用包含寡核苷酸的脂质体化学敏化的制作方法

专利名称：用包含寡核苷酸的脂质体化学敏化的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的、使用阳离子脂质体组合物使肿瘤组织对治疗，优选化学疗法或化学疗法和放射疗法的联合敏化，所述组合物包含寡核苷酸或寡核苷酸的组合，其与肿瘤组织表达的基因特异性结合。
背景技术：
化学疗法在治疗癌症中的应用是非常确实的。在癌症治疗中发现确定应用的化学疗法的实例包括作为名字的实例的他莫昔芬，托瑞米芬，顺铂，甲氨蝶呤，多柔比星(doxorubicin)，但很少。经常联合即在化学治疗方案中作为混合物(cocktail)，和经常联合其它类型的疗法例如放射、外科手术或基于抗体的疗法来使用这些化学疗法。
尽管化学疗法已经在治疗许多不同类型的癌症例如一些白血病，乳腺癌和前列腺癌中成功，但化学疗法受一些问题困扰。例如，化学疗法经常仅对有限数量的癌症有效。而且，许多化学疗法显示对非靶组织的毒性，例如它们可以导致肾中毒性。另一化学疗法普遍的问题是肿瘤组织可能变得耐受特定的化学疗法。例如，已知一些肿瘤变得耐受顺铂。
为了缓解这些问题，已知联合实施化学疗法由此最小化肿瘤将变得耐受化学疗法的风险。然而，该解决方案不能令人满意，因为它不能消除一些肿瘤变得耐受化学疗法的事实。这是不利的，因为它例如要求以更大剂量施用来引发细胞毒性以产生该化学疗法的功效。这是有问题的，因为对非靶组织的系统毒性的风险增加。而且，如果可能显著增加治疗的成本。
类似地已知肿瘤可能变得耐受电离辐射。例如，已经报导肿瘤耐受性可能与某些癌基因如ras，raf，cot，mos和myc以及生长因子如PDGF，FGF等的表达有关。
也已经报导寡核苷酸在治疗癌症中的应用，特别是靶向癌基因或特定癌表达的其它基因的反义寡核苷酸。然而，反义疗法也有一些抑制功效的问题，特别是这些寡核苷酸在体内不稳定并因此可能在它们到达靶位点例如肿瘤细胞或病毒感染的细胞之前被降解的事实。
增加寡核苷酸效力的尝试已经包括主要对磷酸二酯主链直接修饰合成几种类似物。例如，已经证实硫代磷酸酯寡核苷酸显示增强的对核酸酶消化的耐受性。其它对寡核苷酸的修饰已经包括用亲脂部分如胆固醇和聚赖氨酸衍生化以增强细胞吸收。备选地，在甲基膦酸酯的类似物中已经消除了分子的聚阴离子性质。
另一报导的方法已经涉及阳离子脂质体在增强传递中的应用。Bennet等，Mol.Pharmacol.，41023-1033(1992).Zelphati等，J.Lipsome.Res.，7(1)31-49(1997)；Thierry等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，190(3)952-960(1993)。已经广泛接受阳离子脂质体必须包含足够的电荷以中和带负电荷的寡核苷酸以及为复合体提供足够的残余正电荷以促进与带负电荷的细胞表面的相互作用。(Litzinger等，J.Liposome Research，7(1)51-61(1997))。然而，与先前阳离子脂质体传递系统类似有关的问题包括血清-不稳定性，不合乎需要的生物分布，和靶非特异性，其阻碍它们在体内有效核酸传递中的应用。
因此，改善化学抗性肿瘤的治疗将是非常有益的。
发明目的和概述本发明的目的是作为对化学疗法的辅助，通过给药至少一种寡核苷酸使肿瘤组织对化学疗法的作用敏化，所述寡核苷酸靶向肿瘤组织表达的基因。
本发明更具体的目的是通过给药至少一种反义寡核苷酸使肿瘤组织对化学疗法的作用敏化，所述寡核苷酸包含在血清稳定的阳离子脂质体传递系统中，其中所述包含寡核苷酸的阳离子脂质体可以在化学疗法之前，期间或之后施用。
本发明更具体的目的是使用作为阳离子脂质体传递系统的具有增强血清稳定性和靶向能力的脂质体，其包含二甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)，磷脂酰胆碱(PC)，和胆固醇(CHOL)，其包含至少一种靶向肿瘤组织表达的基因的寡核苷酸，以使肿瘤组织对化学疗法的作用化学敏化。
本发明另一具体目的是使用作为化学敏化阳离子脂质体传递系统的阳离子脂质体，其包含阳离子脂质1，2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基铵丙烷(1，2-dimyristoyl-3-trimethyl ammonium propane)(DMTAP)；磷脂酰胆碱(PC)，和胆固醇(CHOL)，其中已经包封至少一种针对肿瘤组织表达的基因的寡核苷酸。
本发明另一目的是使用作为化学敏化阳离子传递系统的阳离子脂质体，其包含至少一种选自下列各项的阳离子脂质1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(1，2-dioleoyl-3-trimethyl ammonium propane)(DOTAP)，N-(2，3-(二油酰基氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化铵，或1-[2-(9(Z)-十八碳烯酰基氧基)-乙基]-2-(8(Z)十七碳烯基)-3-(2-羟乙基)-咪唑啉鎓氯化物，磷脂酰胆碱(PC)和胆固醇(CHOL)。
本发明更具体的目的是使用作为化学敏化阳离子传递系统的阳离子脂质体，其包含1，2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基铵丙烷(DMTAP)；磷脂酰胆碱(PC)，和胆固醇，其中各自的摩尔比范围为0.5-1.4；2.0-4.0；和0.5-2.5；更优选0.75-1.25；3.0-4.0；和1.0-2.0；最优选约1∶3.2∶1.6，其还包含至少一种寡核苷酸。
本发明另一具体目的是生产包含阳离子脂质体的化学敏化制剂，所述阳离子脂质体包含二甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)，磷脂酰胆碱(PC)和胆固醇，其中各自的摩尔比为0.5-1.5；2.0-4.0；和0.5-2.5；更优选0.75-1.25；3.0-4.0；和1.0-2.0；最优选约1∶3.2∶1.6，其还包含至少一种靶向肿瘤表达的基因的寡核苷酸。
本发明另一具体目的是使用阳离子脂质体作为体内传递一种或多种寡核苷酸的载体，以使肿瘤特别是化学抗性肿瘤对特定化学疗法敏化，所述阳离子脂质体包含至少一种选自下列各项阳离子脂质1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DMTAP)，二甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)，1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)，N-(2，3-(二油酰基氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化铵和1-[2-(9(Z)-十八碳烯酰基氧基)-乙基]-2-(8(Z)十七碳烯基)-3-(2-羟乙基)-咪唑啉鎓氯化物；磷脂酰胆碱和胆固醇，其中总阳离子脂质，磷脂酰胆碱，和胆固醇的摩尔比优选范围为0.5-1.5；2.0-4.0；和0.5-2.5；更优选0.75-1.25；3.0-4.0；和1.0-2.0；最优选.8-1.2；3.0-3.5；和1.4-1.8。该寡核苷酸可以处于相对于基因靶的有意义或反义方向，所述基因靶由肿瘤组织表达，如癌基因。最优选地，寡核苷酸可以是反义寡核苷酸，优选具有约8-100个核苷酸，更优选15-40个核苷酸的serum。
本发明更具体的目的是使用本发明包含至少一种寡核苷酸的阳离子脂质体以使实体瘤和癌症对化学疗法的作用化学敏化，所述实体瘤和癌症包括头颈癌，前列腺癌，胰腺癌，乳腺癌，肺癌，肾癌，卵巢癌，脑癌，食管癌，肉瘤，癌，骨髓瘤，膀胱癌，肝癌，结肠癌，阴茎癌，B和T细胞淋巴瘤，白血病，睾丸癌，骨癌，和其它血液癌。
本发明另一具体目的是作为对化学疗法和任选地放射疗法的辅助，施用对应于优选选自ras，raf，cot，mos，myc，优选c-raf-1的癌基因部分，或生长因子PDGF，FGF，EGF)的反义寡核苷酸，以便使癌细胞对化学疗法和也可能放射疗法的作用敏化。优选地，将使用上述讨论的本发明阳离子脂质体阳离子脂质体传递系统施用这些寡核苷酸。可以修饰或不修饰包含在所述寡核苷酸中的碱基，这些寡核苷酸的大小优选为8-100个核苷酸；更优选12-60个核苷酸，最优选15-40，或15-25个核苷酸。
本发明更具体的目的是作为对化学疗法的辅助，施用优选包封在阳离子脂质体中的包含5’-GTG-CTCCATTGATGC-3’和/或5’-CCTGTATGTGCTCCATT-GATGCAGC-3’的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的碱基可以被修饰或不修饰。本发明另一具体目的是在施用化学疗法之前、同时、或之后，通过给药阳离子脂质体使肿瘤组织对化疗剂化学敏化，所述阳离子脂质体含有至少一种寡核苷酸，优选对应于肿瘤表达的表面或内部抗原或癌基因的反义寡核苷酸。
在更具体的实施方案中，阳离子脂质体传递系统将包含raf反义寡核苷酸，治疗的癌症将是前列腺癌，化学疗法将是对前列腺癌有效的疗法。
在本发明另一具体实施方案中，寡核苷酸将是化学修饰的，例如硫代磷酸化(phosphorothioated)的。
附图详述

图1ATG-AS raf ODN的脂质体胶囊化，如实验方法中所示将5’-荧光素标记的ATG-AS raf ODN包封在脂质体(PC/CHOL/DDAB)中。显示空白脂质体的明视场显微镜检术(a)，和空白脂质体的荧光显微镜检术(b)和包含荧光标记的ATG-AS raf ODN(C-H)的脂质体。
图2(a)LE-ATG-AS raf ODN的细胞吸收的时程，如实验方法所述将SQ-20B细胞与32P-5’末端标记的和过量未标记的LE-ATG-AS raf ODN(10μM)温育指定时间。结果为两次各自一式两份的独立实验的平均值±s.d。(b)LE-ATG-AS raf ODN的胞内稳定性。将细胞与32P-末端标记的和过量未标记的LE-ATG-AS raf ODN(10μM)在含有1％FBS的培养基中温育1小时，用PBS洗涤，然后在含有20％FBS的培养基中继续温育0小时(泳道2)，2小时(泳道3)，8小时(泳道4)，12小时(泳道5)，和24小时(泳道6)。如实验方法所示裂解细胞并通过变性凝胶电泳分析在各种样品中的ODN。显示泳道2，放射性标记的对照LE-ATG-AS rafODN；15-链节，ATG-AS raf ODN；二甲苯腈蓝(XC)和溴酚蓝(BP)的迁移。
图3LE-ATC-AS raf ODN的血浆浓度-时间曲线，将30mg/kgLE-ATG-AS raf ODN(上图)或TG-AS raf ODN(中图)施用于即Balb/dnu/nu小鼠中。如实验方法所示，在注射后指定时间从后眼眶窦收集血样，通过变性凝胶电泳提取和分析血浆样品中的ODN。通过掺加已知量的ATG-ASraf ODN于空白血浆中制备St标样。上图如下在电泳前稀释样品泳道1，12X；泳道2和3，4X；泳道4和5，3.3X；泳道6，2X；泳道7，1.4X；泳道8，1.3X；和泳道9，1X。St泳道表示0.25，0.5和1.0μg/ml的ATG-ASraf ODN。1.0μg/ml标样相当于18.4μg ODN。使用另外的标样(1.4至＞2对数范围)以测定24小时期间内的ODN浓度(数据未显示)。中图如下在上样前稀释样品泳道1，4X，泳道2和3，2X，泳道4，5和6，1X；泳道7，0.75X，泳道8和0，0.6X。St泳道表示0.125，0.25，和0.5μg/ml的ATG-AS raf ODN，0.5μg/ml标样相当于6.9ng ODN。下图上图所示LE-ATG-AS raf ODN的血浆浓度-时间曲线。基于与已知浓度的标样的比较，然后对用于上样的样品稀释因子归一化计算定量数据。
