专利名称：花状纳米金的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种纳米金，尤其是涉及一种以胰蛋白酶和氯金酸为原料，抗坏血酸
为还原剂，水为溶剂，采用常温搅拌法一步控制合成花状纳米金。
背景技术：
纳米颗粒作为一种典型的介观系统，具有很多不同于本体材料和单个分子的独特 性质。作为纳米颗粒体系中极其重要的一员，纳米金颗粒本身还具有独特的物理化学性 能，如良好的生物相容性，使纳米金颗粒在生物标记和生物传感方面得到广泛应用，优异的 电学、化学性能使之用于电子产品及高效催化剂。目前纳米金的制备方法主要有液相还 原法、光化学法、气相蒸发法、种金生长法、电化学还原法、相转移法、水热法、微波法等。文 献报道采用的还原剂较多为化学试剂，其中强还原剂，如柠檬酸三钠和硼氢化钠等；弱还原 剂，如抗坏血酸、多醇类等化合物。在生物领域，也涉及生物大分子、生物小分子、以及生物 有机体作为还原剂合成纳米颗粒。 胰蛋白酶系自牛、羊或猪胰岛中提取的一种蛋白水解酶。中国药品标准规定按干 燥品计算，每lmg的效价不得少于2500单位。由牛、羊、猪胰脏提取而得的一种肽链内切酶， 只断裂赖氨酸或精氨酸的羧基参与形成的肽键。胰蛋白酶为白色或米黄色结晶性粉末，溶 于水，不溶于乙醇、甘油、氯仿和乙醚。分子量24000，pl 10. 5，最适pH值7.8 8. 5左右。 pH值2 3是稳定的。pH值5以上易白溶失活。Ca2+对酶活性有稳定作用；重金属离子、 有机磷化合物、DFP、天然胰蛋白酶抑制剂对其活性有强烈抑制。临床用于抗炎消肿，工业上 用于皮革制造、生丝处理、食品加工等。 生物分子用于纳米金颗粒的合成主要有以下三类 第一类以植物提取物为还原剂，K. Badri Narayanan.等(K. Badri Narayanan, N. Sakthivel. Materials. Letters. 2008， 62， 4588-4590)采用胡妥叶提取物用于合成纳米 金颗粒，产物为球形、三面体、缺角三面体以及十面体纳米颗粒，粒径在6. 75 57. 91nm范 围内。Shankar等(ShankarS S， Rai A， Ankamwar B， Singh A， Ahmad A， Sastry M.Nat. Mater. ，2004,3 :482-488)利用柠檬香草的萃取液在室温下还原得到三角形的金纳米薄 片。 第二类以微生物为还原剂，Murali Sastry等(Murali Sastry， Absar Ahmad， M. Islam Khan. Current Science, 2003， 85， 162-170)采用放射菌和真菌类作为还原剂，合 成了金银纳米颗粒。 第三类以蛋白酶、DNA和氨基酸等为还原齐U， Kei Yasui等(Kei Yasui， Nobuo Kimizuka. Chem. Lett, 2005， 34， 416-417)采用葡萄糖氧化酶催化合成金纳米 颗粒，BETA-D-glucose包覆稳定纳米金。Shao等(Wang L， Guo S J， Hu X G， Dong S J. Electrochem. Commun. ， 2008， 10 (1) :95-99)采用赖氨酸、色氨酸、精氨酸、酪氨酸在 水溶液中还原氯金酸得到金纳米粒子，而采用天东氨酸还原得到了大量金纳米薄片。 Wallen(Raveendran P， Fu J， Wallen S L.Green Chem. ，2006,8(1) :34-38)发现了一种金纳米颗粒的绿色合成方法。用葡萄糖作为还原剂，淀粉作为保护剂，可以制备金银颗粒以及 金银合金颗粒。但是这些方法制备的金纳米颗粒粒径并不均一，产率不高且反应时间较长。
