专利名称：免疫抑制剂化合物和组合物的制作方法
与相关申请的相互参照本发明要求于2004年2月24日提交的美国临时申请60/547,712的优先权。该申请的全部公开内容在这里通过全文引用作为参考。
背景技术：
发明领域本发明提供一类新型免疫抑制剂化合物，所述的这类化合物用于治疗或预防由淋巴细胞相互作用介导的疾病或病症，特别是与EDG受体介导的信号转导相关的疾病。
背景EDG受体属于一密切相关的、脂活化的G蛋白偶联受体家族。据鉴定EDG-1、EDG-3、EDG-5、EDG-6和EDG-8(也分别称为S1P1、S1P3、S1P2、S1P4、和S1P5)为1-磷酸-鞘氨醇(S1P)特异性受体。EDG2、EDG4和EDG7(也分别称为LPA1、LPA2和LPA3)是溶血磷脂酸(LPA)特异性受体。在SIP受体同种型中，EDG-1、EDG-3和EDG-5在多种组织中广泛表达，而EDG-6的表达主要限于淋巴样组织和血小板，以及EDG-8的表达限于中枢神经系统。EDG受体负责信号转导并据认为在涉及细胞发育、增殖、维持、迁移、分化、可塑性和凋亡的细胞过程中起重要作用。某些EDG受体与由淋巴细胞相互作用介导的疾病相关，例如在移植排斥、自身免疫病、炎性疾病、传染性疾病和癌症中起作用。EDG受体活性的改变促成这些疾病的病理学和/或症状学。因此，它们本身改变EDG受体活性的分子可在这些疾病的治疗中用作治疗剂。
发明概述本发明涉及式I化合物及其N-氧化衍生物、前体药物衍生物、经保护的衍生物、单独的异构体和异构体混合物；以及这类化合物的可药用盐和溶剂合物(如水合物) 其中n是0、1或2；R1选自C6-10芳基和C5-10杂芳基；其中R1的任意芳基或杂芳基由选自C6-10芳基C0-4烷基、C5-6杂芳基C0-4烷基、C3-8环烷基C0-4烷基、C3-8杂环烷基C0-4烷基或C1-10烷基的基团任选取代；其中R1的任意芳基、杂芳基、环烷基或杂环烷基可由1-5个选自卤素、C1-10烷基、C1-10烷氧基、卤素取代的C1-10烷基和卤素取代的C1-10烷氧基的基团任选取代；以及R1的任意烷基可任选地将亚甲基用选自-S-、-S(O)2-、-NR4-和-O-的原子或基团替代；其中R4选自氢或C1-6烷基；R2和R3独立地选自氢、C1-6烷基、卤素、羟基、C1-6烷氧基、卤素取代的C1-6烷基和卤素取代的C1-6烷氧基；A选自-X1C(O)OR4、-X1OP(O)(OR4)2、-X1P(O)(OR4)2、-X1P(O)OR4、-X1S(O)2OR4、-X1P(O)(R4)OR4和1H-四唑-5-基；其中X1是键或C1-6亚烷基以及R4选自氢和C1-6烷基；W选自键、C1-6亚烷基和C2-6亚链烯基；X选自C2-4亚烷基和C2-4亚链烯基；其中X的一个亚甲基可以用选自-O-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-和-NR5-的原子或基团替代；其中R5是氢、C1-6烷基和-C(O)R6；其中R6选自氢和C1-6烷基；其中X的任意亚烷基或亚链烯基可进一步由1-3个选自卤素、羟基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤素取代的C1-10烷基和卤素取代的C1-10烷氧基的基团取代；Y选自C6-10芳基和C5-10杂芳基，其中Y的任意芳基或杂芳基任选由1-3个选自卤素、羟基、硝基、C1-10烷基、C1-10烷氧基、卤素取代的C1-10烷基和卤素取代的C1-10烷氧基取