图4LE-ATG-AS raf ODN的组织分布曲线。在静脉内给药30mg/kgLE-ATG-AS raf ODN以后指定时间收集组织样品。从均化的组织中提取ODN，如实验方法所示用32P标记的ATG-S raf ODN探测。(a)来自肝和肾的代表性的放射自显影图，(b)在静脉内施用30mg/kg剂量的LE-ATG-AS raf ODN以后在指定时间不同组织中ATG-AS raf ODN的浓度。基于与已知浓度的标样比较，然后对收集的器官的重量归一化计算定量数据。
图5LE-ATG-AS rad ODN抑制Raf-1蛋白表达的特异性，(a)时程分析，在含有1％FBS的培养基中用10μm LE-ATG-S raf ODN(AS)，或LE-ATG-S rad ODN(S)处理对数生长的SQ-20B细胞指定时间。将未处理的对照细胞(C)或用空白脂质体(10μm)处理的细胞同时转移到含有1％FBS的培养基中8小时。将全部细胞裂解物对总蛋白含量归一化并用琼脂糖偶联的多克隆抗-Raf-1抗体(Santa Cruz)免疫沉淀。如实验方法所述用多克隆抗-RAF-1抗体免疫印迹免疫复合体(上)。将来自三次独立实验的结果定量并表示相对于LE-ATG-S raf ODN-处理细胞中的Raf-1水平的数据(下)，(b)剂量-反应分析，在含有1％FBS的培养基中用指定浓度的LE-ATG-AS raf ODN(AS)或LE-ATG-S raf ODN(S)处理对数生长的SQ-20B肿瘤细胞8小时。分析归一化的细胞裂解物的RAF-1表达(上)。相对于在LE-ATG-S raf ODN-处理的细胞中Raf-1的水平表示来自三次独立实验的定量数据(下)。
图6LE-ATG-AS raf ODN抑制Raf-1蛋白激酶活性，在含有1％FBS的培养基中用120μm LE-ATG-AS raf ODN(AS)或10μm LE-ATG-S rafODN(S)处理对数生长的SQ-20B细胞8小时。将对照细胞(C)同时转移至含有1％FBS的培养基中8小时。将全部细胞裂解物对蛋白含量归一化，如实验方法所述使用它的生理底物，MKK1体外测定Raf-1的磷酸转移酶活性。通过电泳分离放射性标记的反应产物，并放射自显影(插图)。将来自两次各自一式两份进行的独立实验的定量数据表示为相对于LE-ATG-S raf ODN-处理的细胞的LE-ATG-AS raf ODN-处理的细胞中Raf-1的酶促活性。
图7LE-ATG-AS raf ODN的静脉内给药对正常和肿瘤组织中Raf-1表达的影响。在连续5天静脉内注射6mg/kg日剂量的LE-ATG-AS rafODN(AS)或LE-ATC-S raf ODN(S)后，在Balb/c nu/nu小鼠的肝、肾和SQ-20B肿瘤异种移植物中研究Raf-1的表达。对照小鼠(C)接受生理盐水。通过免疫沉淀法和免疫印迹法将显示裂解物中Raf-1表达的代表性数据对蛋白质含量归一化(上)。定量数据表示为来自三只小鼠的平均值±标准偏差(下)。
图8通过瘤内给药LE-ATG-AS raf ODN抑制SQ-20B肿瘤异种移植物中Raf 1蛋白质的表达如实验方法所示每只动物以4mg/kg的日剂量在右侧接受LE-ATG-AS raf ODN(AS)的瘤内注射和在左侧接受LE-ATG-Sraf ODN(S)的瘤内注射达7天。显示来自两只代表性动物的右(AS)和左(S)侧肿瘤异种移植物中Raf-1的表达(插图)。显示的定量数据是来自3只代表性小鼠的平均值±标准偏差。
图9SQ-20B细胞中反义序列特异性抑制Raf-1表达。
(A)如材料和方法所述，用指定ODN浓度的LE-5132(泳道3，5和10)，5132(泳道4和6)，或LE-10353(泳道9)处理对数生长的SQ-20B细胞。对照细胞或者留下未处理(泳道1和7)或者用1μM空白脂质体(BL)处理(泳道2和8)。将全部细胞裂解物对总蛋白含量归一化并用琼脂糖偶联的多克隆抗-Raf-1抗体免疫沉淀。通过7.5％SDS-PAGE分离免疫复合体并用多克隆抗-Raf-1抗体免疫印迹。(B)将来自3次独立实验的数据定量并表示为相对于未处理细胞中Raf-1的水平。
图10LE-5132对凝固时间的影响。将正常人的血浆与指定浓度的LE-5132或5132或留下未处理的混合，并在37℃下与APTT试剂(含有变应性酸激活剂的纯化的兔脑脑磷脂提取物)温育1分钟。通过加入氯化钙引发凝固反应，以秒相互记录形成可见凝块所需时间。数据表示来自3次实验的平均值＝SD。
图11LE-5132和5132的血浆浓度-时间曲线；将30mg/kg LE-5132或5132静脉内施用于Balb/c nu/nu小鼠。在注射后指定时间从后眼眶窦收集血样，如所述通过变性凝胶电泳提取和分析血浆样品中的ODN。通过掺加已知量的5132于空白血浆中制备S1，S2和S3标样。(A)如下在电泳前稀释样品泳道1，15X；泳道2，10X；泳道3和4，5X；泳道5，1X；泳道6-9，0.8X。(B)如下在电泳前稀释样品泳道1，15X；泳道2，10X；泳道3和4，5X；泳道5，1X；泳道6-9，0.8X；S1，S2和S3分别表示0.25，0.5，和1.0μg/ml 5132；1.0μg/ml标样相当于20ng ODN。(C)LE-5132和5132的血浆浓度-时间曲线。基于与已知浓度的标样比较计算定量数据，然后对用于上样的样品稀释因子归一化。
图12正常组织LE-5132/5132的药物动力学，其为浓度-时间曲线下面积(AUC)的函数。如图11在给药30mg/kg LE-5132或5132以后0-48小时之间收集组织样品。从均化组织中提取ODN并用(32P)-标记的有意义raf ODN探测。基于与已知浓度的标样比较进行定量分析，然后对收集的器官重量归一化。
图13LE-5132对SW-20B肿瘤生长的影响。将SQ-20B肿瘤细胞(2×106)a.c.注射到每只雄性Balb/c nu/nu小鼠的左侧区域中。10-12周龄。将肿瘤异种移植物培养到平均肿瘤体积为94±6.4mm3，将动物随机化成两个治疗组。第0天表示治疗的首日。开始7天每日一次对小鼠静脉内给予6mg/kg LE-5132或空白脂质体(BL)，接着每隔日给予6次另外剂量，如箭头所示。在第30日杀死动物。所示数据为每组5-7只动物的平均值±SE。
图14LE-5132对SQ-20B肿瘤中Raf-1蛋白水平的影响。(A)用LE-5132(静脉内，10mg/kg)或IR(3.8Gy/日)或两者治疗携带肿瘤的小鼠，如图7的图例所示。在治疗的第7日(泳道1和2)和第14日(泳道3-8)切除表示各种治疗组的肿瘤。通过免疫沉淀法接着免疫印迹法对蛋白质含量归一化的组织匀浆中检测Raf-1的表达。泳道1，未治疗的对照；泳道2和3，BL；泳道4，IR；泳道5和6，LE-5132；泳道7和8，LE-5132+IR，(B)所示定量数据是来自2只动物的平均值±SE。
图15LE-5132和电离辐射对SQ-20B肿瘤生长的影响。(A)在所述雄性Balb/c nu/nu小鼠中培养SQ-20B肿瘤异种移植物。将携带平均肿瘤体积为72.0±4.3mm3的动物随机化成5个治疗组。第0天表示治疗的首日。用LE-5132 10mg/kg i.v.(LE-5132)，每日电离辐射一次3.8Gy(IR)，或这两种治疗联合(LE-5132+IR)治疗小鼠指定日。对照组接受空白脂质体(BL)或无治疗(C)。在第45日杀死动物。所示数据为每组5-7只动物的平均值±SE。(B)在第30日不同治疗组中平均肿瘤体积的倍数(fold)变化。所示数据是来自两次独立实验的平均值±SE。每次实验每组5-7只动物。*p＜0.001。
图16SQ-20B肿瘤的组织病理学。在最终治疗后24小时切除肿瘤。所示为未治疗肿瘤(A)和用LE-5132(B)，IR(C)，或LE-5132+IR(D)治疗的肿瘤的组织病理学的实例。X 250。
图17包含剂量-反应摄取实验的体外结果，其使用未标记的反义raf寡(ATG-AS)，游离(ATG-AJC)或脂质体(DMTAP＝PC＝CHOL)包封形式(LE-ATG-AS)。
图18包含在SQ-20B定时(timer)细胞中时程摄取实验的结果，该实验使用游离(ATG-AS)或脂质体包封(LE-ATG-AS)的raf寡核苷酸。
图19包含稳定性实验的一半，该实验比较游离(ATG-AS)或脂质体包封(LE-ATG-AS)μm的raf寡核苷酸的稳定性。
图20包含另一稳定性实验的结果，该实验比较游离raf寡核苷酸(ATG-AS)或脂质体包封的(LE-ATG-AS)的稳定性。
图21包含施用静脉内注射的DMTAP∶PC∶CHOL脂质体的小鼠/CD2F1小鼠的存活数据。
图22包含施用raf寡核苷酸的小鼠CD2F1小鼠的存活数据，所述raf寡核苷酸包封在DMTAP∶PC∶CHOL脂质体中(LE-ATG-AS)。
图23LEraf Aon联合顺铂在携带人前列腺癌(PC-3)异种移植物的无胸腺nu/nu小鼠中的抗肿瘤功效。用0.2ml磷酸盐缓冲盐水中的5×106个PC-3细胞/只动物将雄性无胸腺小鼠皮下(s.c)接种。1周2次监视肿瘤生长直至肿瘤体积为60mm3-100mm3。将动物随机化成上示5个治疗组(n＝8)。通过尾静脉用指定剂量静脉内治疗小鼠，1周2次监视肿瘤大小。所示值为平均值±s.d.。
图24LEraf AON联合表柔比星在携带人前列腺癌(PC-3)异种移植物的无胸腺nu/nu小鼠中的抗肿瘤功效。用0.2ml磷酸盐缓冲盐水中的5×106个PC-3细胞/只动物s.c.接种雄性无胸腺小鼠。1周2次监视肿瘤生长直至肿瘤体积为60mm3-100mm3。将动物随机化成上示5个治疗组(n＝6)。通过尾静脉用指定剂量静脉内治疗小鼠，1周2次监视肿瘤大小。所示值为平均值±s.d.。
图25LEraf AON联合米托蒽醌(mixotantrone)在携带人前列腺癌(PC-3)异种移植物的无胸腺nu/nu小鼠中的抗肿瘤功效。用0.2ml磷酸盐缓冲盐水中的5×106个PC-3细胞/只动物s.c.接种雄性无胸腺小鼠。1周2次监视肿瘤生长直至肿瘤体积为60mm3-100mm3。将动物随机化成上示5个治疗组(n＝5)。通过尾静脉用指定剂量静脉内治疗小鼠，1周2次监视肿瘤大小。所示值为平均值±s.d.。
图26A脂质体包封的raf反义寡脱氧核糖核苷酸(LErafAON)和Gemzar(NDC 0002+7501+01，吉西他滨HCl，Eli Lilly和Company，Indianapolis，IN)的联合在携带人胰腺癌异种移植物(Colo357)的无胸腺小鼠中的抗肿瘤功效。将无胸腺小鼠接种约1×106个Colo357人胰腺癌细胞。使肿瘤体积大小达到50-100mm3。将携带肿瘤的小鼠随机分组为5种治疗类(n＝5)。如先前所述制备LErafAON制剂(Gokhale等，Gene Therapy 4，1289-1299，1997；和Gokhale等，准备手稿)。抗癌药物Gemzar(200mg小瓶)购自Georgetown大学医院的肿瘤学药房并在生理盐水中重建(12.5mg/ml)。在指定日静脉内注射LErafAON(25.0mg/kg)或Gemzar(750mg/kg)。1周2次测量肿瘤体积，将各种治疗组中的肿瘤大小(％初始)作图。如该图所示，与单一试剂治疗组(LErafAON和Gemzar)或对照组(N.S.生理盐水，BL，空白脂质体)相比，在联合治疗组(LErafAON加Gemzar)中注意到显著的肿瘤生长抑制。所示值为平均值±s.d.。