生物有机体合成的纳米颗粒，因其良好的生物相容性以及环保性，在生物、医学和 工业等领域具有很好的应用前景。蛋白-纳米复合体，在基因表达中，可能增强DNA到细 胞核的传递作用(参见文献Austin RH， Tegenfeldt J0， Cao H， Chou SY， Cox EC. IEEE TransacNanotechnol. 2002， 1， 12-18)。同样，蛋白_纳米复合物在纳米探针，医疗以及诊断 器件中都有很好的发展前景(参见文献Pennadam SS， Firman K， Alexander C， Gorecki DC. JNanobiotechno1，2004，2，8)。 胰蛋白酶修饰纳米材料的应用胰蛋白酶具良好的生物特性，其特定的裂解功能
备受关注，是常用的蛋白裂解酶。目前针对胰蛋白酶的研究，主要涉及酶的固定，稳定胰
蛋白酶活性，提高其在生产、研究中的再利用。Liu JY等人(Liu JY， Lin S， Qi DW， Den
CH. Journal ofChromatogr即hy A，007， 1176， 169-177)采用超磁性纳米粒子，固定胰蛋白
酶，制备成磁性的酶复合物，能降低生产成本以及提高利用率。Liu CG等人(Liu CG， Chen
XG， Park Hy皿-Jin。 Carbohydrate Polymers 2005， 62， 293-298)利用两性聚合物特殊的
结构性质，其疏水和亲水基团，能自由结合蛋白分子，通过条件的控制，能制备得到胰蛋白
酶-两性复合物，产物具优良的生物相容性，且能稳定胰蛋白酶的活性。 胰蛋白酶制备纳米颗粒的优势，胰蛋白酶的氨基酸组成中，亲水性的基团占一半
以上，在酶分子表面，有大量的亲和力强的侧链基团，这些基团极易与金离子或纳米金颗粒
结合。在特定的条件下，胰蛋白酶利用这些基团，通过各种化学结合能，如离子键、范德华力
以及静电吸引力，使大部分的金离子吸附在酶的表面。抗坏血酸作为还原剂，在室温中即能
还原氯金酸，促使原位还原金离子，以胰蛋白酶的3D结构为模板，合成了花状纳米金颗粒。
该方法操作工艺简单易行、原料容易获得，成本低廉、使用于大规模工业化生产，还可通过
改变溶剂，用胰蛋白酶作单一还原剂，在高温9(TC条件下能迅速合成纳米金颗粒，并且在一
定的条件下，能维持部分酶活力。另外，生产过程对环境无污染，符合倡导的"绿色化学"的要求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种稳定性较高、生物相容性较好、粒子较均一的胰蛋白
酶包覆的花状纳米金的制备方法。 本发明所述花状纳米金由纳米颗粒组成，胰蛋白酶包覆，产物粒径为100 200nm，形状粒径均一。 本发明所述花状纳米金的制备方法包括以下步骤
1)将氯金酸和胰蛋白酶溶液混合，得氯金酸和胰蛋白酶溶液混合液；
2)在氯金酸和胰蛋白酶溶液混合液中加入抗坏血酸，得反应溶液；
3)收集反应产物，洗涤后得产物花状纳米金。 在步骤l)中，所述氯金酸和胰蛋白酶溶液，按体积比最好为(1 10) : l，所述氯 金酸的浓度最好为0. 02 1. 0mM，所述胰蛋白酶的浓度最好为0. 08 1. 5mg/mL。
在步骤2)中，所述抗坏血酸的浓度最好为0. 5 6. 0mM，所述反应的温度最好为 25 9(TC，反应的时间最好为5min 24h。反应溶液pH值最好为3. 0 10. 0。