代；Z是C1-6亚烷基；其中Z的不超过两个的亚甲基可以由选自-NR7-、C3-8环亚烷基、C3-8杂环亚烷基和亚苯基的二价基团替代；其中R7选自氢、C1-6烷基和(CH2)1-2COOH；其中Z可以进一步由1-3个选自卤素、羟基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤素取代的C1-6烷基和卤素取代的C1-6烷氧基的基团取代；或当-NR7-替代Z的至少一个亚甲基时，R7和Y与R7连接其上的氮原子一起形成C8-14亚杂芳基。
本发明的第二个方面是药物组合物，其含有与一种或多种合适的赋形剂混合的式I化合物或其N-氧化衍生物、单独的异构体或异构体混合物或其可药用盐。
本发明的第三方面是用于在动物中治疗疾病的方法，在所述的动物中EDG受体介导的信号转导的改变可以预防、抑制或改善该疾病的病理学和/或症状学，该方法包括给动物施用治疗有效量的式I化合物或其N-氧化衍生物、单独的异构体或异构体混合物；或其可药用盐。
本发明的第四方面是式I化合物的用途，其用于生产用来治疗动物中的疾病的药物，其中所述的动物中EDG受体介导的信号转导的改变促成该疾病的病理学和/或症状学。
本发明的第五方面是用于制备式I化合物及其N-氧化衍生物、前体药物衍生物、经保护的衍生物、单独异构体和异构体混合物及其可药用盐的方法。
优选实施方案的描述本发明提供了可用于治疗和/或预防由淋巴细胞相互作用介导的疾病或病症的化合物。也提供了用于治疗这种疾病或病症的方法。
定义在本说明书中，除非另外定义“烷基”作为一个基团和作为其它基团例如卤素取代的烷基、烷氧基、酰基、烷硫基、烷基磺酰基和烷基亚磺酰基的结构元素，可以是直链或支链。“链烯基”作为一个基团和作为其它基团的结构元素，含有一个或多个碳-碳双键，并可以是直链或支链。任何双键可以是顺式-或反式-构型。优选的链烯基是乙烯基。“炔基”作为一个基团和作为其它基团和化合物的结构元素，含有至少一个C≡C三键并且可以还含有一个或多个C＝C双键，并，只要可能，可以是直链或支链。优选的炔基是炔丙基。任何单独的或作为其它基团的结构元素的环烷基可含有3-8个碳原子，优选3-6个碳原子。“亚烷基”和“亚链烯基”是分别源于“烷基”和“链烯基”的二价基团。在本申请中，R1的任何烷基基团可以任选地由选自-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-NR3-和-O-(其中R3是氢或C1-6烷基)的成员打断。这些基团包括-CH2-O-CH2-、-CH2-S(O)2-CH2-、-(CH2)2-NR3-CH2-、-CH2-O-(CH2)2-，等等。
“芳基”表示单环的或稠合双环的芳香环组件含有6-10个碳原子。例如，C6-12芳基可以是苯基、联苯基或萘基，优选苯基。“亚芳基”表示源于芳基的二价基团。例如，用于本申请的亚芳基可以是亚苯基、亚联苯基、亚萘基，等等。
“卤”或“卤素”表示F、Cl、Br或I，优选F或Cl。卤素取代的烷基和化合物可以经部分卤化或全卤化，由此，在多卤化的情况下，卤素取代基可以是相同的或不同的。优选的全卤代烷基是例如三氟甲基。
“杂芳基”表示如在本申请中定义的芳基，条件是一个或多个所述环碳原子由选自N、O或S的杂原子替代，并且每个环含有5-6个环原子，除非另外说明。例如，如用于本申请中的杂芳基包括噻吩基、吡啶基、呋喃基、异唑基、苯并唑基或苯并[1，3]间二氧杂环戊烯基，优选噻吩基、呋喃基或吡啶基。“亚杂芳基”表示如本申请中定义的杂芳基，条件是环组件包含二价基团。