图26B脂质体包封的raf反义寡脱氧核糖核苷酸(LErafAON)和Gemzar(NDC 002+7501+01，吉西他滨HCl，Eli Lilly和Company，Indianapolis，IN)的联合在携带人胰腺癌异种移植物(Aspc-1)的无胸腺小鼠中的抗肿瘤功效。将无胸腺小鼠接种约2.5×106个Aspc-1人胰腺癌细胞。使肿瘤体积大小达到50-100mm3。将携带肿瘤的小鼠随机分组为5种治疗类(n＝5)。如先前所述制备LErafAON制剂(Gokhale等，Gene Therapy 4，1289-1299，1997；和Gokhale等，准备手稿)。抗癌药物Gemzar(200mg小瓶)购自Georgetown大学医院的肿瘤学药房并在生理盐水中重建(12.5mg/ml)。在指定日静脉内注射LErafAON(25.0mg/kg)或Gemzar(100mg/kg)。1周2次测量肿瘤体积，将各种治疗组中的肿瘤大小(％初始)作图。如该图所示，与单一试剂治疗组(LErafAON和Gemzar)或对照组(N.S.生理盐水，BL，空白脂质体)相比，在联合治疗组(LErafAON加Gemzar)中注意到显著的肿瘤生长抑制。所示值为平均值±。
发明详述本发明涉及阳离子脂质体制剂在使肿瘤对化学疗法作用敏化中的应用，所述阳离子脂质体制剂包含至少一种靶向肿瘤例如实体瘤表达的基因的寡核苷酸。在以下结合作为参考的较早申请中，本发明人证明新的阳离子脂质体传递系统使肿瘤细胞对放射疗法的作用更敏感。本申请是该发现的延伸，因为现在已经表明该相同的阳离子脂质体传递系统使肿瘤细胞对化学疗法更敏感。基于其上，本发明涉及阳离子脂质体在使肿瘤组织对化学疗法的作用敏化中的应用，所述阳离子脂质体优选包含与磷脂酰胆碱(PC)和胆固醇(CHOL)结合的选自以下各项的至少一种阳离子脂质二甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)，1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DMTAP)，N-(2，3-(二油酰基氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化铵和1-[2-(9(Z)-十八碳烯酰基氧基)-乙基]-2-(8(Z)十七碳烯基)-3-(2-羟乙基)-咪唑啉鎓氯化物；1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)，该脂质体包含至少一种寡核苷酸。优选地，阳离子脂质∶磷脂酰胆碱∶胆固醇的摩尔比优选为0.5-2.5∶2.0-4.0∶0.5-0.5-2.5，更优选.7-1.5∶2.5-3.5和1.0-2.0；最优选0.8-1.2∶3.0-3.6和1.4-1.8。
阳离子脂质∶磷脂酰胆碱∶胆固醇特别优选的摩尔比约为1∶3.2∶1.6。通过已知方法可以制备本发明的阳离子脂质体。优选方法在以下实施例中描述。基本上，该方法包含将脂质溶解在溶剂(例如氯仿或甲醇)中，蒸干，在低温下水合，将活性剂(例如寡核苷酸)加入磷酸盐缓冲盐水(PBS)，剧烈涡旋和超声处理，去除非包封的寡聚物(oligo)。这些方法已经发现提供高包埋效率(90％或更高)。得到的脂质体包封的寡聚物可以保存在例如4℃和此后使用。例如，在脂质体包封寡聚物的情形中，脂质体可以保存至少约2周。
将本发明的阳离子脂质体用于包封期望的寡核苷酸，和任选地另一种活性剂，例如肽或蛋白质(例如抗体，生长因子，细胞因子，酶激素，受体或片段)，药物或化疗剂，放射性核素，寡糖，荧光团，或诊断剂(如放射性核素，可检测酶或荧光团)。在优选实施方案中，将使用本发明阳离子脂质体包封反义寡核苷酸，其靶向化学疗法治疗的肿瘤特异性表达的基因。还更优选反义寡核苷酸将结合癌基因如raf。
如实施例所示，已经发现按照本发明的阳离子脂质体提供高包埋效率，长期(即8小时或更长)保护寡核苷酸不在血浆中降解，有效传递到靶细胞和增强完整寡核苷酸的胞内有效性；和极有效地加强化学疗法和放射疗法的作用。
此外，如本文实施例所示，本发明含有寡聚物的阳离子传递系统加强电离辐射和化学疗法对肿瘤组织的作用，所述肿瘤包括耐受化学疗法和辐射作用的肿瘤。尽管不希望受他们的信念束缚，本发明假设本发明的阳离子传递系统极有效地将寡聚物传递到靶位点，即表达为寡聚物靶向的基因的肿瘤，这抑制该基因的表达。这又被认为使这些细胞对化学疗法和/或放射疗法的作用更敏感。一种假说是这对细胞有作用，使细胞对编程性细胞死亡更敏感。优选地，寡聚物将包含修饰的碱基以增强体内稳定性。然而，本发明包含或不包含修饰碱基的寡核苷酸的应用，例如对硫代磷酸酯主链的修饰，如硫代磷酸酯修饰的寡聚物，和亲脂性修饰的寡聚物(例如胆固醇或聚-L-赖氨酸)。
优选地，寡核苷酸将是对应于癌基因如raf，ras，cot，mos，myc，myb，erb-2，或病毒基因的一部分的反义寡核苷酸，并且将抑制涉及癌症发作或进展的基因的表达。在优选实施方案中，这些脂质体包封的寡核苷酸将用于治疗耐受化学疗法和任选地放射疗法的癌症。如所述，阳离子脂质体可以还包含除了寡核苷酸以外的活性剂，条件是它们的掺入对寡聚物/阳离子传递系统无不利影响。考虑这个因为通过多种不同治疗方案治疗癌症非常确实。备选地，如果使用另外的活性剂，可以将它以裸露形式或使用不同的传递系统施用。
如所发现，寡聚物/阳离子传递可以在化学疗法或放射之前，同时和/或之后施用。
此外，本发明的脂质体可以用于包封肽，例如半抗原肽，蛋白质，抗体激素，生长因子及其片段，化疗剂，放射性核素，寡糖，凝集素，受体，细胞因子或单核因子，抗肿瘤剂，和其它活性剂。其实例包括作为实例的白细胞介素，干扰素类(α，β，γ)，集落刺激因子，肿瘤坏死因子，甲氨蝶呤，顺铂，多柔比星，daonorubicin，成纤维细胞生长因子，和血小板衍生生长因子。
放射性核苷酸的实例包括作为实例的钇，铟，和碘的放射性活性物质。
包封在本发明脂质体中的活性剂的量将至多是在包封后维持脂质体稳定性的量。在寡核苷酸的情形中，寡核苷酸的量将为约0.1-1,000μg寡聚物/mg脂质，更优选约1-100μg寡聚物/mg脂质，最优选约10-50μg寡聚物/mg脂质。
然而，该量将随不同的活性剂而变化。本发明脂质体将与药用载体如葡萄糖，和盐水磷酸盐缓冲盐水结合施用。此外，脂质体可以包括经常用于药物配制的防腐剂，乳化剂或表面活性剂。
本发明包含活性剂的脂质体可以通过不同方法施用。全身和非全身给药方法是适当的。这些方法包括注射(肌内，动脉内，腹膜内，静脉内，瘤内或其它位点特异性注射，鞘内)，吸入，口服给药，和局部方法。给药的优选方法包括瘤内和静脉内给药方法。
剂量有效量将取决于包封剂，治疗的疾病或病症，治疗的患者，其它疗法，和其它已知因素。在寡核苷酸的情形中，局部剂量将为约0.1μg-约500μg。典型地，将施用致使寡聚物或其它试剂的血清浓度为约0.1μg-1000μg/ml的量。
如所述，已经意外地发现寡核苷酸，例如反义寡核苷酸，当用作放射疗法、化学疗法的辅助时，加强放射疗法和化学疗法的作用。例如，已经显示例如对应于癌基因如raf的反义寡核苷酸可以用于增强肿瘤细胞对化学疗法和放射疗法的敏感性，由此增强功效。尽管不希望由此受约束，推理这些寡核苷酸可以使肿瘤细胞对裂解或细胞程序死亡(编程性细胞死亡)更敏感。
特别地，这已经用raf反义寡核苷酸证明。在本发明的该实施方案中，对应于癌基因如raf的反义寡核苷酸将优选以脂质体包封形式在化学疗法和/或电离辐射治疗之前，同时或之后不久施用。
在包括放射疗法的本发明的联合中，通过已知方法例如通过使用[MCs]辐射，或其它适当的装置将辐射传递至肿瘤位点实施辐射。辐射量将是足以提供肿瘤消退或缓解的量。如结果所证明，已经发现反义寡核苷酸和辐射或化学疗法的联合使用对肿瘤缓解，特别是对耐受辐射的肿瘤具有协同作用。因此，本发明可以使用比先前疗法更低剂量的辐射或化学疗法。然而，当然，辐射或化学疗法的量将取决于包括患者病症，体重，其它任何疗法等的因素。适当的辐射剂量和治疗方案的选择完全在本领域普通技术人员的权限内。
施用的寡核苷酸的大小将优选不超过100个核苷酸，更优选不超过40个核苷酸，或约8-40个核苷酸，更优选约15-40或15-25个核苷酸。反义寡核苷酸的大小是这样的以致在体内给药后通过干扰基因或使肿瘤细胞对放射疗法敏感而产生抗肿瘤效果，所述基因的表达涉及肿瘤生长，转移或编程性细胞死亡。
本发明包括本发明寡聚物/阳离子脂质体传递系统结合任何化学治疗剂或化学治疗剂组合的应用，其功效由此增强。优选地，寡聚物/阳离子脂质体传递系统将用于治疗例如作为长期给药特定化学治疗剂的结果耐受化学疗法的肿瘤。
特别地，如实施例所示，已经在几种肿瘤模型中观察到几种包含在按照本发明的阳离子脂质体制剂中的寡核苷酸的给药，提高了许多不同化学治疗剂在人前列腺癌和人胰腺癌的小鼠肿瘤模型中的功效。基于相对于用脂质体组合物或单独化学治疗剂治疗的动物和还特别是相对于对照的减小的肿瘤体积和肿瘤生长抑制，显示增强的功效。几种不同化学治疗剂，表柔比星，米托蒽醌，顺铂，Gemzar和吉西他滨HCl显示增强的功效。这些结果包含在图23-26中。
基于这些结果，预计本发明含有寡聚物的阳离子脂质体组合物可以用作增强其它单独或组合的化学治疗剂的方法，所述化学治疗剂包括作为实例的烷基化剂，抗代谢物，编程性细胞死亡诱导剂，顺铂配位复合体天然产物，激素，激素拮抗剂，受体激动剂和受体拮抗剂，蒽二酮，取代脲(area)，甲肼衍生物，肾上腺皮质抑制剂，小分子抑制剂，肽，抗体和抗体片段，酶抑制剂和诸如酪氨酸激酶抑制剂。
这些化学治疗剂的具体实例包括多柔比星，柔红霉素，甲氨蝶呤，adriamycin，他莫昔芬，托瑞米芬，顺铂，表柔比星，多西他赛(docetaxal)，紫杉醇(paclitatol)，Gemzar，吉西他滨HCl，米托蒽醌，和其它已知用于治疗癌症的化学治疗剂。
其中要求的联合治疗有效的癌症的实例包括实体和非实体瘤，包括已经转移的那些。治疗可以用于从癌症前期损伤至晚期癌症的任何阶段的癌症。具体的实例包括前列腺癌，胰腺癌，乳腺癌，B和T细胞白血病，和淋巴瘤，骨癌，头颈癌，胃癌，膀胱癌，食管癌，肺癌(例如大细胞，小细胞)，卵巢癌，睾丸癌，骨髓癌，肉瘤，癌，脑癌，及其它。
在优选实施方案中，治疗的癌症将包含表达raf的肿瘤，如人胰腺癌或人前列腺癌，化学治疗剂将包含顺铂，米托蒽醌，表柔比星；吉西他滨，或Gemzar。
当单独或与其它化合治疗剂结合施用时，施用的化学治疗剂的量和疗法对于具体化学治疗剂通常是常规的。例如，这些剂量可以为约0.00001g/kg体重至约1-5g/kg体重，其取决于具体的化学治疗剂和它是否与其它疗法联合。化学治疗剂将在给药按照本发明的寡聚物/阳离子脂质体组合物之前，同时或之后施用。优选地，化学治疗剂将在脂质体组合物之后施用。推理本发明阳离子组合物使肿瘤细胞对编程性细胞死亡更敏感。然而，本发明人不想受他们的信念束缚。
阳离子脂质体组合物和化学治疗剂将典型地例如通过皮下，腹膜内，静脉内，肌内，瘤内，或鞘内注射肠胃外施用。组合物通常将包含载体或赋形剂，例如缓冲盐水。