在步骤3)中，所述洗涤最好以超纯水超声洗涤3次。
与现有的花状纳米金的制备方法相比，本发明具有以下突出优点 1)将水作为溶剂的优点是来源最为丰富、无毒、价廉、使用安全、不危害环境； 2)原料胰蛋白酶的生物相容性好，对环境无害，解决其他制备方法携带的化学
试剂造成纳米金生物相容性差的障碍，纳米金容易制备、粒径、形貌容易调控； 3)还原剂采用抗坏血酸，其成本低廉、容易获得、生物相容性好、对环境无害； 4)合成方法是胰蛋白酶与氯金酸水溶液混合，抗坏血酸为还原剂，利用常温搅拌
法制得的纳米金颗粒分散性好，形状均一，粒径分布窄，稳定性好，操作简单易行； 5)通过对合成条件的控制能得到形貌均一的花状纳米金颗粒； 6)所采用的合成方法工艺简单，得到的产物易于分离、清洗、保存。
图1为实施例1制备的产物的透射电镜图。在图1中，标尺为20nm ;由图1可见， 产物均为分散的纳米金颗粒；抗坏血酸为单一还原剂时不能生成花状纳米金，反应迅速。
图2为实施例2制备的产物的透射电镜图。在图2中，标尺为20nm ;由图2可见， 产物均为分散的纳米金颗粒，胰蛋白酶为单一还原剂时不能生成花状纳米金，室温下胰蛋 白酶不能完全还原氯金酸。 图3为实施例3制备的产物的透射电镜图。在图3中，标尺为50nm ;由图3可见， 抗坏血酸终浓度为3. OmM得到的产物为花状纳米金，形貌均一，高浓度抗坏血酸产物稳定 性好。 图4为实施例3制备的产物的透射电镜图。在图4中，标尺为50nm ;由图4可见， 抗坏血酸终浓度为2. 5mM得到的产物为花状纳米金，稳定性较好。 图5为实施例3制备的产物的透射电镜图。在图5中，标尺为50nm ;由图5可见， 抗坏血酸终浓度为2. OmM得到的产物为花状纳米金，稳定性较差。 图6为实施例3制备的产物的透射电镜图。在图6中，标尺为50nm ;由图6可见， 抗坏血酸终浓度为1. 5mM得到的产物为花状纳米金，低浓度抗坏血酸产物稳定性差。
图7为实施例4制备的产物的透射电镜图。在图7中，标尺为50nm ;由图7可见， 抗坏血酸终浓度为1. OmM得到的产物为未成形的花状纳米金，颗粒团聚，稳定性差。
图8为实施例4制备的产物的透射电镜图。在图8中，标尺为20nm ;由图8可见， 抗坏血酸终浓度为0. 5mM得到的产物为未成形的花状纳米金，颗粒团聚，稳定性差。
图9为实施例3和4制备得到的产物的紫外一可见吸收光谱图。在图9中，横坐 标为波长/咖，纵坐标为吸收强度/a. u.;花状纳米金吸收峰为580nm ;曲线a f为抗坏血 酸终浓度，分别为3. OmM， 2. 5mM， 2. OmM， 1. 5mM， 1. OmM， 0. 5mM。 图10为实施例3制备得到的产物的粒径分布图。在图10中，横坐标为粒径/nm ; 由图10可见，抗坏血酸终浓度为3. OmM得到的产物。 图11为实施例3制备得到的产物的粒径分布图。在图11中，横坐标为粒径/nm ; 由图11可见，抗坏血酸终浓度为2. 5mM得到的产物。 图12为实施例3制备得到的产物的粒径分布图。在图12中，横坐标为粒径/nm ; 由图12可见，抗坏血酸终浓度为2. OmM得到的产物。