如本发明中使用的，EDG-1选择性化合物(试剂或调节剂)具有这样一种特异性，即相对于EDG-3和相对于EDG-5、EDG-6和EDG-8的一种或多种，对EDG-1有选择性。如此处使用的，相对于其它EDG受体(“非选择性受体”)而对一种EDG受体(“选择性受体”)的选择性表示化合物在诱导由选择性EDG受体(例如，EDG-1)介导的活性中比诱导由非选择S1P-特异性EDG受体介导的活性具有更高的效力。如果在GTP-γS结合测定中测量(如在下面的实施例中描述)，EDG-1选择性化合物通常具有的对选择性受体(EDG-1)的EC50(引起50％的最大反应的有效浓度)比其对非选择性受体(例如，EDG-3、EDG-5、EDG-6和EDG-8中的一种或多种)的EC50至少低5、10、25、50、100、500或1000倍。
发明详述本发明提供了可用于治疗或预防由淋巴细胞相互作用介导的疾病或病症的化合物。在一个实施方案中，对于式I化合物，n是0或1以及Z选自 其中Z的左边和右边星号分别表示其与式I的-[C(R2)(R3)]n-基团和与A之间的连接点。R7选自氢和C1-6烷基；以及J1、J2和J3独立地是亚甲基或选自S、O的杂原子和NR4；其中R4是氢或C1-6烷基；条件是杂原子的数目是2或更少。
在另一实施方案中，R1选自任选由C6-10芳基C0-4烷基、C5-6杂芳基C0-4烷基、C3-8环烷基C0-4烷基、C3-8杂环烷基C0-4烷基或C1-10烷基取代的苯基、萘基和噻吩基。其中，R1的任意芳基、杂芳基、环烷基或杂环烷基可任选由1-5个选自卤素、C1-10烷基、C1-10烷氧基、卤素取代的C1-10烷基和卤素取代的C1-10烷氧基的基团取代；以及R1的任意烷基可任选地将亚甲基由选自-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-NR4-和-O-的原子或基团替代；其中R4是氢或C1-6烷基。
在另一实施方案中，Y选自苯基、吡啶、嘧啶、噻吩、呋喃、噻唑和唑；它们每个可由1-3个选自卤素、羟基、硝基、C1-10烷基、C1-10烷氧基、卤素取代的C1-10烷基和卤素取代的C1-10烷氧基的基团任选取代。
在更进一步的实施方案中，R2和R3同时为氢以及A选自-C(O)OR4和1H-四唑-5-基；其中R4选自氢和C1-6烷基。
在另一实施方案中，R1选自 其中星号是R1与W的连接点；R9是C6-10芳基C0-4烷基、C5-6杂芳基C0-4烷基、C3-8环烷基C0-4烷基、C3-8杂环烷基C0-4烷基或C1-10烷基；其中R9的任意芳基、杂芳基、环烷基或杂环烷基可由1-3个选自卤素、C1-10烷基、C1-10烷氧基、卤素取代的C1-10烷基和卤素取代的C1-10烷氧基的基团任选取代。以及R9的任意烷基可任选地将亚甲基由选自-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-NR4-和-O-的原子或基团替代，其中R4是氢或C1-6烷基；以及R10选自卤素、C1-10烷基、C1-10烷氧基、卤素取代的C1-10烷基和卤素取代的C1-10烷氧基。