此外化学治疗剂还可以与其它疗法结合使用，所述其它疗法例如辐射，radiommotherapy(RIT)，治疗性酶，激素治疗，和尤其是外科手术或上述讨论的。
实施例1材料和方法寡脱氧核糖核苷酸在Biosearch 8750 DNA合成仪上使用β-cyanoethyl phosphoramidite化学在L of strand Labs Limited(Gaithersburg，MD，USA)合成针对人c-rnf-1cDNA翻译起始位点的寡脱氧核糖核苷酸序列。有意义(ATG-S)和反义(ATG-AS)raf ODN序列分别是5’-GCAT-CAATGGAGCAC-3’和5’-GTG-CTCCATTGATGC-3’。使用3H-1，2-苯并-二硫杂环戊二烯-3-1，1，1-二氧化物作为硫化剂，将每个末端的一个末端碱基键修饰成硫代磷酸酯基团。以15μm的规模合成寡聚物并在反相色谱柱上纯化。关于质量控制，将每种寡聚物制剂的少量等分部分32P-末端标记并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(20％丙烯酰胺和5％双丙烯酰胺(bis))显示，接着光密度扫描标记产物。
对于5’-荧光素标记的ATG-AS/S raf ODN的合成，如上所述将3’和5’碱基键修饰为硫代磷酸酯基团。在最后3个合成循环期间将荧光素phosphoramidite(1-二甲氧基三基氧基-2-(N-硫脲-(二-O-新戊酰基-荧光素)-4-氨基丁基-丙基-3-O-(2-氰基乙基)-(N，N-二异丙基)-磷-amidite))偶联至5’末端。偶联由以下组成同时加入和与乙腈中的0.25ml 0.1-M荧光素亚酰胺溶液和乙腈中的0.25ml 0.45-M四唑溶液温育15分钟。在合成后，在1.0ml 30％氢氧化铵中在室温下将ODN脱保护并从载体上裂解24小时。在脱保护期间，将荧光素标记修饰成与当使用异硫氰酸荧光素(FITC)制备时相同的结构。使用标准反相色谱柱进行纯化。在1.0ml 20％的乙腈中从柱中洗脱纯化的ODN，干燥并重悬浮于水中。
阳离子脂质体的制备阳离子脂质，1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)，1，2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基铵丙烷(DMTAP)，和二甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)购自Avanti Polar Lipids(Alabaster，AL，USA)。以1∶3.2∶1.6的摩尔比使用三种阳离子脂质之一，磷脂酰胆碱(PC)和胆固醇(CHOL)制备空白脂质体。简短地，使用旋转真空蒸发器在圆底烧瓶中将溶解在氯仿或甲醇中的脂质蒸干。通过加入磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的1ml 1.0mg/ml ODN，在4℃下将干燥的脂质膜水合过夜。通过剧烈涡旋将膜分散，在槽型超声波仪(Laboratory Supplies，Hicksville，NY，USA)中将脂质体混悬液超声处理5分钟。ODN与脂质的比率为30μg ODN/mg脂质。通过洗涤脂质体和在PBS中在25000g下离心30分钟3次去除未包封的ODN。ODN的包埋效率通过等分试样的制剂的闪烁计数测定，其中将痕量32P-末端标记的ODN加入过量未标记的ODN。脂质体包封的ODN保存在4℃，并在制备2周内使用。在缺少ODN下完全如上所述制备空白脂质体。
细胞培养从全程放射治疗失败的患者的喉扁平细胞癌建立SQ-20B肿瘤细胞。43在Dulbecco改进的Eagle培养基(GIBCO BRL，Grand Island，NY，USA)中单层培养肿瘤细胞，所述培养基中补充有20％热失活胎牛血清(FBS)，2mM谷氨酰胺，0.1mM非必需氨基酸，0.4μg/ml氢化可的松，100μg/ml链霉素和100U/ml青霉素。
胞内raf ODN摄取和稳定性测定将对数生长的SQ-20B细胞接种到6孔平板(1×106个细胞/孔)含有20％FBS的培养基中。次日，将细胞转移至含有1％FBS的培养基并在37℃下与10μM32P-标记的LE-ATG-AS raf ODN或ATG-AS raf ODN(1×106c.p.m./ml)温育。在温育不同时间间隔后，用PBS洗涤细胞，胰蛋白酶化并离心。用PBS漂洗细胞沉淀2次，重悬浮于0.2-M的甘氨酸(pH 2.8)中，然后用PBS再次洗涤。该处理剥去膜结合的ODN，剩余的放射性被解释为表示ODN的胞内水平。然后在1％SDS中裂解细胞沉淀，胞内放射性通过液体闪烁计数测定。
关于ODN稳定性研究，将细胞接种，在含有1％FBS的培养基中在37℃下与10μM32P-标记的LE-ATG-AS raf ODN或ATG-AS raf ODN(1×106c.p.m./ml)温育4小时。在这与ODN初始温育后，用PBS洗涤细胞3次并转移至含有20％FBS的培养基中。温育持续不同时间，接着胰蛋白酶化和用PBS洗涤。将细胞沉淀在10mM Tris-HCl，200mM NaCl，1％SDS，200μg/ml蛋白酶K，pH 7.4中在37℃下温育2小时。用酚∶氯仿提取ODN，收集含水级分并通过闪烁计数分析等分试样。将样品对相等的放射性归一化以便校正ODN可能随时间流出量，接着在15％聚丙烯酰胺/7M脲凝胶中电泳，并放射自显影。
raf ODN的药理学处置研究按照认可程序在Georgetown大学的Research Resources Facility保养雄性Balb/c nu/nu小鼠(Charles River，Raleigh，NC，USA；10-12周龄)，给料purina食物(chow)，水无限制。通过尾静脉用30mg/kg LE-ATG-AS rafODN或ATG-AS raf ODN静脉注射小鼠。在注射后5分钟，15分钟，30分钟，1小时，2小时，4小时，8小时，24小时和48小时，在麻醉下将每组中的一只动物从后眼眶窦放血至肝素化的管中，并通过颈脱臼杀死。立即在300g下将血液4℃离心10分钟以分离血浆。快速切除肝，肾，脾，心和肺并在冰冷的生理盐水中漂洗。将血浆和器官保存在-70℃直至进一步分析。
使用酚-氯仿提取法从血浆样品中，和使用DNA提取试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA，USA)从组织中分离反义raf ODN。通过在空白血浆或空白组织样品中加入已知量的ATG-AS raf ODN，接着如上所述提取制备rafODN浓度标样。将提取物加样在20％聚丙烯酰胺/3M脲凝胶上并在TBE缓冲液中电泳。在0.5x TBE缓冲液中在20V下将凝胶电印迹在尼龙膜上1小时，在Quickhyb缓冲液(Stratagene)中在30℃下用32P-标记的有意义探针(ATG-S raf ODN)探测印迹过夜。通过使用T4多核苷酸激酶用γ-32-P-ATP 5’-末端标记ATG-S’raf ODN和在Chroma Spin-10柱(Clontech，Palo Alto，CA，USA)上纯化产生放射性标记的探针。使用10-50倍过量的探针以确保所有条带的饱和。使用计算机程序(ImageQuant software，Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA，USA)扫描放射自显影，通过与标样比较计算在各种样品中的ATG-AS raf ODN的量。
S/AS raf ODN的体内传递在轻微麻醉下在雄性Balb/c nu/nu小鼠的两侧的侧面区域皮下注射对数生长的SQ-20B细胞(2×106个细胞)。在ODN治疗开始前允许肿瘤生长至平均肿瘤体积为115mm3。遵循两种治疗途径静脉内和瘤内。对于静脉内传递，将小鼠随机分成6组。每组3只小鼠经由尾静脉通过大丸剂输注静脉内接受LE-ATG-AS，LE-ATG-S，ATG-AS，ATG-S，空白脂质体或生理盐水，6mg/kg的日剂量共5天。在最后治疗后24小时杀死小鼠，快速切除器官和肿瘤组织，在冰冷的生理盐水中漂洗并保存在-70℃。
对于瘤内传递，将小鼠随机分成3组。1组3只小鼠每日接受4mg/kg在右侧LE-ATG-AS raf ODN和在左侧LE-ATG-S raf ODN的瘤内注射，共7天。两对照组，每组3只小鼠接受生理盐水或空白脂质体。在最后治疗后24小时杀死小鼠，切除肿瘤组织，在冰冷生理盐水中快速漂洗并保存在-70℃。
Raf-1免疫沉淀和免疫印迹测定对于体外实验，在含有1％FBS的培养基中将对数生长的SQ-20B细胞暴露于不同剂量的LE-ATG-AS raf ODN，LE-ATG-S raf ODN或空白脂质体不同时间间隔。在温育后，在含有500mM Hepes(pH 7.2)，1％NP-40，10％甘油，5mM原钒酸钠，1mM苯甲基磺酰氟，20μg/ml亮抑肽的缓冲液中裂解细胞。通过在16000g下离心20分钟使裂解液澄清，测定蛋白质浓度(Pierce，Rockford，IL，USA)。将对蛋白质含量归一化的全部细胞裂解液用于Raf-1的免疫沉淀，其使用针对人Raf-1 p74的12个羧基末端氨基酸的蛋白质A-琼脂糖偶联的兔多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，USA)。将免疫沉淀顺序用细胞裂解缓冲液，0.5M LiCl 100mM Tris-HCl，pH 7.4，和10mM Tris-HCl，pH 7.4洗涤。在Laemmli样品缓冲液中煮沸免疫复合体并通过7.5％SDS-PAGE分离，接着用多克隆抗-Raf-1抗体免疫印迹和按照制造商的方案(Amersham Corporation，Arlington Heights，IL，USA)使用ECL试剂检测Raf-1。使用计算机软件程序(Image-Quant；Molecular Dynamics，USA)定量Raf-1蛋白表达。
关于体内表达研究，使用Polytron匀浆器(Westbury，NY，USA)在细胞裂解缓冲液中均化肿瘤组织和器官。如上所述通过免疫沉淀和免疫印迹分析组织匀浆中的Raf-1表达。
Raf-1蛋白激酶活性测定在含有1％FBS的培养基中用10μM LE-ATG-AS raf ODN，LE-ATG-Sraf ODN或空白脂质体处理对数生长的SQ-20B细胞8小时。如上所述裂解细胞，将对蛋白质含量归一化的裂解液用琼脂糖偶联的抗-Raf-1抗体在4℃下免疫沉淀过夜。如前所述21在含有30mM Hepes(pH 7.4)，1mM氯化镁，1mM DTT，0.1mM ATP，和20μCi[λ-32P]ATP(6000Ci/mmol)的激酶缓冲液中使用它的生理底物，促分裂原活化蛋白激酶(MKK1)32来测定Raf-1的磷酸转移酶活性。通过10％SDS-PAGE分离放射性标记的反应产物并放射自显影。使用Image-Quant程序(Molecular Dynamics)将MKK1条带定量。