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图13为实施例3制备得到的产物的粒径分布图。在图13中，横坐标为粒径/nm ; 由图13可见，抗坏血酸终浓度为1. 5mM得到的产物。 图14为实施例4制备得到的产物的粒径分布图。在图14中，横坐标为粒径/nm ; 由图14可见，抗坏血酸终浓度为1. 0mM得到的产物。 图15为实施例4制备得到的产物的粒径分布图。在图15中，横坐标为粒径/nm ; 由图15可见，抗坏血酸终浓度为0. 5mM得到的产物。 图16为实施例5制备得到的产物的透射电镜图。在图16中，标尺为20nm ;由图 16可见，改变胰蛋白酶和抗坏血酸的加入顺序，会形成完全不同的产物。
图17为实施例6制备得到的产物的紫外一可见吸收谱图。在图17中，横坐标为 波长/nm，纵坐标为吸收强度/a. u.;图中pH值从上至下分别为11. 0、9. 0、7. 0、5. 0、3. 0 ;由 图17可见，只有pH 5. 0产生580nm的花状纳米金吸收峰。 图18为实施例6制备的产物的扫描电镜图。在图18中，横坐标为200nm;由图18 可见，pH 3.0的条件下，不能得到花状纳米金，生成团聚纳米颗粒。 图19为实施例6制备的产物的扫描电镜图。在图19中，横坐标为200nm;由图19 可见，pH5. 0的条件下，生成花状纳米金。 图20为实施例6制备的产物的扫描电镜图。在图20中，横坐标为500nm;由图20 可见，pH 7. 0-11. 0的条件下，不能得到花状纳米金，生成纳米金颗粒。
图21为实施例7制备的产物的透射电镜图。在图21中，横坐标为50nm ;由图21 可见，氯金酸浓度为0. 2-0. 4mM的条件下，生成花状纳米金。 图22为实施例7制备的产物的透射电镜图。在图22中，横坐标为20nm ;由图22 可见，氯金酸浓度为0. 6-2. OmM的条件下，不能得到花状纳米金，生成纳米金颗粒。
具体实施例方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
实施例1 量取O. 2mM的氯金酸溶液8mL，以O. 015M抗坏血酸为还原剂，搅拌混匀，溶液pH为 5.0，室温下反应24h 10d。反应后样品，以超纯水反复洗涤超声，15000rpm离心，收集样 品。反应得到球形纳米粒子，参见图1。
实施例2 量取0. 2mM的氯金酸溶液8mL，以lmg/mL的胰蛋白酶溶液1. 6mL(为超纯水分散) 为还原剂，搅拌混匀，溶液pH为5.0，室温下反应10d。反应后样品，以超纯水反复洗涤超声， 15000rpm离心，收集样品。反应得到球形纳米粒子，参见图2。
实施例3 量取0. 2mM的氯金酸溶液8ml与lmg/mL的胰蛋白酶溶液1. 6mL(均为超纯水分 散)，充分搅拌混匀，保持氯金酸和胰蛋白酶的体积比为5 : 1，溶液pH为5.0;加入一定量 的O. 015M抗坏血酸，使抗坏血酸的浓度为1. 5mM、2. 0mM、2. 5mM、3. OmM，搅拌混匀。室温下反 应5min 24h。反应后样品，以超纯水反复洗涤超声，9000rpm离心，收集样品。反应得到 花状纳米金，参见图3 6和图9 13。
实施例4
量取0. 2mM的氯金酸溶液8mL与lmg/mL的胰蛋白酶溶液1. 6mL(均为超纯水分 散)，充分搅拌混匀，保持氯金酸和胰蛋白酶的体积比为5 : 1，溶液pH为5.0;加入一定量 的0. 015M抗坏血酸，使抗坏血酸的浓度为0. 5mM、1. OmM，搅拌混匀。室温下反应lh 24h。 反应后样品，以超纯水反复洗涤超声，9000rpm离心，收集样品。反应得到未成形的花状纳米 金颗粒，参见图7 8和图14 15。
