一株可降解pva的假单胞菌菌株的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株可降解PVA的假单胞菌菌株，命名为假单胞菌Pseudomonassp.TD5，于2013年10月13日保藏于中国典型微生物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2013468。此菌株是从活性污泥中筛选得到,具体通过微生物的富集，目的菌株的分离，透明圈法筛选得到，Finley法可检测到PVA降解酶酶活，可验证菌株具有降解PVA1799的效果。该菌株能高效降解培养基及退浆污水中的PVA1799污染物组分，能够有效除去污染物PVA1799，既可以减少了环境污染又能降低污水处理成本。
【专利说明】—株可降解PVA的假单胞菌菌株
【技术领域】:
[0001]本发明涉及到一株降解PVA1799的假单胞菌菌株及其应用，尤其涉及一种能独立降解环境中PVA1799的假单胞菌属菌株，属于生物工程【技术领域】。
【背景技术】:
[0002]聚乙烯醇(PVA)在纺织工业中被广泛用作上浆剂，其中PVA1799更是占有相当大的比例。经PVA上浆的棉织物必须经过退浆处理，以增加棉织物对水的吸收性。目前常用的退浆方法是使用热水在棉织物表面洗脱PVA，有时使用氧化剂如NaBrO2等，这就导致纺织厂排出的废水中含有大量的PVA和氧化剂，这些会对环境造成极大的污染。
[0003]如果能将PVA降解酶或PVA降解菌运用于纺织工业的退浆工艺，在退浆工段就实现对PVA的生物降解，不仅能大大减少PVA废水的排放，还能避免化学退浆过程中高温和氧化造成的棉纤维损伤。研究和筛选PVA降解微生物及PVA降解酶将有助于其在退浆工艺上的运用，对于减轻环境污染将具有重大的意义。
[0004]本发明所报道的假单胞菌菌株属能单独降解的培养基中的PVA1799，纯菌的获得对PVA降解酶尤其是PVA氧化酶的研究有很大帮助。
【发明内容】
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[0005]本发明要解决的技术问题是提供了一种独立降解溶液中PVA1799的菌株TD5，命名为假单胞菌Pseudomonassp.TD5,于2013年10月13日保藏于中国典型微生物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2013468，保藏地址为:中国武汉、武汉大学。
[0006]所述假单胞菌能够降解溶解态的PVA1799。
[0007]用于培养权利要求1所述假单胞菌的最佳培养基:(g/L):PVA17991，酵母粉1，蛋白胨 1，KH2PO4L 6，K2HPO40.02，NH4SO40.5，FeSO4.7Η200.02，CaCl2.2Η200.064，MgSO4.7Η200.I, NaCl0.02，ρΗ7.5。发酵培养基为(g/L):PVA17991，酵母粉 0.01，KH2PO4L 6，K2HPO4O? 02，NH4SO40.5，FeSO4.7Η200.02，CaCl2.2Η200.064，MgSO4.7Η200.1，NaCl0.02，ρΗ7.5。
[0008]所述培养基的最佳培养温度为30°C，最适pH为7.5。
[0009]本发明还提供了一种应用所述假单胞菌降解培养基中PVA1799的方法，将所述假单胞菌种子接种入发酵培养基。
[0010]优选方案为:将种子液30D离心后,重悬接种入发酵培养基中，30°C培养条件下,7天内培养基中的PVA1799能够被完全降解。
【专利附图】
【附图说明】:
[0011]图1为筛选纯化所得TD5在PVA1799唯一碳源的琼脂平板上的菌落形态及Finley法显色后的透明圈图
[0012]图2为将TD5接种入发酵培养基后摇瓶降解特性图
[0013]图3为TD5的系统发育树图[0014]【具体实施方式】；
[0015]实施例1特异性降解PVA菌株的定性筛选
[0016]1、菌株来源:活性污泥
[0017]2、培养方法:将采样所得活性污泥10g，加入90mL无菌生理盐水，摇床(200rpm)震荡6h。
[0018]3、筛选:将菌悬液稀释不同倍数后涂布PVA唯一碳源平板上，30°C培养，Finley法显色后，选取可以产生透明圈的菌株反复进行3次平板纯化，最终获得纯目的菌株，于2013年10月13日保藏于中国典型微生物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2013468，保藏地址为:中国武汉、武汉大学。
[0019]实施例2PVA降解酶酶活的测定
[0020]UFinley法(改良):取400 μ L发酵液上清，加入标准IOmL比色管中，加入3mL25g/L的硼酸溶液，加入300 μ L0.lmol/L的I2-KI，补充水至10mL。避光反应5min，于波长690nm下测定吸光值。
[0021]2、PVA降解酶总酶活测定:取发酵液IOmL左右，在4°C下经超声波破碎15min左右，即为粗酶液(包含胞外酶和胞内酶)，经微孔滤膜(孔径0.45 μ m，直径50mm)过滤，然后用0.lmol/L磷酸钾缓冲液(ρΗ7.5)透析24h，即为粗酶液。在5X 15试管中加入0.5mL粗酶液和0.5mL底物(lg/LPVA1799溶于pH7.5的磷酸钾缓冲液中)，将此混合体系于35°C反应6h，分别测定反应前后反应混合液所对应PVA含量的吸光度。每分钟吸光度下降0.001定义为一个酶活单位。
[0022]实施例3菌株TD5对溶液中lg/LPVA1799的降解
[0023]1、种子的制备
[0024]取_80°C甘油管保藏的TD5菌株100 μ L接种于权利要求3所述种子培养基，30°C培养16h。
[0025]2、TD5降解发酵培养基中PVA1799
[0026]取30D种子培养基离心保留菌体，并以发酵培养基重悬种子菌体接种入权利要求3所述的发酵培养基。结果显示，7天内，发酵培养基中的PVA1799可被完全降解。
[0027]虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
【权利要求】
1.一株可降解PVA的假单胞菌菌株，于2013年10月13日保藏于中国典型微生物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2013468，经发酵优化产PVA降解酶酶活力达到1.12U/ml。
2.根据权利要求1所述的假单胞菌菌株，其特征在于能单独的在7天内降解培养基中lg/L 的 PVA1799。
3.用于培养权利要求1所述假单胞菌菌株的种子培养基(g/L):PVA17991，酵母粉1，蛋白胨 1，ΚΗ2Ρ041.6，K2HPO40.02，NH4SO40.5，FeSO4.7Η200.02，CaCl2.2Η200.064，MgSO4.7Η200.I, NaCl0.02, pH7.5。
4.用于培养权利要求1所述假单胞菌菌株的发酵培养基(g/L):PVA17991，酵母粉0.01，KH2PO4L 6，K2HPO40.02，NH4SO40.5，FeSO4.7Η200.02，CaCl2.2Η200.064，MgSO4.7Η200.I, NaCl0.02, pH7.5。
5.权利要求3或4所述培养基的最佳培养温度为30°C，最适pH为7.5。
6.应用权利要求1所述假单胞菌菌株降解PVA1799的方法，其特征在于，将所述假单胞菌菌株至少30D种子液离心、重悬菌体接种到所要降解的PVA1799溶液中应用。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述假单胞菌菌株，接种至少30D种子到lg/L的发酵培养基中时，能在7内能够`降解发酵培养基中的PVA1799。
【文档编号】A62D3/02GK103756933SQ201310751444
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2013年12月31日 优先权日:2013年12月31日
【发明者】陈坚, 李江华, 堵国成, 李坤, 刘龙, 乐文民 申请人:江南大学