓度 为2.5 1^/11^的壳聚糖溶液，磁力搅拌111后，用1.〇111〇1/1氢氧化钠溶液调?!1到5.3-5.5，继 续搅拌0.5 h。再将8.0 mL多聚磷酸钠溶液（1.0 mg/mL)在500~600 rpm转速下缓慢滴加到 20 mL壳聚糖醋酸溶液中，混合反应0.5 h后，离心(3000 rpm)10 min后取上清液，冷冻干燥 即得CSNPs。
[0021] 壳聚糖金属配合物微粒CSNPs-MetU型载体)的制备 壳聚糖微粒-铜离子配合物(CSNPs-Cu)的制备 5 mL氯化铜溶液(4.0 mg/mL)与20 mL壳聚糖微粒(2.5 mg/mL)混合，200 rpm磁力搅 拌约3 h，离心（3000 rpm)10 min后取上清液，冷冻干燥即得CSNPs-Cu。使用的壳聚糖重均 的分子量为60 kDa，脱乙酰度为95%。
[0022]壳聚糖微粒-钙离子配合物(CSNPs-Ca)的制备 5 mL氯化|丐溶液(6.0 mg/mL)与20 mL壳聚糖微粒(2.5 mg/mL)混合，200 rpm磁力搅 拌约3 h，离心（3000 rpm)10 min后取上清液，即得冷冻干燥CSNPs-Ca。使用的壳聚糖重均 的分子量为100 kDa，脱乙酰度为89%。
[0023]壳聚糖微粒-锌离子配合物(CSNPs-Zn)的制备 5 mL硫酸锌溶液(6.0 mg/mL)与20 mL壳聚糖微粒(2.5 mg/mL)混合，200 rpm磁力搅 拌约3 h，离心（3000 rpm)10 min后取上清液，即得冷冻干燥CSNPs-Zn。使用的壳聚糖重均 的分子量为150 kDa，脱乙酰度为80%。
[0024]壳聚糖微粒-铁离子配合物(CSNPs-Fe)的制备 5 mL硫酸铁溶液(6.0 mg/mL)与20 mL壳聚糖微粒(2.5 mg/mL)混合，200 rpm磁力搅 拌约3 h，离心（3000 rpm)10 min后取上清液，冷冻干燥即得CSNPs-Fe。使用的壳聚糖重均 的分子量为250 kDa，脱乙酰度为86%。
[0025]壳聚糖金属配合物微粒(CS-Me t )NPs (B型载体)的制备 壳聚糖-铜离子配合物(CS-Cu)的制备 5 mL氯化铜溶液(4.0 mg/mL)与20 mL壳聚糖水混悬液(2.5 mg/mL)混合，200 rpm磁力 搅拌约3 h，反应温度为20~30°C，静置使沉淀聚集，真空水栗抽滤，用3倍体积的蒸馏水洗涤 3次，再用无水乙醇洗涤3次。洗涤完毕后将产物室温真空干燥，即得CS-Cu。使用的壳聚糖重 均的分子量为60 kDa，脱乙酰度为95%。
[0026]壳聚糖-钙离子配合物(CS-Ca)的制备 5 mL氯化|丐溶液(6.0 mg/mL)与20 mL壳聚糖水混悬液(2.5 mg/mL)混合，200 rpm磁力 搅拌约3 h，反应温度为20~30°C，静置使沉淀聚集，真空水栗抽滤，用3倍体积的蒸馏水洗涤 3次，再用无水乙醇洗涤3次。洗涤完毕后将产物室温真空干燥，即得CS-Ca。使用的壳聚糖重 均的分子量为100 kDa，脱乙酰度为89%。
[0027]壳聚糖-锌离子配合物(CS-Zn)的制备 5 mL硫酸锌溶液(6.0 mg/mL)与20 mL壳聚糖水混悬液(2.5 mg/mL)混合，200 rpm磁 力搅拌约3 h，反应温度为20~30°C，静置使沉淀聚集，真空水栗抽滤，用3倍体积的蒸馏水洗 涤3次，再用无水乙醇洗涤3次。洗涤完毕后将产物室温真空干燥，即得CS-Zn。使用的壳聚糖 重均的分子量为150 kDa，脱乙酰度为80%。