本发明的优选化合物选自3-{[5-(4-环己基-3-三氟甲基-苄氧基亚氨基)-5，6，7，8-四氢-萘-2-基甲基]-氨基}-丙酸；1-[5-(4-环己基-3-三氟甲基-苄氧基亚氨基)-5，6，7，8-四氢-萘-2-基甲基]-氮杂环丁烷-3-甲酸；3-{[6-氯-4-(4-环己烷-3-三氟甲基-苄氧基亚氨基)-苯并二氢吡喃-7-基甲基]-氨基}-丙酸；3-{[3-氯-5-(4-环己基-3-三氟甲基-苄氧基亚氨基)-5，6，7，8-四氢-萘-2-基甲基]-氨基}-丙酸；1-[3-氯-5-(4-环己基-3-三氟甲基-苄氧基亚氨基)-5，6，7，8-四氢-萘-2-基甲基]-氮杂环丁烷-3-甲酸；1-[5-(4-环己基-3-三氟甲基-苄氧基亚氨基)-3-甲氧基-5，6，7，8-四氢-萘-2-基甲基]-氮杂环丁烷-3-甲酸；3-{[5-(4-环己基-3-三氟甲基-苄氧基亚氨基)-3-甲氧基-5，6，7，8-四氢-萘-2-基甲基]-氨基}-丙酸3-{[8-(4-环己基-3-三氟甲基-苄氧基亚氨基)-5，6，7，8-四氢-喹啉-3-基甲基]-氨基}-丙酸；1-[8-(4-环己基-3-三氟甲基-苄氧基亚氨基)-5，6，7，8-四氢-喹啉-3-基甲基]-氮杂环丁烷-3-甲酸；3-{4-[5-(4-环己基-3-三氟甲基-苄氧基亚氨基)-5，6，7，8-四氢-萘-2-基]-哌嗪-1-基}-丙酸；3-{[1-(4-环己基-3-三氟甲基-苄氧基亚氨基)-茚满-5-基甲基]-氨基}-丙酸；1-[8-(4-环己基-3-三氟甲基-苄氧基亚氨基)-5，6，7，8-四氢-萘-2-基甲基]-氮杂环丁烷-3-甲酸；3-{[8-(4-环己基-3-三氟甲基-苄氧基亚氨基)-5，6，7，8-四氢-萘-2-基甲基]-氨基}-丙酸；3-{[5-(4-环己基-3-三氟甲基-苄氧基亚氨基)-3-乙基-5，6，7，8-四氢-萘-2-基甲基]-氨基}丙酸；3-{[4-(4-环己基-3-三氟甲基-苄氧基亚氨基)-苯并二氢吡喃-6-基甲基]-氨基}-丙酸；3-{[4-(4-环己基-3-三氟甲基-苄氧基亚氨基)-苯并二氢吡喃-7-基甲基]-氨基}-丙酸；1-[4-(4-环己基-3-三氟甲基-苄氧基亚氨基)-苯并二氢吡喃-7-基甲基]-氮杂环丁烷-3-甲酸；3-{[4-(4-环己基-3-三氟甲基-苄氧基亚氨基)-3，4-二氢-2H-吡喃并[2，3-b]吡啶-7-基甲基]-氨基}-丙酸；1-[4-(4-环己基-3-三氟甲基-苄氧基亚氨基)-3，4-二氢-2H-吡喃并[2，3-b]吡啶-7-基甲基]-氮杂环丁烷-3-甲酸；1-[4-(4-环己基-3-甲基-苄氧基亚氨基)-苯并二氢吡喃-7-基甲基]-氮杂环丁烷-3-甲酸；以及3-{[4-(4-环己基-3-甲基-苄氧基亚氨基)-苯并二氢吡喃-7-基甲基]-氨基}-丙酸。优选的化合物也显示于下文的实施例和表1中。
本发明提供了将羟基或氨基以保护形式存在的化合物形式；这些化合物形式具有作前体药物的功能。前体药物是在施用后，通过一个或多个化学或生物化学转化，转化为活性药物形式的化合物。在生理学条件下很容易转化为要求权利保护的化合物的本发明化合物形式是要求权利保护的化合物的前体药物并在本发明的范围内。前体药物的实例包括其中羟基经酰化而形成相对不稳定的酯如乙酸酯的形式，以及包括其中氨基用甘氨酸或L-氨基酸如丝氨酸的羧酸基团酰化而形成特别容易受通常的代谢酶水解的酰胺键形式。
式I化合物可以游离形式或盐形式如与无机酸或有机酸形成的加成盐形式存在。如果存在羟基，这些基团也可以盐的形式存在，例如铵盐或与金属如锂、钠、钾、钙、锌或镁的盐，或其混合物存在。水合物或溶剂合物形式的式I化合物及其盐也是本发明的部分。
当式I化合物在分子中具有不对称中心时，获得多种光学异构体。本发明也包含对映体、外消旋体、非对映异构体及其混合物。而且，当式I化合物包括几何异构体时，本发明包含顺式化合物、反式化合物及其混合物。对于显示如上提到的不对称碳原子或不饱和键的起始物质也给予类似考虑。
