本发明属于纳米材料和生物工程技术领域，具体涉及一种单层包覆的水溶性超顺磁性四氧化三铁纳米粒子的制备方法，属于生物医学领域。
背景技术：
纳米技术是指在纳米范围内研究物质的结构及其变化规律，并应用于生产生活之中的技术。纳米粒子也叫超微颗粒，一般是指尺寸在1-100nm之间的粒子，是处在原子簇和宏观物体交界的过渡区域，从通常的关于微观和宏观的观点看，这样的系统既非典型的微观系统亦非典型的宏观系统，是一种典型介观系统。纳米材料处于从单个原子到块体材料的过渡区，因而造成了其表面电子结构和晶体结构变异，从而使得其具有区别块材的特殊效应，如小尺寸效应、量子尺寸效应、表面效应和宏观量子隧道效应等纳米效应，使得它们在磁、光、电、敏感等方面呈现出常规材料不具备的显著特征，从而在磁性材料、电子材料、光学材料、高致密度材料的烧结、催化、传感、陶瓷增韧等许多领域呈现广阔的应用前景。
近年来，磁性纳米材料由于其特殊的物理化学性能在磁共振成像(mri)、磁流体、催化和生物工程/生物医药等应用方面得到研究人员的广泛关注。四氧化三铁(fe3o4)纳米粒子是近年来发展一种新型纳米材料，由于其独特的磁学特性：超顺磁性和高矫顽力，同时因其具有小尺寸效应、良好的磁导向性、低毒性和良好的生物相容性等特点，广泛应用于mri及药物靶向等生物医学领域，并表现出巨大的潜力。目前，磁性氧化铁纳米粒子的合成方法有很多种，一般分为减小尺寸法(球磨法)、液相沉淀法、高温热解法、微生物法(趋磁菌培养)等。fe3o4纳米粒子的粒径大小、晶型以及磁饱和强度对其应用有着直接或间接影响，因而制备出具备组分均匀、形貌均一、尺寸分布窄以及可控等特点的高性能磁性纳米材料是其在生物和医学领域应用的前提，这使得fe3o4纳米粒子的合成与修饰具有重要意义。相对于其他的fe3o4纳米粒子制备方法，高温热解法制备出的磁性纳米粒子具有晶型较好、分散性好、粒径分布均一的特点，但是其水溶性较差，从而限制了它在生物医学等领域的应用。为了得到理想的功能化磁性纳米颗粒，对合成的纳米颗粒进行表面修饰改性以提高其在水溶液中的分散稳定性就显得十分必要。近年来，许多研究工作者都尝试用不同的方法对fe3o4纳米粒子进行修饰，以提高纳米粒子的水溶性、分散性、稳定性和生物相容性，比如prakash等人用脂肪酸对油溶性的fe3o4纳米粒子进行修饰，在形成双层纳米晶体的过程中，脂肪酸的碳链端朝向fe3o4纳米粒子表面原有的油性链，而其亲水端朝向水溶液，最终在纳米粒子表面形成第二层涂覆层，同时修饰后的纳米粒子具有良好的水分散性。xu等人用带有双官能团的二巯基琥珀酸(dmsa)对油溶性fe3o4纳米粒子表面的油酸进行配体交换，使纳米粒子由油相转化为水相。
作为一种天然生物活性多糖类化合物，肝素是获得美国食品药品管理局(fda)认证的最有效、使用最广泛的抗凝血药物之一。肝素(heparin)于1935年首先被提纯并命名，同年作为抗凝剂应用于治疗血栓性疾病，主要是由硫酸-d-葡萄糖胺、硫酸-d-艾杜糖醛酸和d-葡萄糖醛酸中两种双糖单位交替连接而成，是分子量为4～40kda的混合物。除了抗凝血作用，肝素分子中还含有与多种生长因子结合的位点，能够促进生长因子对细胞增殖、组织或器官修复和再生的作用。因此，近年来，肝素功能化生物材料受到极大关注。
由于羧基对氧化铁纳米粒子表面的结合能力较强，为了将肝素更好的包覆在纳米粒子表面，该发明首先用琥珀酸酐对肝素进行酯化以增加肝素结构中的羧基，然后将该琥珀酰肝素对油溶性fe3o4纳米粒子进行修饰，以提高纳米粒子的水溶性、分散性、稳定性和生物相容性。
技术实现要素：