辐射存活剂量反应测定将适当量的SQ-20B细胞接种在一式两份的T-25组织培养瓶(Corning，NY，USA)中含有20％FBS的培养基中，并允许在37℃下附着8小时。用含有1％FBS的培养基替换该培养基，在辐射前将细胞暴露于10μMLE-ATG-AS raf ODN，10μM LE-ATG-S raf ODN或10μM空白脂质体6小时。使用137Csγ辐照器(JL Shepard MARK I辐照器)和114cGy/分钟的剂量率进行照射。用1Gy，3Gy，5Gy和13Gy的总剂量照射细胞，接着温育2小时。然后用含有20％FBS的培养基替换所有摇瓶中的培养基，继续温育7-10天。固定存活的集落，并用甲醇中的0.5％亚甲蓝和0.13％石炭酸品红染色。对含有50或更多细胞的集落记分，将数据拟合计算机生成的辐射存活反应的单击(single-hit)多目标和线性二次模型。44实验结果raf ODN的PC/CHOL/DDAB脂质体制剂是无毒的如材料和方法所述以1∶3.2∶1.5的摩尔比使用三种阳离子脂质(DDAB，DOTAP和DMTAP)之一，磷脂酰胆碱(PC)，和胆固醇(CHOL)的组合制备阳离子脂质体。首先，我们通过闪烁计数等分试样的制剂测定脂质体的ODN包埋效率，其中将痕量放射性标记的反义(ATG-AS)或有意义(ATG-S)raf ODN加入初始ODN，PC/CHOL/DDAB制剂产生最大ODN包埋效率(＞90％，n＝10)。发现PC/CHOL/DOTAP和PC/CHOL/DMTAP脂质体有高细胞毒性。因此，使用脂质体的PC/CHOL/DDAB制剂进行随后实验。
进行使用荧光素标记的ATG-AS raf ODN的荧光图像分析以显示脂质体中ODN的包封。获得大小不均匀的脂质体群体，包括较大(图7)和较小脂质体(＜2微米，数据未显示)。通常，脂质体显示形成小聚集体的趋势，其可以容易地通过轻微振荡分散。ODN似乎分布在脂双层和含水空间内。我们接着比较空白脂质体(BL)，脂质体包封的反义(LE-ATG-AS)和有意义(LE-ATG-S)raf ODN对细胞存活的影响。如通过克隆源性存活和锥虫蓝染料排斥方法测定，浓度相当于10.0μM或更少的LE-ATG-AS/Sraf ODN的空白脂质体无毒(数据未显示)。然而，在高于20μM的剂量下空白脂质体显示细胞毒性，因此将10μM或更小的剂量用于随后的体外研究。对于体内研究，用6mg/kg空白脂质体的日剂量静脉内(i.v.)治疗小鼠2周，然后监视接下来的30天。未注意到重量减轻或不舒适的迹象，表明该脂质体制剂在体内无毒。
脂质体包封增强raf ODN的体外摄取和体内及体外稳定性我们先前已经证明在低血清(1％)的存在下当暴露于100μM浓度时在6小时时＜2％的游离ATG-AS raf ODN被SQ-20B细胞摄取，最大摄取是在处理后12小时，约为4％。在本研究中，我们询问脂质体包封是否增强ODN在肿瘤细胞中的摄取和稳定性。在1％血清的存在下细胞摄取LE-ATG-AS raf ODN的动力学在图8中显示。ODN的胞内水平随时间提高，在温育后8小时达到稳定水平。约13％的全部施用的LE-ATG-AS rafODN(10μM)被结合到细胞中。这些结果证明当用与游离ATG-AS raf ODN相比浓度低10倍的LE-ATG-AS raf ODN处理肿瘤细胞时，实现胞内ODN水平的显著增加。
为了研究LE-ATG-ASraf ODN的胞内稳定性，在最初用放射性标记的LE-ATG-AS raf ODN(10μM)处理细胞4小时后的不同时间回收32P-标记的ODN。如材料和方法所述通过变性凝胶电泳测定ODN的完整性。鉴定完好的raf ODN(15-链节)，在高达24小时未观察到降解(图8B Igne)。与此对比，用等摩尔浓度的游离ATG-AS raf ODN处理的细胞在所有时间点上未显示可检测的ODN(数据未显示)。在其它研究中，在含有较高水平的血清(15％FBS)的培养基中，在LE-ATG-AS raf ODN温育24小时后15-链节的ODN是完好的(数据未显示)。这些结果提示脂质体包封保护raf ODN免于血清核酸酶诱导的降解。
LE-ATG-AS raf ODN的血浆药物动力学在图3中显示。在i.v.给药后，获得6.39μg/ml的峰血浆浓度并且在高达24小时后可以检测到完好的ODN。LE-ATG-AS raf ODN血浆浓度的降低遵循初始半衰期(t1/2β)为24.5分钟和末期半衰期t1/2β为11.36小时的双指数(biexponential)模型。LE-ATG-AS raf ODN的血浆浓度-时间曲线下面积为5.99μg.h/ml，体内总清除率为75.94ml/min/kg，分布容积为74.67l/kg。与此对比，完好的游离ATG-AS raf ODN仅在5分钟时可检测；血浆浓度为9.75μg/ml。这些观察与体外观察一致，提示游离ATG-AS raf ODN在血浆中被快速降解，而LE-ATG-AS raf ODN在循环中达24小时。
LE-ATG-AS raf ODN的组织分布在图4中显示。在高达48小时观察的所有器官中检测到完好的ODN(图4a)。在给药游离的ATG-AS raf ODN以后，仅在5分钟时在各种器官中看到完好的ODN，随后发现降解产物(＜15-链节)(数据未显示)。以前没用载体传递的完全硫代磷酸化的ODN(S-寡聚物)的药物动力学曲线的报道，提示肝和肾是ODN累积的优选位点。我们的数据与这些研究一致，然而仍可能脂质体传递促进ODN靶向某些组织，包括肝和肾。本发现提示仅3’和5’碱基键硫代磷酸化的rafODN被快速降解，脂质体包封是在各种器官中保持ODN稳定性至少48小时的有效方法。
脂质体包封的ATG-AS raf ODN抑制Raf-a表达和体外活性时程实验显示Raf-1蛋白表达的最大抑制(52.3±5.7％，约74kDa)在细胞与10μM LE-ATG-AS raf ODN温育8小时后发生(图5a)。LE-ATG-ASraf ODN(AS)的抑制作用发现高达24小时(45.6±9.8％)。Raf-1蛋白的水平比得上对照未处理的细胞(C)，空白脂质体处理的细胞(BL)，和LE-ATG-S raf ODN-处理的细胞(S)(图5a)，证明LE-ATG-AS raf ODN特异性地抑制SQ-20B细胞中Raf-1的蛋白质表达。剂量-反应研究显示在分别用5μM和10μM LE-ATG-AS raf ODN处理细胞8小时后发生Raf-1表达35.94±16.8％和52.3±5.7％的抑制(图5b)。
使用它的生理底物，促分裂原活化蛋白激酶(MKK1)我们研究LE-ATG-AS raf ODN对Raf-1蛋白激酶酶活性的影响。32Raf-1蛋白激酶活性比得上对照，未处理的细胞和LE-ATG-S raf ODN-处理的细胞(10μM，8小时)。在Raf-1蛋白表达抑制水平的同时，与对照细胞相比在LE-ATG-AS raf ODN-处理的细胞中Raf-1蛋白激酶的体外磷酸转移酶活性受抑制(10μM，8小时；62.6±9.0％)(图6)。
脂质体包封的ATG-AS raf ODN抑制Raf-1的体内表达在Balb/c nu/nu小鼠中，内源性Raf-1表达水平在不同正常组织中不同，发现表达水平递减次序为肺＞肝＞脾＞心＞肾(数据未显示)。有趣地，抗-Raf-1抗体仅在肾中识别两条蛋白质条带(约74kDa和约55kDa)。不清楚较小片段是否是小鼠肾中Raf-1的蛋白水解物(图7)。小鼠和人的c-raf-1 cDNA在翻译起始区域共有保守核苷酸序列(Leszek Woznowski，私人通讯)。因此，我们研究ATG-AS/S raf ODN对正常小鼠组织中Raf-1表达的影响。在i.v.给药游离ATG-AS raf ODN(每日6mg/kg，共5日)以后在正常组织中未观察到Raf-1表达的抑制(数据未显示)。然而，i.v.给药LE-ATG-AS raf ODN(每日6mg/kg，共5日)，而不是LE-ATG-S raf ODN导致肝脏(51.6±17.4％；n＝3)，和肾(42.2±11.0％；n＝3)中Raf-1(约74kDa)的显著抑制(图7)。LE-ATG-AS raf ODN-有关的Raf-1抑制在心和肺中不发生(n＝3，数据未显示)。这些观察与正常组织LE-ATG-AS rafODN的处置曲线(disposition profiles)一致，显示与心和肺相比在肝和肾中较高的ODN累积(图4b)。仍需观察在肝和肾中Raf-1的抑制是否与对这些器官的任何明显毒性有关。
意外地，用LE-ATG-AS raf ODN i.v.处理对不同SQ-208肿瘤异种移植物中的Raf-1表达产生不定影响，与LE-ATG-S raf ODN-处理的肿瘤异种移植物相比抑制水平为37.6-57.6％(n＝3)(图7)。我们将这解释为是由于不同异种移植物中肿瘤脉管系统的差异导致，阻碍ODN向灌注较差的肿瘤位点的传递。与未处理的对照相比，用游离ATG-AS/S raf ODN，LE-ATG-S raf ODN(S)，温和脂质体，或生理盐水(C)静脉内处理对肿瘤组织中的Raf-1表达没有影响。在i.v.处理后观察到的Raf-1抑制水平的变化促使我们研究瘤内给药LE-ATG-AS raf ODN或LE-ATG-S raf ODN对Raf-1表达的影响。图8所示结果显示与LE-ATG-S raf ODN相比，在用LE-ATF-AS raf ODN瘤内处理后SQ-20B肿瘤异种移植物中Raf-1蛋白表达的显著抑制(60.3±5.4％；11-3)。总之，这些数据证明LE-ATG-AS raf ODN以序列特异性方式抑制Raf-1体内表达。
用脂质体包封的ATG-AS raf ODN处理的SQ-20B细胞是放射敏感的。暴露于LE-ATG-AS raf ODN，LE-ATG-S raf ODN，或空白脂质体的SQ-20B细胞的辐射存活剂量反应在表1中表示。用LE-ATG-S/AS raf ODN或空白脂质体处理的细胞的平板接种(plating)效率是可比较的(表1)。单击(single-hit)，多目标(目标模型)和线性二次模型(LQ)被最常规用于分析细胞辐射存活。目标模型是基于参数D0和fl，其中D0是存活曲线末端斜率的倒数，fl是该斜率与纵坐标的外推。D0值越高，细胞越耐受辐射诱导的细胞杀死。另一参数，Dq是当末端斜线与横坐标相交时存活曲线的轴肩(shoulder)。LQ模型具有两个主要参数α，表征较低剂量下辐射反应的线性项；和β，表征较高剂量下反应的二次方项。α的值越高，细胞对辐射越敏感。模型自由参数，D被称为平均失活剂量并表示在线性坐标上绘制的存活曲线下面积。将克隆源性细胞的存活数据与辐射存活反应的单击多目标和线性二次模型计算机拟合。在用LE-ATG-AS raf ODN处理以后观察到放射生物学参数D，D0，和SQ-20B细胞的D0的值显著减小，提示Raf-1蛋白激酶的反义序列特异性抑制和放射敏化之间的良好关联。基于平均失活剂量的比率，LE-ATG-AS raf ODN处理(10μm)的剂量修饰因子(DMF)约为1.6。这些数据是显著的，因为需要高10倍浓度的游离ATG-AS raf ODN以获得可比较的放射敏化SQ-20B细胞的水平(ATG-AS raf ODN，100μm；DMF约1.4)。
表1用LE-ATG-S/AS raf ODN处理的SQ-20B细胞的辐射存活参数
如材料和方法所述在每个实验中每个剂量下将适当数量的细胞一式两份接种到T-25烧瓶中。空白脂质体处理的，LE-ATGs raf ODN处理的和LE-ATG-AS raf ODN-处理的细胞的平板接种效率分别为65-79％，52-83％和59-90％。
各种参数的合成值获自用LE-ATG raf ODN-处理的细胞进行的三次实验和用空白脂质体处理的细胞进行的两次实验。
分析上述结果说明按照本发明的阳离子脂质体制剂(PC/CHOL/DDAB)具有几个优势。具体地，发现PC/CHOL/DDAB脂质体制剂无毒，并产生高ODN包封效率。