用于治疗免疫调节性疾病的方法和药物组合物游离形式或可药用盐形式的式I化合物表现出有价值的药理性质，例如，淋巴细胞再循环调节性质，例如，如通过实施例12的体外和体内试验表明的，并因而表明可用于治疗。式I化合物优选显示在1×10-11-1×10-5M的范围内，优选小于50nM的EC50。化合物显示出对一种或多种EDG/S1P受体，优选对EDG-1/S1P-1受体的选择性。本发明的EDG-1/S1P-1选择性调节剂可以通过测定化合物与EDG-1/S1P-1和一种或多种其它EDG/S1P受体(例如EDG-3/S1P-3、EDG-5/S1P-2、EDG-6/S1P-4和EDG-8/S1P-5)的结合而得以鉴定。EDG-1/S1P-1选择性调节剂一般具有在1×10-11-1×10-5M范围内，优选少于50nM，更优选少于5nM的对EDG-1/S1P-1受体的EC50。其也具有对一种或多种其它EDG/S1P比其对EDG-1/S1P-1的EC50高至少5、10、25、50、100、500或1000倍的EC50。因而，一些EDG-1/S1P-1调节性化合物将对EDG-1/SlP-1具有少于5nM的EC50，而它们对一种或多种其它EDG/S1P受体的EC50至少是100nM或更高。除了测定其对EDG/S1P受体的结合活性，EDG-1/SlP-1选择剂也可以通过检测测试剂改变由EDG/S1P受体介导的细胞过程或活性的能力而得以鉴定。
因此，式I化合物可用于治疗和/或预防由淋巴细胞介导的疾病或病症，例如，用于移植，如细胞、组织或器官同种异体移植物或异种移植物的急性或慢性排斥或延迟的移植物功能、移植物抗宿主病、自身免疫病如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、桥本甲状腺炎、多发性硬化症、症肌无力症、I型或II型糖尿病及其相关的疾病、血管炎、恶性贫血、舍格伦综合征、眼色素层炎、牛皮癣、格雷夫斯眼病、斑秃等，变应性疾病，如变应性哮喘、特应性皮炎、变应性鼻炎/结膜炎、变应性接触性皮炎，任选有潜在异常反应的炎性疾病，如炎性肠病、节段性回肠炎或溃疡性结肠炎、内源性哮喘、炎性肺损伤、炎性肝损伤、炎性肾小球损伤、动脉粥样硬化、骨性关节炎、刺激性接触性皮炎及其它湿疹性皮炎、脂溢性皮炎、免疫性疾病的皮肤表现、炎性眼部疾病、角结膜炎、心肌炎或肝炎，缺血/再灌注损伤，如心肌梗塞、中风、肠缺血、肾衰竭或失血性休克、创伤性休克、T细胞淋巴瘤或T细胞白血病，感染性疾病，如中毒性休克(例如超抗原诱导的)、败血性休克、成人呼吸窘迫综合征或病毒感染，例如AIDS、病毒性肝炎、慢性细菌性感染或老年性痴呆。细胞、组织或实体器官移植物的实例包括，例如，胰岛、干细胞、骨髓、角膜组织、神经元组织、心脏、肺、联合心-肺移植物、肾脏、肝脏、肠、胰腺、气管或食道。对于上面的用途，所需剂量理当根据施用模式、待治疗的特定疾病和希望的效果而不同。
而且，式I化合物可用于癌症化学疗法，特别是用于实体瘤例如乳腺癌的癌症化学疗法，或用作抗血管生成剂。
当然，所需剂量将取决于施用的模式、待治疗的具体疾病和期望的效果而不同。通常，据研究表明以约0.03-2.5mg/kg体重的日剂量可系统地获得满意的结果。在更大的哺乳类如人中表明的日剂量是在约0.5mg-约100mg的范围，便利地例如以分份剂量一天多达四次施用，或以延缓的形式施用。用于口服施用的合适单位剂型包含约1-50mg活性成分。