[0028]壳聚糖-铁离子配合物(CS-Fe)的制备 5 mL硫酸铁溶液(6.0 mg/mL)与20 mL壳聚糖水混悬液(2.5 mg/mL)混合，200 rpm磁力 搅拌约3 h，反应温度为20~30°C，静置使沉淀聚集，真空水栗抽滤，用3倍体积的蒸馏水洗涤 3次，再用无水乙醇洗涤3次。洗涤完毕后将产物室温真空干燥，即得CS-Fe。使用的壳聚糖重 均的分子量为250 kDa，脱乙酰度为86%。
[0029] 壳聚糖-铜离子配合物微粒（（CS-Cu) NPs )的制备 将50 mg CS-Cu溶解在1%醋酸溶液中形成浓度为2.5 mg/mL的CS-Cu醋酸溶液，磁力搅 拌I h后，用1.0 mol/L氢氧化钠溶液调pH到5.3-5.5,继续搅拌0.5 h。再将8.0 mL多聚磷酸 钠溶液（I. 〇 mg/mL)在600 rpm转速下缓慢滴加到CS-Cu醋酸溶液中，混合反应0.5 h后，离 心(3000 rpm)10 min后取上清液，冷冻干燥即得(CS-Cu)NPs。
[0030]壳聚糖-钙离子配合物微粒（（CS-Ca)NPs)的制备 将50 mg CS-Ca溶解在1%醋酸溶液中形成浓度为2.5 mg/mL的CS-Ca醋酸溶液，磁力搅 拌I h后，用1.0 mol/L氢氧化钠溶液调pH到5.3-5.5,继续搅拌0.5 h。再将8.0 mL多聚磷酸 钠溶液（1.0 mg/mL)在600 rpm转速下缓慢滴加到CS-Ca醋酸溶液中，混合反应0.5 h后，离 心(3000 rpm)10 min后取上清液，冷冻干燥即得(CS-Ca)NPs。
[0031] 壳聚糖-锌离子配合物微粒（（CS-Zn)NPs)的制备 将50 mg CS-Zn溶解在1%醋酸溶液中形成浓度为2.5 mg/mL的CS-Zn醋酸溶液，磁力搅 拌I h后，用1.0 mol/L氢氧化钠溶液调pH到5.3-5.5,继续搅拌0.5 h。再将8.0 mL多聚磷酸 钠溶液（1.0 mg/mL)在600 rpm转速下缓慢滴加到CS-Zn醋酸溶液中，混合反应0.5 h后，离 心(3000 rpm)10 min后取上清液，冷冻干燥即得(CS-Zn)NPs。
[0032] 壳聚糖-铁离子配合物微粒（（CS-Fe) NPs )的制备 将50 mg CS-Fe溶解在1%醋酸溶液中形成浓度为2.5 mg/mL的CS-Fe醋酸溶液，磁力搅 拌I h后，用1.0 mol/L氢氧化钠溶液调pH到5.3-5.5,继续搅拌0.5 h。再将8.0 mL多聚磷酸 钠溶液（1.0 mg/mL)在600 rpm转速下缓慢滴加到CS-Fe醋酸溶液中，混合反应0.5 h后，离 心(3000 rpm)10 min后取上清液，冷冻干燥即得(CS-Fe)NPs。
[0033] 对比微粒 分别使用分子量为10 kDa、50 kDa和300 kDa的壳聚糖，按上述对应的方法制备得到不 同分子量的 CSNPs、CSNPs-Cu、CSNPs-Ca、CSNPs-Zn、CSNPs-Fe、（ CS-Cu) NPs、（ CS-Ca) NPs、 (CS-Zn) NPs、（ CS-Fe) NPs 微粒。
[0034]动态光散射测定 取CSNPs、A型载体及B型载体各I mL，稀释10倍后取3 mL，使用动态光散射仪检测各样 品光强以测定粒径。
[0035]实验结果如表1所示。从表中可以看出：A型载体和B型载体粒子分散均匀，粒径均 匀分布在200~400 nm范围之间。不同金属配合物制备的微粒，粒径差距不大。
[0036] 表1 CSNPs，A型载体和B型载体的粒径及PDI
[0037]浊度紫外检测 分别将2 mL壳聚糖微粒、A型载体及B型载体与2 mL 2000,1000,300,100 mM H2O2混 合，置于恒温振荡器中（37°C，100 rpm)。在不同时刻，用紫外可见分光光度计检测观察 CSNPs、CSNPs-Met及（CS-Met) NPs 的氧化降解情况(n=3 )。
[0038] 实验结果如图1~9所示，使用的壳聚糖重均的分