我们已经鉴定几种体内参数，其显示这些阳离子脂质体是安全和有效运输反义寡聚物的适当载体。基于荧光显微镜检术，似乎寡聚物被包埋在脂双层的内部(图1)。观察扩展了最初显示质粒DNA包封在脂质层或管内部的报道。通过同时测量血浆和组织水平，我们还证明寡聚物的脂质体包封保护这些较小的DNA种类免于在血浆中降解并促进它们的组织累积(图3和4)。通过脂质体体内运送的循环反义raf寡聚物保持完好至少24小时，而游离寡聚物在5分钟后就不可检测。这些数据与先前报道一致，显示仅在3’和5’末端具有两个末端硫代磷酸酯键的磷酸二酯寡聚物类似未封闭的磷酸二酯寡聚物，这些寡聚物迅速从血液中清除并显示很少的组织累积。推测在我们的脂质体制剂中PC连同胆固醇的使用可能促进寡聚物在循环中的延长保留，以及寡聚物的组织处置和稳定性。
已经显示粒度在脂质体的生物分布和细胞进入途径中起重要作用。较大脂质体主要分布在网状内皮系统，其它组织中的量可忽略，而较小脂质体位于其它器官。另外，不均匀粒度分布的多层气泡清除遵循双相模型，大脂质体的迅速清除和小脂质体的缓慢清除速率。在含有寡核苷酸的阳离子脂质体的生物分布方面可获得的信息有限。Litzinger及同事先前报道与阳离子脂质体复合的寡核苷酸，直径约2.0微米，被肺瞬时摄取，接着快速分布到肝。近来研究证明胞吞作用是寡核苷酸通过阳离子脂质体传递的主要途径。我们的脂质体制剂由大的和小的脂质体组成。与上述观念一致，我们证明LE-ATG-AS raf ODN的清除遵循双相模型，优选分布到肝中。
脂质体包封的反义raf寡聚物是无毒的，并以序列特异性的方式抑制体外和体内Raf-1表达(图5-8和表1)。值得注意的是LE-ATG-AS raf ODN给药的静脉内和瘤内途径导致SQ-20B肿瘤组织中Raf-1表达的显著抑制，提示该化合物对全身和局部给药的潜在适用性。另外，与对照细胞相比，用脂质体包封的反义raf寡聚物处理的肿瘤细胞是放射敏感的(表1)。新近，与Brett Monia博士(ISIS Pharmaceuticals，Carlsbad，CA，USA)合作，已经开始实验证明脂质体包封的反义raf寡聚物(5132)在SQ-20B肿瘤异种移植模型中的放射敏化作用。迄今在无胸腺小鼠中获得的体内数据是有希望的(Gokhale等，未发表的数据)。本发明结果提示ATG-AS raf ODN的脂质体传递与辐射联合可以是治疗癌症，特别是耐受标准辐射治疗的那些有效的基因靶向方法。
实施例2材料与方法细胞培养在Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)(GIBCO BRL，Grand Island，NY)中单层培养SQ-20B肿瘤细胞，所述培养基中补充有20％热失活胎牛血清(FBS)，2mM谷氨酰胺，0.1mM非必需氨基酸，0.4μg/ml氢化可的松，100μg/ml链霉素和100U/ml青霉素。
寡脱氧核糖核苷酸如前所述(Monia等，1996a，b)设计和合成20-链节的对应于人c-raf-1mRNA 3’-未翻译区域(3’-UTR)的硫代磷酸酯反义ODN(ISIS 5132/51325’-TCC-CGC-CTG-TGA-CAT-GCA-TT-3’)和7个碱基的错配硫代磷酸酯反义ODN(ISIS 10353/10353；5’-TCC-CGC-GCA-CTT-GAT-GCA-TT--3’)。如前所述(Soldatenkov等，1997)，在Lofstrand Labs Limited(Gaithersburg，MD)合成20-链节的硫代磷酸酯有意义ODN(5’-ATT-GCA-TGT-CAC-AGG-CGG-GA-3’)。
阳离子脂质体的制备将ODN包封在阳离子脂质体中，所述阳离子脂质如前所述(Gokhale等，1997)以1∶3.2∶1.6的摩尔比使用二甲基双十八烷基溴化铵，磷脂酰胆碱，和胆固醇(Avanti Polar Lipids，Alabaster，AL)制备。简短地，使用旋转真空蒸发器在圆底烧瓶中将溶解在氯仿或甲醇中的脂质蒸干。通过加入磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的1.0mg/ml的5132/10353，在4℃下将干燥的脂质膜水合过夜。通过剧烈涡旋将膜分散，在槽型超声波仪(LaboratorySupplies，Hicksville，NY)中将脂质体混悬液超声处理5分钟。ODN/脂质比率为30μg ODN/mg脂质，产生大于90％的包封效率。脂质体包封的ODN(LE-5132/LE-10353)保存在4℃，并在1周内使用。在缺少ODN下完全如上所述制备空白脂质体(BL)。
Raf-1免疫沉淀和免疫印迹测定对于体外实验，在第1天，在含有1％FBS的培养基中将对数生长的SQ-20B细胞暴露于不同浓度的LE-5132，5132，LE-10353，或BL 6小时。然后用含有20％FBS的培养基洗涤细胞以去除脂质体，在LE-5132和5132处理组中在5132的存在下和在LE-10353组中在10353的存在下将在含有20％FBS的培养基中的温育持续过夜(18小时)。在第2天，用新鲜30％FBS漂洗细胞，接着如第1天的治疗计划的第二疗程另外24小时。该步骤产生LE-5132细胞的最小暴露(12小时)。然后在含有500mM HEPES，ph 7.21％NP-40，10％甘油，5mM原钒酸钠，1mM苯甲基磺酰氟，20μg/ml抑酶肽，和20μg/ml亮抑酶肽的缓冲液中裂解细胞。通过在16,000g下离心20分钟使裂解液澄清，测定蛋白质浓度(Pierce，Rockford，IL)。将对蛋白质含量归一化的全部细胞裂解液用于Raf-1的免疫沉淀，其使用针对人Raf-1 p74的12个羧基末端氨基酸的蛋白质A-琼脂糖偶联的兔多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)。将免疫沉淀顺序用细胞裂解缓冲液，0.5M LiCl，100mM Tris-HCl，pH 7.4，和10mM Tris-HCl，pH 7.4洗涤。在Laemmli样品缓冲液中煮沸免疫复合体并通过7.5％SDS-PAGE分离。这接着用多克隆抗-Raf-1抗体免疫印迹和按照制造商的方案(Amersham Corporation，Arlington Heights，IL)使用ECL试剂检测Raf-1。使用计算机软件程序Image-Quant(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)定量Raf-1蛋白水平。
关于体内表达研究，使用Polytron匀浆器(Westbury，NY)在细胞裂解缓冲液中均化肿瘤组织。如上所述通过免疫沉淀和免疫印迹分析组织匀浆中的Raf-1表达。
体外凝固分析使用含有已知浓度的LE-5132或5132的正常人血浆进行凝固分析。按照制造商的推荐(Sigma Diagnostics)，在向血浆样品加入APTT试剂(含有变应性酸激活剂的兔脑脑磷脂提取物)(Sigma Diagnostics，St.Louis，MO)接着加入氯化钙以引发凝块形成以后，测量活化部分促凝血酶原激酶时间(APTT)。手工记录形成可见凝块所需时间。
药理动力学研究按照认可程序在Georgetown大学的比较医学系保养雄性Balb/c nu/nu小鼠(National Cancer Institute，Frederick，MD)，给料purina食物(chow)，水无限制。通过尾静脉用配制在PBS中的30mg/kg LE-5132或5132静脉注射小鼠。在注射后5分钟，15分钟，30分钟和1小时，2小时，4小时，8小时，24小时和48小时，在麻醉下将动物从后眼眶窦放血至肝素化的管中，并通过颈脱臼杀死。立即在300g下将血液4℃离心10分钟以分离血浆。快速切除肝，肾，脾，心和肺并在冰冷的生理盐水中漂洗。将血浆和器官保存在-70℃直至进一步分析。
如我们较早所述(Gokhale等，1997)检测血浆和组织样品中反义rafODN的浓度。简短地，使用酚-氯仿提取法从血浆样品中，和使用DNA提取试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)从组织中分离ODN。通过在空白血浆或空白组织样品中加入已知量的5132，接着如前所述提取制备raf ODN浓度标样。将提取物加样在20％聚丙烯酰胺/8M脲凝胶上并在TBE缓冲液中电泳。在0.5x TBE缓冲液中在20V下将凝胶电印迹在尼龙膜上1小时，在Quickhyb缓冲液(Stratagene)中在30℃下用[32P]-标记的有意义rafODN探针探测印迹过夜。使用10-50倍过量的探针以确保所有条带的饱和。使用计算机程序(Image-Quant software)扫描放射自显影，通过与标样比较计算在样品中的反义raf ODN的量。
体内LE-5132治疗和辐射方法抗肿瘤功效研究设计在轻微麻醉下在雄性Balb/c nu/nu小鼠的左侧区域皮下注射对数生长的SQ-20B细胞(2×100个细胞)。在治疗开始前允许肿瘤生长至平均肿瘤体积为～72-94mm3。从3个主轴(a，b，c)的测径器测量测定并使用abc/2，椭圆体积(πabc/6)的近似来计算肿瘤体积。
对于每个实验，将携带肿瘤的小鼠随机分成不同治疗组，每组5-7只动物。小鼠ODN组以6-10mg/kg的剂量每日或隔日共12-18天或通过两种方法i.v.接受LE-5132。使用[137Cs]辐照器(J.J.Shepard Mark I)照射IR组的肿瘤。动物正常组织的约束和防护在安装在特殊形状的2.5cm厚铅屏蔽之后的铰接的半圆柱形腔(chamber)内完成。携带肿瘤的后肢穿过腔上的孔并通过缠绕腿安装在暴露于辐射的1.6mm有机玻璃平台上。使用TLD剂量测定法，使用实验辐射条件和定制的组织等效的小鼠模型预先测定对肿瘤中心和小鼠身体的平均剂量率。在几只小鼠上确定剂量分布。将辐射以2.37Gy/min的剂量率，每天3.8Gy共18天传递给肿瘤。全身剂量＜5％肿瘤剂量(0.19Gy/天)。在任何小鼠中在实验期间未注意到肠胃问题。联合治疗组的动物在第0天接受LE-5132，以3-4小时的间隔在第1-6天，和第8，10，和12天接受LE-5132和IR。另外，该组在第7，9，和11天和第13-18天仅接受IR。在两个对照组中，一组以与LE-3132(BL)相同的剂量给药方案接受BL，另一组留下未治疗(C)。在最后治疗后1周1次或2次监视肿瘤体积共12-27天。
作为初始肿瘤体积(第0天，剂量给药的第1天)的百分比计算肿瘤体积，绘制平均肿瘤体积±SE。进行方差分析(单向ANOVA)以确定在最终治疗后12天观察到的肿瘤体积变化的统计学显著性。
组织病理学在最后治疗后24小时从代表性的治疗组中切除肿瘤组织并固定在10％福尔马林中，在苏木精/cosin染色后用显微镜分析石蜡切片。在光学显微镜(American Optical Corporation，Buffalo，NY)下对组织学变化，如包含断裂染色质的编程性细胞死亡的细胞记分。在每个治疗组中对每个视野约100个细胞的10个视野记分。
实验结果LE-5132抑制Raf-1体外表达为了确定Raf-1表达的反义ODN序列特异性抑制，用5132，LE-5132，和7个碱基的错配LE-10353处理SQ-20B肿瘤细胞(图9A)。先前，5132体外抑制Raf-1已经显示需要lipofectin(Monia等，1996a)。一致地，发现5132在细胞培养中无效(图9A，泳道4和6)。与5132体外处理相比，用LE-5132观察到Raf-1蛋白水平的显著降低(图9B，0.5μM LE-5132LE-5132，71.3±22.5％；1.0μM LE-5132，79.6％±16.7％)。脂质体包封的错配反义ODN(LE-10353)显示比得上未处理或BL-处理的细胞的Raf-1表达(图9A，泳道7-9)。总之，这些数据确定SQ-20B细胞中LE-5132的反义序列特异性效力。