式I化合物可以通过任何常规途径施用，特别是经肠内施用，例如口服，如以片剂或胶囊剂的形式，或经肠胃外施用，例如，以可注射溶液或悬液的形式，或局部施用，例如以洗剂、凝胶剂、软膏剂或乳膏的形式或以经鼻或栓剂形式施用。含有与至少一种可药用载体或稀释剂组合的、游离形式或可药用盐形式的式I化合物的药物组合物可以以常规的方式通过与可药用载体或稀释剂混合而生产。
式I化合物可以以游离形式或以可药用盐形式，例如，如上面指出的形式施用。这类盐可以以常规方法制备并显示出与游离化合物相同数量级的活性。
式I化合物可以以游离形式或以可药用盐形式，例如，如上面指出的形式施用。这种盐可以以常规方法制备并显示出与游离化合物相同数量级的活性。
根据前述内容，本发明进一步提供1.1用于在需要这种治疗的受试者中预防或治疗由淋巴细胞介导的病症或疾病例如上面指出的疾病的方法，该方法包括施用有效量的式I化合物或其可药用盐至所述受试者。
1.2用于在需要这种治疗的受试者中预防或治疗急性或慢性移植排斥或T细胞介导的炎性疾病或自身免疫病例如如上面指出的疾病的方法，该方法包括施用有效量的式I化合物或其可药用盐至所述受试者。
1.3用于在需要这种治疗的受试者中抑制或控制失调的血管发生，例如，1-磷酸-鞘氨醇(S1P)介导的血管发生的方法，该方法包括施用治疗有效量的式I化合物或其可药用盐至所述受试者。
1.4用于在需要这种治疗的受试者中预防或治疗由血管新生过程介导的或与失调的血管发生相关的疾病的方法，该方法包括施用治疗有效量的式I化合物或其可药用盐至所述受试者。
2.游离形式或可药用盐形式的式I化合物，其例如，在如上面1.1-1.4下指出的任意方法中用作药物。
3.药物组合物，其例如用于如上面1.1-1.4中的任意方法中，该药物组合物包含与可药用稀释剂或载体组合的游离形式或可药用盐形式的式I化合物。
4.式I化合物或其可药用盐，其用于制备用于上面1.1-1.4中任意方法的药物组合物。
式I化合物可以作为单一的活性成分或，例如作为其它药物的辅助剂，与其它药物一起施用，所述的其它药物例如是例如用于治疗或预防同种异体移植物或异种移植物急性或慢性排斥或炎性或自身免疫病症的免疫抑制剂或免疫调节剂或其它抗炎剂，或化学治疗剂如恶性细胞抗增殖剂。例如，式I化合物可与以下药物联合使用钙依赖磷酸酶抑制剂，如环孢菌素A或FK 506；mTOR抑制剂，如雷帕霉素、40-O-(2-羟乙基)-雷帕霉素、CCI779、ABT578或AP23573；具有免疫抑制特性的子囊霉素，如ABT-281、ASM981等；糖皮质激素；环磷酰胺；硫唑嘌呤；甲氨喋呤；来氟米特；咪唑立宾；霉酚酸；麦考酚酸吗啉乙酯；15-脱氧斯潘格宁或其免疫抑制同系物、类似物或衍生物；免疫抑制性单克隆抗体，例如白细胞受体如MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD25、CD28、CD40、CD45、CD58、CD80、CD86或它们的配体的单克隆抗体；其它免疫调节化合物，如具有至少一部分CTLA4或其突变体的细胞外结构域的重组结合分子，例如连接至非CTLA4蛋白序列的至少CTLA4或其突变体的细胞外结构域，如CTLA4Ig(例如，称为ATCC 68629)或其突变体如LEA29Y；粘附分子抑制剂，如LFA-1拮抗剂、ICAM-1或ICAM-3拮抗剂、VCAM-4拮抗剂或VLA-4拮抗剂；或化学治疗剂。
术语“化学治疗剂”表示任何化学治疗剂且其包括但不限于，i.芳香酶抑制剂，ii.抗雌激素剂、抗雄激素剂(特别是在前列腺癌的情况下)或促性腺激素释放因子激动剂。
