专利名称：拟除虫菊酯类农药降解菌及其菌剂的制作方法
技术领域：
本发明提供一种拟除虫菊酯类农药降解菌及其菌剂，属于生物高技术领域，是利 用微生物的方法降解化学农药残留，适用于现代农业生产中绿色无公害农产品的生产。
背景技术：
拟除虫菊酯类农药是一类由人工合成的模拟天然除虫菊素的仿生杀虫剂，它以神 经钠离子通道为作用靶标，具有用量低、药效高、杀虫谱广及毒性小等优点，广泛应用于棉 花、茶叶、水稻、果树、蔬菜等多种害虫及家庭卫生害虫的防治上。尤其是近些年来，由于有 机磷等剧毒类农药的中毒事件以及因农药残留超标而遭遇的“绿色壁垒”事件频频发生，引 起世界各国的高度重视，纷纷作出相关规定，严格限制高毒、剧毒农药的使用，同时大力开 发新型、高效、低毒替代产品，于是菊酯类农药得以蓬勃发展，成为国内代替有机氯农药和 其它剧毒长残留杀虫剂的主要农药类型之一。目前其品种数和使用量仅次于有机磷农药， 位居杀虫剂市场的第二位，约占世界农药市场的1/4，在我国的使用面积已占杀虫剂总施用 面积的1/3以上。菊酯类农药全世界销售量最大的品种有氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯和 氟氯氰菊酯等，它们的销售额每年分别达到1亿美元以上。随着菊酯类农药的频繁使用，特 别是第二代以后的菊酯类农药具有对光、热稳定的特点，在环境中半衰期较长，很难在自然 条件下快速降解，因而菊酯类农药残留问题日益严重，目前已成为我国出口蔬菜、水果中主 要的3类农药残留之一。欧盟2000年7月1日起实施的农药残留新标准中，菊酯类农药最 大残留限量标准变动最大，标准提高了几十到上百倍，对我国的部分农副产品出口带来严 重的影响。近年来随着人们生活水平的提高，人们迫切需要无农药残留污染的清洁绿色食品。果蔬农药残留治理新技术是食品安全生产的关键配套技术。控制农药污染源以及 残留治理新技术研究是解决食品中农药残留的基本方法。目前减少农药残留污染的研究大 多集中在选用高效低毒低残留的化学农药和生物农药、改进剂型及应用技术方面，但是收 效甚微。农产品生产过程中农药的不可减少，寻求高效、安全、经济的农产品农药残留处理 新技术，解决病虫害防治用药与农药残留的矛盾，已成为科研工作者亟待解决的具有重大 经济和社会意义的重大科研命题。利用微生物降解剂处理农产品，是农药残留控制处理的 新领域、新途径，具有操作简便、经济实用、无二次污染等优点，目前许多发达国家和大公司 企业都投入巨资以从事农药残留高效降解菌的研究开发。实验室和实际应用研究都表明利 用微生物降解果蔬中的农药残留，提高农产品的品质和经济价值是可行的。现有技术中本 课题组已拥有降解菌的发明专利(200710030304. 2，公开号CN 101157901A，
公开日2008 年4月9日)，该专利是一株枝孢菌属Hu-01，能有效降解毒死蜱农药残留。氰戊菊酯是近年来使用非常广泛的一种拟除虫菊酯类农药，目前还没有发现专门 针对氰戊菊酯农药残留的降解菌菌剂。
发明内容
本发明的目的在针对现有技术的不足，提供一种新的拟除虫菊酯类农药降解菌， 并开发研制出一种新型的农药残留降解菌菌剂。使用所述拟除虫菊酯类农药降解菌可以 使氰戊菊酯、溴氰菊酯、高效氯氰菊酯、高效氟氯氰菊酯等拟除虫菊酯类农药的残留量降低 80%以上，具有较高的降解效果，生产和使用成本低。发明通过以下技术方案实现上述目的本发明提供一种拟除虫菊酯类农药降解菌，其特征在于所述降解菌为ZS-S-Olj^ 鉴定为寡养单胞菌属(Stenotrophomonas sp.)，于2010年4月21日寄存于中国典型培养 物保藏中心(CCTCC)(武汉大学保藏中心)，菌种保藏号为CCTCC M 2010095。主要生物学 特性为革兰氏阴性，极生多鞭毛，细胞短杆状，大小为0. 5 μ m 0. 6 μ mX 0. 4 μ m 0. 5 μ m ； 菌落乳白偏黄，直径0. 5mm 1mm，边缘规则整齐，中间稍有突起，菌落较厚，不透明，表面光 滑发亮，不皱缩。柠檬酸盐试验、乙酰甲基甲醇(V-P)试验、明胶液化试验阳性；硝酸盐还原 试验、三糖铁高层琼脂试验、纤维素水解试验、淀粉水解试验、甲基红(MR)试验、牛奶凝固 与胨化试验、硫化氢产生试验阴性；可以利用蔗糖、果糖、半乳糖、木糖、葡萄糖和甘露糖，该 菌株的16S rDNA的Genbank登录号为HM016874。该菌是采用富集培养法筛选获得将IOOmL的基础培养基装到250mL三角瓶中灭菌，冷 却后无菌条件下加入菊酯农药使其终浓度为IOOmg · L—1，同时加入于广东省采集的污泥土样IOg 于30°C、180r · min1摇床培养7d后，按10%的接种量转接到第二批含250mg · L—1菊酯农药的基 础培养基中。