实施例5 量取O. 2mM的氯金酸溶液8mL，加入一定量的0. 015M抗坏血酸，使抗坏血酸的浓度 为3. OmM，充分搅拌混匀，溶液pH为5. 0 ;再加入lmg/ml的胰蛋白酶溶液1. 6ml (为超纯水 分散)，保持氯金酸和胰蛋白酶的体积比为5 : l，搅拌混匀。室温下放置24h。反应后样 品，以超纯水反复洗涤超声，9000rpm离心，收集样品。反应得到团聚的纳米金颗粒，参见图 16。 实施例6 量取0. 2mM的氯金酸溶液8mL与lmg/mL的胰蛋白酶溶液1. 6mL(均为超纯水分 散)，充分搅拌混匀，保持氯金酸和胰蛋白酶的体积比为5 : l，用O. 1M HCl或O. 1M NaOH将 溶液pH调为3. 0、5. 0、7. 0、9. 0、11. 0 ;加入一定量的0. 015M抗坏血酸，使抗坏血酸的浓度 为3.0mM，搅拌混匀。室温下反应lh 24h。反应后样品，以超纯水反复洗涤超声，9000rpm 离心，收集样品。反应得到不同的纳米材料，只有pH 5.0条件下能生成花状纳米金，参见图 17 20。
实施例7 量取lmg/mL的胰蛋白酶溶液1. 6mL(为超纯水分散)，与0. 2mM、0. 4mM、0. 6mM、 0. 8mM、1. 2mM、2. OmM的氯金酸溶液8mL充分搅拌混匀，保持氯金酸和胰蛋白酶的体积比为 5 : l，溶液pH为5. 0 ;加入一定量的O. 015M抗坏血酸，使抗坏血酸的浓度为3. OmM，搅拌 混匀。室温下反应lh 24h。反应后样品，以超纯水反复洗涤超声，9000rpm离心，收集样 品。氯金酸浓度为0. 2 0. 4mM得到花状纳米金，浓度为0. 6_2. OmM得到纳米金颗粒，参见 图21 22。
权利要求
花状纳米金的制备方法，其特征在于所述花状纳米金由纳米颗粒组成，胰蛋白酶包覆，产物粒径为100～200nm，形状粒径均一；所述花状纳米金的制备方法包括以下步骤1)将氯金酸和胰蛋白酶溶液混合，得氯金酸和胰蛋白酶溶液混合液；2)在氯金酸和胰蛋白酶溶液混合液中加入抗坏血酸，得反应溶液；3)收集反应产物，洗涤后得产物花状纳米金。
2. 如权利要求1所述的花状纳米金的制备方法，其特征在于所述氯金酸和胰蛋白酶溶 液，按体积比为1 10 : 1。
3. 如权利要求l所述的花状纳米金的制备方法，其特征在于所述氯金酸的浓度为 0. 02 1. OmM。
4. 如权利要求1所述的花状纳米金的制备方法，其特征在于所述胰蛋白酶的浓度为 0. 08 1. 5mg/mL。
5. 如权利要求1所述的花状纳米金的制备方法，其特征在于所述抗坏血酸的浓度为 0. 5 6. OmM。
6. 如权利要求1所述的花状纳米金的制备方法，其特征在于所述反应的温度为25 90。C，反应的时间为5min 24h。
7. 如权利要求l所述的花状纳米金的制备方法，其特征在于所述反应溶液pH值为 3. 0 10. 0。
8. 如权利要求1所述的花状纳米金的制备方法，其特征在于所述洗涤是以超纯水超声 洗涤3次。
全文摘要
花状纳米金的制备方法，涉及一种纳米金。提供一种稳定性较高、生物相容性较好、粒子较均一的胰蛋白酶包覆的花状纳米金的制备方法。所述花状纳米金由纳米颗粒组成，胰蛋白酶包覆，产物粒径为100～200nm，形状粒径均一。将氯金酸和胰蛋白酶溶液混合，得氯金酸和胰蛋白酶溶液混合液；在氯金酸和胰蛋白酶溶液混合液中加入抗坏血酸，得反应溶液；收集反应产物，洗涤后得产物花状纳米金。
文档编号B22F9/24GK101786168SQ20101004482
公开日2010年7月28日 申请日期2010年1月8日 优先权日2010年1月8日
发明者李林梅, 翁建, 钟鹭斌 申请人:厦门大学