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本发明拟解决的技术问题是提供一种单层包覆的水溶性超顺磁性四氧化三铁纳米粒子的制备方法，首先采用高温热分解法合成超顺磁性四氧化三铁纳米粒子，并用带大量羧基的多齿聚合物对得到的油溶性四氧化三铁纳米粒子进行表面修饰，制备出在水中具有良好分散性的超顺磁性四氧化三铁纳米粒子。本发明产品采用的琥珀酰肝素具有较好的亲水性和生物相容性等优异性能，可以在对纳米粒子粒径影响较小的情况下，
有效提高四氧化三铁纳米粒子的水溶性、分散性、稳定性和生物相容性。
本发明产品由如下步骤制备：
1.高温热解法制备四氧化三铁纳米粒子参照文献[sun，shouheng，andhaozeng.″size-controlledsynthesisofmagnetitenanoparticles.″journaloftheamericanchemicalsociety124.28(2002)：8204-8205.]。
2.琥珀酰肝素的制备：参照文献[wang，ying，etal.″target-specificcellularuptakeoftaxol-loasedheparin-peg-folatenanoparticles.″biomacromolecules11.12(2010)：3531-3538.]。
3.单层包覆的水溶性超顺磁性四氧化三铁纳米粒子的制备：将1mg-100mg(1)步骤所得的超顺磁性四氧化三铁纳米粒子溶于10ml-500ml干燥溶剂三氯甲烷中，并将1mg-500mg(2)步骤所得的琥珀酰肝素的三丁基铵盐加入到反应液中，室温下搅拌48h-96h后，用磁铁分离，得到的黑色固体，用适量己烷和二氯甲烷分别洗涤1-5次，最后，将形成的单层包覆的水溶性超顺磁性四氧化三铁纳米粒子保持于去离子水中，待用。
所述步骤3中超顺磁性四氧化三铁纳米粒子与琥珀酰肝素的三丁基铵盐的质量比为1∶0.1-1∶100。
所述步骤3中超顺磁性四氧化三铁纳米粒子的浓度为0.01mg/ml～10mg/ml。
所述步骤3中琥珀酰肝素的三丁基铵盐的分子量为2000～20000。
所述步骤3中琥珀酰肝素的三丁基铵盐可溶解于非极性有机溶剂-三氯甲烷中，并呈现良好的稳定状态。
所述步骤3中琥珀酰肝素的三丁基铵盐的浓度为0.01mg/ml～10mg/ml。
(1)高温热解法制备油溶性超顺磁性四氧化三铁纳米粒子：将0.1g-5.0g乙酰丙酮铁，0.1g-5.0g油酸，0.1g-5.0g油胺和5ml-50ml二苯醚氮气保护下混合搅拌均匀，并逐渐升温至100℃-300℃，反应0.5h-3h后，生成粒径为一的超顺磁性四氧化三铁纳米粒子，并用此方法，以小粒径的四氧化三铁纳米粒子为种子制备粒径为6nm-20nm的超顺磁性四氧化三铁纳米粒子；
(2)琥珀酰肝素的制备：0.1g-1.0g的肝素钠溶解在10ml-20ml水中，并将该溶液渗透通过酸化过的凝胶柱(h+形式，50ml-200ml)，之后用三丁胺溶液将溶液的ph调至6.0-7.0，将该溶液冷冻干燥，得到肝素的三丁基铵盐(0.1g-2.0g)。该将三丁基铵盐(0.1g-2.0g)溶解在5ml-40ml的干燥溶剂n，n二甲基甲酰胺(dmf)中，在氮气下保护下，将0.1-5.0g琥珀酸酐，0.1g-5.0g三乙胺和0.01g-5.0g4-二甲基氨基嘌呤(dmap)依次加入反应液，反应在室温下进行24h-72h后，将过量的溶剂蒸发掉，用适量的去离子水稀释后，将该溶液渗透通过酸化过的凝胶柱(h+形式，50ml-200ml)，之后用三丁胺溶液将溶液的ph调至6.0-7.0，将该溶液冷冻干燥，得到琥珀酰肝素的三丁基铵盐(0.1g-5.0g)；