相同条件培养7d后，再按10%的接种量转接到含菊酯农药均为500mg · L—1的基础 培养基中，继续培养7d。此时取0. ImL基础培养基发酵液反复进行平板划线分离，直至得到单菌 落，将单菌落接种到试管斜面培养基上，于4°C冰箱内保存。其中的基础培养基为=NH4NO3 l.Og, MgSO4 · 7H20 0. 5g, (NH4)2SO4 0. 5g, KH2PO4 0. 5g, NaClO. 5g, K2HPO4 1. 5g, H2O lOOOmL, pH 7. 0。使用所述氰戊菊酯农药残留降解菌生产菌剂的工艺为斜面种_摇瓶种_种子罐 培养-生产罐培养-包装为液体剂型。本发明的详细实施步骤为(1)将氰戊菊酯农药残留降解菌ZS-S-01的菌种接种于查彼氏培养基摇瓶中，振 荡培养至对数期；(2)将上述培养好的菌种按种子罐培养基的体积比8% 10%接种量接种入种子 罐，培养至对数生长期，种子罐所用质量百分比培养基配方为蔗糖3%，NaNO3 0.2%, KCl 0. 05%, MgSO4 0. 05%, K2HPO4 0. 1 %, Fe2 (SO4)30. 001%，蛋白胨 0. 05%, pH = 7. 0 ；(3)将达到对数期的种子液按照8% 10%的接种量接种入生产罐培养，生产罐 所用培养基与种子罐培养基相同；在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为0. 45 0. 60m7min，搅拌速 度为200 300r · mirT1，温度30°C，全流程培养时间为36 48h，所获培养液即为菌剂。本发明的拟除虫菊酯类农药降解菌可以用于降解拟除虫菊酯类农药残留，如用于 降解氰戊菊酯、溴氰菊酯、高效氯氰菊酯或高效氟氯氰菊酯等。应用量每平方米农田施用 50mL浓度为1. OXlO7CFU · ml/1的降解菌菌液。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果(1)拟除虫菊酯类农药降解菌ZS-S-01能使氰戊菊酯、溴氰菊酯、高效氯氰菊酯、 高效氟氯氰菊酯等拟除虫菊酯类农药的残留量降低80%以上，使用该降解菌菌剂，成功解决了农产品生产过程中农药的使用与高效、安全、经济的防治病虫害的矛盾，又可生产出无 毒无公害的绿色农产品，可以再果蔬的正常生长过程中使用化学农药防治病虫害而保证果 蔬中农药残留量符合绿色食品要求。(2)本发明生产的农药残留高效降解菌剂具有生产成本低，使用方便，降解效果好 的优点，适合在全国果蔬生产出口基地或有绿色食品标志的地方大面积使用。(3)本发明促进协调统一病虫害防治用药与食品安全，大规模推广使用果蔬农药 微生物处理，生产无公害蔬菜、绿色食品具有重要的意义。本发明的拟除虫菊酯类农药降解菌ZS-S-01，经鉴定为寡养单胞菌属 (Stenotrophomonas sp.)，于2010年4月21日寄存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)， 菌种保藏号为CCTCC M 2010095。
具体实施例方式将本发明的拟除虫菊酯类农药降解菌ZS-S-Ol的菌种在固体平板上活化，并测定 降解性能，接种于试管斜面上备用。将氰戊菊酯农药残留降解菌ZS-S-Ol的试管种接种 于含250mL的查彼氏培养基IOOOmL摇瓶中，恒温振荡至对数期，准备接种种子罐。种子 罐 100L，投料量 80L，培养基配方为蔗糖 3%，NaNO3 0.2%，KCl 0. 05%, MgSO4 0. 05%, K2HPO4 0. 1 %, Fe2 (SO4) 30. 001 %，蛋白胨 0. 05%，pH = 7. 0。投料完成后在 1. lKg/cm3 的压 力下、121°C条件下高压湿热灭菌，冷却至30°C后，将上述培养好的摇瓶菌种按8% 10% 的接种量接种于100L种子罐，无菌空气的通气量为0. 45 0. 60m7min，搅拌速度为200 300r · mirT1，培养至对数生长期备用。将到达对数期的种子液按照8% 10%的接种量投 入生产罐培养，生产罐所用培养基成分与种子罐培养基相同。生产罐容量1吨，投料量为 0. 08 0. 1吨。投料后的生产罐，在1. lKg/cm3的压力下、121°C条件下高压湿热灭菌，冷却 至30°C后，通无菌空气，通气量为0. 45 0. 60m7min，搅拌速度为200 300r .mirT1,培养 温度控制在30 35 °C，整个工艺培养流程时间为36 48h。 所获培养液直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型。1.在基础盐培养基(组分为=NH4NO3 1. 0g, NaCl 0. 5g，K2HPO4 1. 5g，KH2PO4O. 5g， MgSO4 · 7H20 0. 5g，水lOOOmL，pH7. 0)中分别加入终浓度为50mg · Γ1的氰戊菊酯、溴氰菊