LE-5132不影响体外凝固作为朝向阳离子脂质体安全和有效传递ODN的临床应用的步骤，我们使用正常人血浆比较5132和LE-5132对凝固时间的影响。将5132加入正常人血浆产生凝固时间的浓度依赖型延长(图10)。在体外100μg/ml和200μg/ml 5132的存在下分别观察到APTT约95％和197.5％的增加，而用LE-5132仅发现APTT勉强的增加(100μg/ml，13％；200μg/l，14.5％)。相同浓度范围的BL对APTT无影响(数据未显示)。
脂质体-包封增强5132的药物动力学在单一静脉内大丸剂给药LE-5132或5132以后获得药物动力学参数。如图11A和B所示，在两种情形中至少高达8小时可以在血浆中检测完好的ODN。对于LE-5132和5132在ODN给药后5分钟时的峰血浆浓度分别为28.5μg/ml和13.5μg/ml。LE-5132和5132血浆浓度的降低遵循双指数模型，初始分布半衰期(t1/2β)分别为34分钟和21.6分钟。LE-5132和5132的末期半衰期(t1/2β)分别为14.5小时和4.3小时。如表2所示，与5132相比，LE-5132的血浆浓度-时间曲线下面积(AUC)高5.8倍，与LE-5132相比，5132的完好ODN清除速率更高。
在图12中LE-5132和5132的正常组织分布曲线表示为AUC的函数。在任一治疗后，在检查的器官中在高达48小时可以检测完好的ODN(数据未显示)。然而，LE-5132的组织分布不同于游离硫代磷酸化的ODN，5132。与5132给药相比，在LE-5132给药以后在肝(18.4倍)和脾(31倍)中可以测量到显著更高水平的完好ODN。与游离ODN相比通过脂质<p>表11在浦肯野纤维中雷诺嗪对0相位(phase 0)振幅、静息膜电位(RMP)、及动作电位过冲的影响在存在正常[K+]0的情况下雷诺嗪(单位μM) 0＝4.0mM；BCL＝500msec数据表示为平均值±标准误差，n＝7，*p＜0.05，与对照比较在试验的最高浓度(100μM)，雷诺嗪引起0相位振幅和过冲的统计上显著的下降，其和药物降低Vmax和INa的效应一致。
低细胞外钾离子浓度(3mM)降低细胞外钾离子并不显著改变雷诺嗪的效应。最明显的差异包括在中等浓度下药物倾向于延长APD90以及在BCL为2000msec时由最高浓度的药物诱导APD的较小缩短(图22、表12)。
表12在浦肯野(Purkinje)纤维中雷诺嗪对0相位振幅、静息膜电位(RMP)、及动作电位过冲的影响在存在低[K+]0的情况下雷诺嗪(单位μM)
bt1/2β，消除半衰期；Cmax峰血浆浓度；AUC，血浆浓度-时间曲线下面积；CL，体内总清除率；Vd面积，分布容积。
在LE-5132组中，发现Raf-1表达在第7天和第14天与BL组(100％)相比分别为35.5％±13.4％和27.7％±13.3％。在LE-5132和IR联合治疗的小鼠的SQ-20B肿瘤中还注意到Raf-1表达的抑制。与未治疗或BL对照相比，仅IR治疗不改变Raf-1表达(图14)。
LE＝5132是肿瘤辐射敏化剂因为SQ-20B细胞是在放射治疗失败后从肿瘤建立的并且LE-5132治疗在治疗期间导致肿瘤生长抑制，我们询问该相对抗放射性的肿瘤的生长控制是否可以通过联合LE-5132和IR治疗实现。在12天内(第0天-第12天)使用LE-5132(10mg/kg)10次。与小鼠对照组(未治疗和BL)相比，该治疗导致肿瘤生长抑制达最后剂量给药后1周(第19天)。这接着肿瘤体积的稳定增加(图15A)。每天给予IR(3.8Gy/天)共18天。在该组中，在第26天观察到平均肿瘤体积的适度降低(初始体积的14.9％±7.1％)(图7A)。其后肿瘤生长并在接下来的3-7天达到初始体积。LE-5132和IR治疗的联合导致在第26天平均肿瘤体积的显著减小(初始体积的57.9％±8.0％)。在第30天，与初始体积(100％，第0天)相比，平均肿瘤体积为LE-5132，122.5％±13.8％；IR，113.8％±17.6％；LE-5132+IR，43.5％±2.9％；LB/未治疗对照，370.8％±15.6％(图15)。与BL和未治疗组相比，LE-5132和IR都显示显著的肿瘤生长抑制(p＜0.001)。统计学分析表明与LE-5132组相比IR中的肿瘤体积差异是不显著的。最重要的，与LE-5132，IR，BL，和未治疗组相比，LE-5132+IR组显示显著更大的抗肿瘤活性(p＜0.001)(图15B)。
LE-5132和IR治疗的联合导致体内编程性细胞死亡的显著增加在最后治疗后24小时切除各种治疗组中的代表性肿瘤用于组织病理学检查。与未治疗组相比在LE-5132或IR组中发现坏死细胞和编程性细胞死亡的细胞。另外，在IR组中观察到包含完好核的一些存活细胞的克隆再生长(数据未显示)。与单一试剂或未治疗的对照组相比，含有高度断裂的核的编程性细胞死亡的细胞比例在LE-5132+IR组中高很多(图16)。在不同组中记分的编程性细胞死亡的细胞/活细胞相对量的比率为C，0.06 LE-5132，0.64；IR，0.72；LE-5132+IR，2.46。
讨论反义ODN疗法是通过序列特异性抑制增殖或存活信号来增强抗癌剂功效的新方法。据我们所知，该报导第一次提供完全鉴定的反义ODN作为辐射敏化剂或化学敏化剂在动物肿瘤模型中的效力的证据。SQ-20B肿瘤细胞是从全程放射治疗失败的患者的喉扁平细胞癌建立的。单独的放射或反义raf ODN治疗导致SQ-20B肿瘤生长的暂时抑制，但肿瘤不消退，而反义raf ODN和放射治疗的联合导致治疗后持续的肿瘤消退至少27天(图13和15)。这些数据支持Raf-1在细胞增殖和存活中的作用，并确定反义rad ODN为新的体内辐射敏化剂。
我们发现在SQ-20B细胞和肿瘤的LE-5132治疗后Raf-1蛋白表达的显著抑制，提示LE-5132是体外和体内的生物活性化合物(图9和14)。因为5132序列对应于在小鼠中不保守的人c-raf-1的3’UTR，不能研究Raf-1在正常小鼠组织中的抑制。先前研究已经显示在其它潜在的毒性作用中，PS-ODN治疗导致与剂量依赖型的凝固时间延长有关的碰伤。通过改变剂量给药方案可以避免包括5132的PS-ODN的补体和凝固作用。我们的结果显示5132的脂质体包封(LE-5132)防止凝固时间的变化(图10)。此外，ODN的脂质体传递可以减轻许多其它PS-ODN的与序列无关的副作用，包括血液学变化和补体激活。与游离5132相比，观察到5132脂质体制剂的血浆浓度和大多数组织水平的显著提高(图11和12和表2)。与此一致，发现LE-5132的抗肿瘤效力显著高于5132。总之，这些数据提示脂质体包封是ODN体内运送的有效方法。
不清楚Raf-1表达的抑制增强IR-诱导的细胞毒性的机理。在生长因子衍生的造血细胞和v-abl-转化的NIH/3T3细胞中已经证明Raf-1作为抗编程性细胞死亡或存活因子的作用(Troppmair等，1992；Wang等，1996，Weissinger等，1997)。几个报导显示细胞死亡和细胞存活信号之间的平衡决定暴露于基因毒性或非基因毒性胁迫的细胞的命运。已经显示IR激活不同类型的信号分子，包括Raf-1蛋白激酶，促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)，和转录因子AP-1和NK-κB(在Kasid和Suy，1998中综述)。一种可能是Raf-1可能在辐射细胞中具有保护作用。我们已经在用IR或LE-5132和IR联合治疗的SQ-20B细胞中观察到增加水平的Bax蛋白，Bcl-2家族的促编程性细胞死亡(proapoptotic)成员(数据未显示)。辐射可诱导的Bax表达已经与编程性细胞死亡相关(Zhan等，1994)。另外，组织病理学检查显示，与LE-5132，IR，或未治疗的对照组相比，在LE-5132+IR治疗组中有相当比例的肿瘤细胞，其包含断裂的染色质，显示编程性细胞死亡(图16)。那些数据提示Raf-1可以用来促进辐射细胞中的抗编程性细胞死亡的信号途径。用反义raf ODN抑制Raf-1将因此导致IR-响应的促编程性细胞死亡信号的显著影响，包括肿瘤抗放射性的逆转。
实施例3材料和方法DMTAP∶PC∶CHOL脂质体的制备使用基本上与前述相同的方法制备1，2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基铵丙烷(DMTAP)∶磷脂酰胆碱(PC)∶胆固醇(CHOL)摩尔比率为1∶3.2∶1.6并且其中包封抗肿瘤的raf寡核苷酸(ATG-AS)的脂质体。
体外结果A)包封在由DMTAP∶PC∶CHOL组成的脂质体中的反义raf寡脱氧核糖核苷酸的增强的细胞摄取剂量-反应摄取实验将SQ-20B肿瘤细胞与放射性标记的(32P-γATP)和指定剂量的未标记的脂质体包封形式(LE-ATG-AS)或游离形式(ATG-AS)的反义raf寡核苷酸(ATG-AS)的混合物温育(图17)。处理在含有1％血清的培养基中在37℃下持续4小时。在温育后，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞，通过胰蛋白酶化脱离，并通过离心收集。用PBS洗涤细胞沉淀2次，然后在1％十二烷基硫酸钠中将细胞裂解。通过液体闪烁计数测定表示被细胞摄取的ATG-AS的量的胞内放射性。在图17中显示的数据表明与ATG-AS相比，在所有剂量下LE-ATG-AS胞内摄取的显著增加(1，2，4，8和10μM)。
时程摄取实验将SQ-20B肿瘤细胞与放射性标记的(32P-γATP)和4μM未标记的反义脂质体包封形式(LE-ATG-AS)或游离形式(ATG-AS)的反义raf寡核苷酸(ATG-AS)的混合物温育。处理在含有1％血清的培养基中在37℃下持续指定时间(图18)。在温育后，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞，通过胰蛋白酶化脱离，并通过离心收集。用PBS洗涤细胞沉淀2次，然后在1％十二烷基硫酸钠中将细胞裂解。通过液体闪烁计数测定表示被细胞摄取的ATG-AS的量的胞内放射性。在图18中显示的数据表明与ATG-AS相比，在所有检测时刻LE-ATG-AS胞内累积显著增加(15分钟，30分钟，1小时，2小时， 4小时，6小时，16小时，和24小时)。
B.包封在由DMTAP∶PC∶CHOL组成的脂质体中的反义raf寡脱氧核糖核苷酸的胞内稳定性稳定性实验将SQ-20B肿瘤细胞与放射性标记的(32P-γATP)和10μM未标记的脂质体包封形式(LE-ATG-AS)(图19，泳道1)或游离形式(ATG-AS)(图19，泳道2)的反义raf寡核苷酸(ATG-AS)的混合物温育。处理在含有1％血清的培养基中在37℃下持续4小时。在温育后立即用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞，通过胰蛋白酶化脱离，并通过离心收集。用PBS洗涤细胞沉淀2次，然后在10mM Tris-HCl，200mM NaCl，1％SDS，200μg/ml蛋白酶K，pH 7.4中将细胞在37℃下裂解2小时。用酚∶氯仿提取寡聚物，收集含水级分。将样品归一化为相等的放射性，通过变性凝胶电泳(15％聚丙烯酰胺/7M脲)接着放射自显影分析。图19所示数据表明用LE-ATG-AS处理的细胞中完好的ATG-AS寡核苷酸(泳道1)，和在用ATG-AS处理的细胞中降解形式的该寡聚物(泳道2)。放射性标记的对照ATG-AS标样在泳道3中显示。这些数据提示包封在DMTAP∶PC∶CHOL脂质体制剂中抑制寡聚物的降解。