(3)单层包覆的水溶性超顺磁性四氧化三铁纳米粒子的制备：将1mg-100mg(1)步骤所得的超顺磁性四氧化三铁纳米粒子溶于10ml-500ml干燥溶剂三氯甲烷中，并将1mg-500mg(2)步骤所得的琥珀酰肝素的三丁基铵盐加入到反应液中，室温下搅拌48h-96h后，用磁铁分离，得到的黑色固体，用适量己烷和二氯甲烷分别洗涤1-5次，最后，将形成的单层包覆的水溶性超顺磁性四氧化三铁纳米粒子保持于去离子水中，待用。
具体实施方式
实施例1：
(1)高温热解法制备油溶性超顺磁性四氧化三铁纳米粒子：将0.706g乙酰丙酮铁，0.565g油酸，0.535g油胺和20ml二苯醚氮气保护下混合搅拌均匀，并逐渐升温至265℃，反应1h后，生成粒径为一的4nm超顺磁性四氧化三铁纳米粒子，并用此方法，以小粒径的四氧化三铁纳米粒子为种子制备粒径为12nm的超顺磁性四氧化三铁纳米粒子；
(2)琥珀酰肝素的制备：1.0g的肝素钠溶解在5ml水中，并将该溶液渗透通过酸化过的凝胶柱(h+形式，200ml)，之后用三丁胺溶液将溶液的ph调至7.0，将该溶液冷冻干燥，得到肝素的三丁基铵盐(1.5g)。该将三丁基铵盐(1.5g)溶解在30ml的干燥溶剂n，n二甲基甲酰胺(dmf)中，在氮气下保护下，将5.0g琥珀酸酐，0.5g三乙胺和1.0g4-二甲基氨基嘌呤(dmap)依次加入反应液，反应在室温下进行48h后，将过量的溶剂蒸发掉，用适量的去离子水稀释后，将该溶液渗透通过酸化过的凝胶柱(h+形式，200ml)，之后用三丁胺溶液将溶液的ph调至7.0，将该溶液冷冻干燥，得到琥珀酰肝素的三丁基铵盐(2.0g)；
(3)单层包覆的水溶性超顺磁性四氧化三铁纳米粒子的制备：将10mg(1)步骤所得的超顺磁性四氧化三铁纳米粒子溶于50ml干燥溶剂三氯甲烷中，并将50mg(2)步骤所得的琥珀酰肝素的三丁基铵盐加入到反应液中，室温下搅拌48h后，用磁铁分离，得到的黑色固体，用适量己烷和二氯甲烷分别洗涤2次，最后，将形成的单层包覆的水溶性超顺磁性四氧化三铁纳米粒子保持于去离子水中，待用。
实施例2：
(1)同实施例1；
(2)同实施例1；
(3)单层包覆的水溶性超顺磁性四氧化三铁纳米粒子的制备：将20mg(1)步骤所得的超顺磁性四氧化三铁纳米粒子溶于50ml干燥溶剂三氯甲烷中，并将50mg(2)步骤所得的琥珀酰肝素的三丁基铵盐加入到反应液中，室温下搅拌72h后，用磁铁分离，得到的黑色固体，用适量己烷和二氯甲烷分别洗涤2次，最后，将形成的单层包覆的水溶性超顺磁性四氧化三铁纳米粒子保持于去离子水中，待用。
实施例3：
(1)高温热解法制备油溶性超顺磁性四氧化三铁纳米粒子：将0.706g乙酰丙酮铁，0.565g油酸，0.535g油胺和20ml二卞醚氮气保护下混合搅拌均匀，并逐渐升温至300℃，反应3h后，生成粒径为一的6nm超顺磁性四氧化三铁纳米粒子，并用此方法，以小粒径的四氧化三铁纳米粒子为种子制备粒径为14nm的超顺磁性四氧化三铁纳米粒子；同实施例1；
(2)单层包覆的水溶性超顺磁性四氧化三铁纳米粒子的制备：将30mg(1)步骤所得的超顺磁性四氧化三铁纳米粒子溶于40ml干燥溶剂三氯甲烷中，并将40mg(2)步骤所得的琥珀酰肝素的三丁基铵盐加入到反应液中，室温下搅拌72h后，用磁铁分离，得到的黑色固体，用适量己烷和二氯甲烷分别洗涤3次，最后，将形成的单层包覆的水溶性超顺磁性四氧化三铁纳米粒子保持于去离子水中，待用。
例3中制备出的水溶性超顺磁性四氧化三铁纳米粒子进行动态光散射测试，结果显示多齿聚合物涂层的厚度仅为2nm，且该水溶性超顺磁性四氧化三铁纳米粒子在水中的分散稳定性高达6个月。