酯、高效氯氰菊酯、高效氟氯氰菊酯等拟除虫菊酯类农药，接种降解菌ZS-S-01，并设不接菌 的培养基为对照，摇床培养4d后高效液相色谱法检测农药的降解情况，结果见表1。结果表 明降解菌可以有效去除氰戊菊酯、溴氰菊酯、高效氯氰菊酯、高效氟氯氰菊酯等拟除虫菊酯 类农药残留，具有很好的降解效果。表1降解菌ZS-S-Ol对氰戊菊酯、溴氰菊酯、高效氯氰菊酯、高效氟氯氰菊酯的降
解效果
\-氰戊菊酯溴氰菊酯高效氯氰菊酯高效氟氯氰菊 酯降解率93.2±2.4392.2±3.0880.7±1.2480.2±2.24
5
注以上结果3次重复平均值(X 士标准误SE)。降解率(%) = (I-CVC0) X 100%Cl 降解菌处理农药残留浓度(mg · Γ1) ；C0 对照处理农药残留浓度(mg · L—1)。2.用本发明的菌剂进行田间农药残留降解试验示范。在田间选取未经施药的菜心，划出18个小区，每小区6m2，分别用手提式喷雾器喷 施1000X、2000X、3000X的20%的氰戊菊酯乳油，施药量为2g/667m2，对照和处理相间排列。 施药后2天均勻喷施降解菌菌液，每小区300mL，以清水做对照，喷施菌液1、2、3天后按五点 取样法取菜心样气相色谱法测定农药残留量，结果见表2。结果表明降解菌菌剂可以有效去 除高效氯氰菊酯农药残留，具有很好的降解效果。表2降解菌ZS-S-Ol田间氰戊菊酯降解试验
权利要求
一种拟除虫菊酯类农药降解菌ZS S 01，为革兰氏阴性菌，经鉴定为寡养单胞菌属(Stenotrophomonas sp.)，于2010年4月21日寄存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，菌种保藏号为CCTCC M 2010095，该菌株的16S rDNA的Genbank登录号为HM016874。
2.一种拟除虫菊酯类农药降解菌菌剂，其特征在于通过以下方法生产而成的(1)将氰戊菊酯农药残留降解菌ZS-S-Ol的菌种接种于查彼氏培养基摇瓶中，振荡培 养至对数期；(2)将上述培养好的菌种按种子罐培养基的体积比8% 10%接种量接种入种子罐， 培养至对数生长期，种子罐所用的质量百分比培养基配方为蔗糖3%，NaNO3 0. 2%, KCl`0.05%, MgSO4 0. 05%, K2HPO4 0. 1 %, Fe2 (SO4)30. 001%，蛋白胨 0. 05%, pH = 7. 0 ；(3)将达到对数期的种子液按照8% 10%的接种量接种入生产罐培养，生产罐所用 培养基与种子罐培养基相同；(4)在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为0.45 0. 60m7min，搅拌速 度为200 300r · mirT1，温度30 35°C，全流程培养时间为36 48h，所获培养液直接用 塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型。
3.如权利要求1或3所述的拟除虫菊酯类农药降解菌在降解拟除虫菊酯类农药残留方 面的应用。
4.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述的拟除虫菊酯类农药为氰戊菊酯、溴氰 菊酯、高效氯氰菊酯或高效氟氯氰菊酯。
5.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述应用量每平方米农田施用50mL浓度为`1.OX IO7CFU · ml/1的降解菌菌液。
全文摘要
本发明公开了一种拟除虫菊酯类农药残留降解菌及其降解菌菌剂，属于生物高技术领域。所用菌株为ZS-S-01，经鉴定为寡养单胞菌属(Stenotrophomonas sp.)，菌种保藏号为CCTCC M 2010095，该菌株的16S rDNA的Genbank登录号为HM016874。主要生物学特性为革兰氏阴性，极生多鞭毛，细胞短杆状。菌落乳白偏黄，直径0.5mm～1mm，边缘规则整齐，中间稍有突起，菌落较厚，不透明，表面光滑发亮，不皱缩。本发明菌剂生产成本低，使用方便，降解效果好，适合在全国果蔬生产出口基地或有绿色食品商标标志的地方大面积使用，对促进生产无公害蔬菜、绿色食品具有重要的意义。
文档编号A62D3/02GK101974453SQ201010284100
公开日2011年2月16日 申请日期2010年9月15日 优先权日2010年9月15日
发明者刘晶晶, 胡美英, 钟国华, 陈少华, 黄文文 申请人:华南农业大学