稳定性实验将SQ-20B肿瘤细胞与放射性标记的(32P-γATP)和10μM未标记的脂质体包封形式(LE-ATG-AS)的反义raf寡核苷酸(ATG-AS)的混合物温育。处理在含有1％血清的培养基中在37℃下持续4小时。在温育后，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞，温育在含有20％血清的培养基中持续另外1小时。通过胰蛋白酶化脱离，并通过离心收集。用PBS洗涤细胞沉淀2次，然后在10mM Tris-HCl，200mM NaCl，1％SDS，200μg/ml蛋白酶K，pH 7.4中将细胞在37℃下裂解2小时。用酚∶氯仿提取寡聚物，收集含水级分。将样品归一化为相等的放射性，通过变性凝胶电泳(15％聚丙烯酰胺/7M脲)接着放射自显影分析。图20所示数据表明用LE-ATG-AS处理的细胞中完好的ATG-AS寡核苷酸(泳道1)。放射性标记的对照ATG-AS标样在泳道2中显示。这些数据进一步提示在DMTAP∶PC∶CHOL脂质体制剂中寡核苷酸包封保护寡聚物和增强完好寡聚物的胞内可用性。
体内结果体内数据由DMTAP∶PC∶CHOL组成的脂质体在CD2F1小鼠中的安全性研究为了测定由DMTAP∶PC∶CHOL组成的阳离子脂质体的安全性，在第0，1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，和16天将这些脂质体静脉内注射到雄性CD2F1小鼠中(n＝5，总脂质相当于5mg/kg，15mg/kg，25mg/kg，和25mg/kg寡聚物的浓度)。在第18天将5只动物中的2只杀死用于病理学，在第31天杀死剩余动物。在整个研究中监视组的体重。如图21所示，所用动物在治疗中存活并在本研究计划终止前显示增重。
包封在由DMTAP∶PC∶CHOL组成的脂质体中的反义raf寡脱氧核糖核苷酸的安全性为了测定由DMTAP∶PC∶CHOL组成和包封反义raf寡聚物(LE-ATG-AS)的阳离子脂质体的安全性，在第0，1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，和16天将含有反义raf寡聚物的脂质体静脉内注射到雄性CD2F1小鼠中(n＝5，5mg/kg，15mg/kg，25mg/kg，和35mg/kg寡聚物浓度)。在第18天将5只动物中的2只杀死用于病理学检查，在第31天杀死剩余动物。在整个研究中监视组的体重。如图22所示，所用动物在治疗中存活并显示增重。这些数据表明由DMTAP∶PC∶CHOL组成和其中已经包封反义raf寡脱氧核糖核苷酸的LE-ATG-AS组合物是安全的。
实施例4
Raf反义寡聚物和化学疗法在人前列腺癌模型中的应用本实施例涉及Leraf Aon结合顺铂在携带人前列腺癌(PC-3)异种移植物的无胸腺nu/nu小鼠中的抗肿瘤功效。以0.2ml磷酸盐缓冲盐水中5×106个PC-3细胞/只动物皮下接种雄性无胸腺小鼠。1周2次监视肿瘤生长直至肿瘤体积为60mm3-100mm3。如上所述将动物随机化成5个治疗组(n＝8)。通过尾静脉用指定剂量静脉内处理小鼠，1周2次监视肿瘤大小。所示值为平均值±s.d。如图23所示，寡聚物/阳离子脂质体制剂基本上加强顺铂的功效，如相对于对照减小的肿瘤体积所示。
实施例5Raf反义寡聚物和化学疗法在一些人前列腺癌动物模型中的应用在携带人前列腺癌(PC-3)异种移植物的无胸腺nu/nu小鼠中评估LEraf AON组合表柔比星的抗肿瘤功效。以0.2ml磷酸盐缓冲盐水中5×106个PC-3细胞/只动物皮下接种雄性无胸腺小鼠。1周2次监视肿瘤生长直至肿瘤体积为60mm3-100mm3。如上所述将动物随机化成5个治疗组(n＝6)。通过尾静脉用指定剂量静脉内处理小鼠，1周2次监视肿瘤大小。所示值为平均值±s.d。如图24所示，寡聚物/阳离子系统再次加强化学疗法的功效，特别是表柔比星化学疗法。
实施例6Raf反义寡聚物和抗化学治疗剂在人前列腺癌动物模型中的应用在携带人前列腺癌(PC-3)异种移植物的无胸腺nu/nu小鼠中研究LErafAon组合米托蒽醌的抗肿瘤功效。以0.2ml磷酸盐缓冲盐水中5×106个PC-3细胞/只动物皮下接种雄性无胸腺小鼠。1周2次监视肿瘤生长直至肿瘤体积为60mm3-100mm3。如上所述将动物随机化成5个治疗组(n＝6)。通过尾静脉用指定剂量静脉内处理小鼠，1周2次监视肿瘤大小。所示值为平均值±s.d。如图25所示，在该情形中化学治疗剂米托蒽醌的功效再次被寡聚物/阳离子制剂所加强。
实施例7
在携带人胰腺癌异种移植物(Colo357)的无胸腺小鼠中评估脂质体包埋的raf反义寡脱氧核糖核苷酸(LErafAON)和Gemzar(NDC 0002-7501-01，吉西他滨HCl，Eli Lilly和Company，Indianapolis，IN)的组合的抗肿瘤功效。用约1.0×106个Colo357人胰腺癌细胞接种无胸腺小鼠。允许肿瘤体积大小达到50mm3-100mm3。将携带肿瘤的小鼠随机分组为5种治疗类别(n＝5)。如前所述制备LErafAON制剂(Gokhale等，Gene Therapy 4，1289-1299，1997；和Gokhale等，准备手稿)＞抗癌药Gemzar(200mg小瓶)购自Georgetown大学医院的肿瘤药房并在生理盐水中重建(12.5mg/ml)。在指定日静脉注射LErafAON(25.0mg/kg)或Gemzar(75.0mg/kg)。1周2次测量肿瘤体积，绘制不同治疗组中的肿瘤大小(％初始)。如该图显示，与单一试剂治疗组(LErafAON和Gemzar)或对照组(N.S.生理盐水，BL，空白脂质体)相比，在联合治疗组(LErafAON加Gemzar)中注意到显著的肿瘤生长抑制。所示值为平均值±s.d。结果再次显示阳离子/寡聚物系统加强化学治疗剂的抗肿瘤功效。
实施例8反义Raf寡聚物和化学疗法在人胰腺癌动物模型中的应用在携带人胰腺癌异种移植物(Aspc-1)的无胸腺小鼠中评估脂质体包埋的raf反义寡脱氧核糖核苷酸(LErafAON)和Gemzar(NDC 0002-7501-01，吉西他滨HCl，Eli Lilly和Company，Indianapolis，IN)的组合的抗肿瘤功效。用约2.5×106个Aspc-1人胰腺癌细胞接种无胸腺小鼠。允许肿瘤体积大小达到50mm3-100mm3。将携带肿瘤的小鼠随机分组为5种治疗类别(n＝5)。如前所述制备LErafAON制剂(Gokhale等，Gene Therapy 4，1289-1299，1997；和Gokhale等，准备手稿)。抗癌药Gemzar(200mg小瓶)购自Georgetown大学医院的肿瘤药房并在生理盐水中重建(12.5mg/ml)。在指定日静脉注射LErafAON(25.0mg/kg)或Gemzar(100.0mg/kg)。1周2次测量肿瘤体积，绘制不同治疗组中的肿瘤大小(％初始)。如该图显示，与单一试剂治疗组(LErafAON和Gemzar)或对照组(N.S.生理盐水，BL，空白脂质体)相比，在联合治疗组(LErafAON加Gemzar)中注意到显著的肿瘤生长抑制。所示值为平均值±s.d。如图26B所示，作为寡聚物/阳离子脂质体治疗的结果，再次增强施用的化学治疗剂(gemzar和吉西他滨HCl)的抗肿瘤活性。
结论实施例4-8的结果清楚地确定化学疗法的作用，特别是耐受化学疗法的肿瘤的治疗可以通过给药包含在按照本发明的阳离子脂质体制剂中的寡聚物加强，所述寡聚物靶向肿瘤表达的基因，例如诸如raf的癌基因。因为该功效已经显示适用于多种不同的单独或组合的化学治疗剂，以及不同癌症，合理的期望这增强将在多种不同癌症，特别是耐受化学疗法或放射疗法的那些，以及和多种不同的单独或组合的化学治疗剂中观察到。
权利要求
1.一种化学敏化肿瘤组织的方法，其包含给药化疗剂和包含阳离子脂质体的组合物，所述阳离子脂质体由阳离子脂质，磷脂酰胆碱和胆固醇组成并且其中已经包封至少一种寡核苷酸。
2.权利要求1的方法，其中所述寡核苷酸大小为10-40个核苷酸并且仅在末端核苷酸处硫代磷酸化。
3.权利要求1的方法，其中所述寡核苷酸包含10-40个核苷酸并且它的所有碱基被硫代磷酸化。
4.权利要求1的方法，其中所述寡核苷酸大小为10-40个核苷酸，其中它的所有碱基以嵌合形式被修饰。
5.权利要求1的方法，其中所述寡核苷酸被静脉内施用。
6.权利要求1的方法，其中所述寡核苷酸被直接施用到靶组织。
7.权利要求1的方法，其中所述寡核苷酸被施用到供应靶组织的动脉供应中。
8.权利要求1的组合物，其中所述寡核苷酸是反义DNA。
9.权利要求1的方法，其中所述寡核苷酸为式5’-GTGCTCCATTGATGC-3’(SEQ ID No1)并且仅末端碱基被硫代磷酸化。
10.一种包含脂质体的物质的组合物，所述脂质体基本上由阳离子脂质组成并且含有其中仅末端序列被硫代磷酸化的序列5’-GTGCTCCATTGATGC-3’(SEQ ID No1)，所述阳离子脂质如二甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)，磷脂酰胆碱(PC)，和胆固醇(CHOL)。
11.一种包含脂质体的物质的组合物，所述脂质体基本上由阳离子脂质组成并且含有其中仅末端序列被硫代磷酸化的序列5’-GTGCTCCATTGATGC-3’(SEQ ID No1)，所述阳离子脂质如二肉豆蔻酰基三甲基铵丙烷(DMTAP)，磷脂酰胆碱(PC)，和胆固醇(CHOL)。
12.权利要求1的方法，其中所述化疗剂是烷基化剂，抗代谢物，天然产物，激素或拮抗剂。
13.权利要求1的方法，其中所述化疗剂是铂配位化合物，蒽二酮，取代脲，甲肼衍生物，肾上腺皮质抑制剂，小分子抑制剂，肽，抗体，或酪氨酸激酶抑制剂。
14.权利要求1的方法，其中所述化疗剂是表柔比星，多柔比星，多西他赛，或紫杉醇。
15.权利要求1的方法，其中所述化疗剂是顺铂或米托蒽醌。
16.权利要求1的方法，其中所述化疗剂是吉西他滨。
17.权利要求1的方法，其中所述癌症是白血病，淋巴瘤，骨髓瘤，癌或肉瘤。
18.权利要求1的方法，其中所述寡核苷酸在所述化疗剂之前或之后施用。
19.权利要求1的方法，其中将几种不同寡核苷酸在所述化疗剂之前或之后施用。
20.权利要求1的方法，其中所述寡核苷酸在多于一种的化疗剂之前或之后施用。
21.权利要求1的方法，其中所述寡核苷酸在放射和化疗剂的组合之前或之后施用。
22.权利要求1的方法，其中多于一种寡核苷酸在放射和化疗剂的组合之前或之后施用。
全文摘要
本发明涉及包含寡核苷酸的阳离子脂质体制剂在增强化学疗法和/或放射疗法的功效中的应用，特别是作为使癌肿瘤组织对化学疗法功效化学敏化的手段。这在表达ras的肿瘤如乳腺癌，肺癌，胰腺癌和前列腺癌的治疗中特别有利。
文档编号C07H21/00GK1646097SQ03808509
公开日2005年7月27日 申请日期2003年2月14日 优先权日2002年2月15日
发明者乌莎·卡锡德, 普拉富拉·戈卡莱, 裴瑾, 拉伊什里·梅瓦尼, 伊姆兰·艾哈迈德, 阿纳托利·德里奇尔罗, 阿奎卢尔·拉赫曼 申请人:乔治敦大学, 新药物公司