iii.拓扑异构酶I抑制剂或拓扑异构酶II抑制剂，iv.微管活性剂、烷化剂、抗肿瘤的抗肿瘤抗代谢剂或铂化合物，v.靶向/降低蛋白质或脂激酶活性或蛋白质或脂磷酸酶活性的化合物，另外的抗血管生成化合物或诱导细胞分化过程的化合物，vi.缓激肽1受体或血管紧张素II拮抗剂，vii.环加氧酶抑制剂、二膦酸盐、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、类肝素酶抑制剂(防止硫酸乙酰肝素降解)如PI-88、生物学应答调节剂，优选淋巴因子或干扰素，例如干扰素γ、遍在蛋白化抑制剂或阻断抗细胞凋亡途径的抑制剂，viii.Ras致癌亚型如H-Ras、K-Ras或N-Ras的抑制剂，或法呢基转移酶抑制剂，如L-744,832或DK8G557，ix.端粒酶抑制剂，如telomestatin，x.蛋白酶抑制剂、基质金属蛋白酶抑制剂、甲硫氨酸氨肽酶抑制剂如bengamide或其衍生物，或蛋白体抑制剂如PS-341，和/或xi.mTOR抑制剂。
如此处使用的术语“芳香酶抑制剂”涉及抑制雌激素产生，即抑制底物雄烯二酮和睾酮分别转化为雌酮和雌二醇的化合物。该术语包括，但不限于类固醇类化合物，特别是阿他美坦、依西美坦和福美坦，以及特别是非类固醇类化合物，尤其是氨鲁米特、洛太米特、吡鲁米特、曲洛司坦、睾内酯、ketokonazole、伏氯唑、法倔唑、阿纳托唑和来曲唑。含有作为芳香酶抑制剂的化学治疗剂的本发明组合物特别是可用于治疗激素受体阳性肿瘤，如乳腺癌。
如此处使用的术语“抗雌激素剂”涉及在雌激素受体水平上对抗雌激素的作用的化合物。该术语包括，但不限于它莫西芬、氟维司群、雷洛昔芬和盐酸雷洛昔芬。含有作为抗雌激素的化学治疗剂的本发明组合物特别是可用于治疗雌激素受体阳性肿瘤，如乳腺癌。
如此处使用的术语“抗雄激素剂”涉及能抑制雄激素的生物效应的任何物质且包括但不限于比卡鲁胺。
如此处使用的术语“促性腺激素释放因子激动剂”包括，但不限于阿巴瑞克、戈舍瑞林和醋酸性瑞林。
如此处使用的术语“拓扑异构酶I抑制剂”包括，但不限于托泊替康、依立替康、9-硝基喜树碱和高分子喜树碱轭合物PNU-166148(WO99/17804中的化合物A1)。
如此处使用的术语“拓扑异构酶II抑制剂”包括，但不限于蒽环类抗生素，如阿霉素、红比霉素、表柔比星、伊达比星和奈莫柔比星，蒽醌类米托蒽醌和洛索蒽醌和podophillotoxine类足叶乙甙和替尼泊甙。
术语“微管活性剂”涉及微管稳定剂和微管去稳定剂，包括，但不限于紫杉烷类，如紫杉醇和紫杉萜，长春花生物碱，如长春碱，特别是硫酸长春碱，长春新碱特别是硫酸长春新碱，以及长春瑞滨，discodermolides和epothilones及其衍生物，例如epothilone B或其衍生物。
如此处使用的术语“烷化剂”包括，但不限于白消安、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑或亚硝基脲(BCNU或GliadelTM)。
术语“抗肿瘤抗代谢剂”包括，但不限于5-氟尿嘧啶、卡培他滨、吉西他滨、阿糖胞苷、氟达拉滨、硫鸟嘌呤、甲氨喋呤和依达曲沙。
如此处使用的术语“铂化合物”包括，但不限于卡铂、顺铂和奥沙利铂。
如此处使用的术语“靶向/降低蛋白质或脂激酶或另外的抗血管生成化合物”包括，但不限于蛋白酪氨酸激酶和/或丝氨酸和/或苏氨酸激酶抑制剂或脂激酶抑制剂，如靶向、降低或抑制以下激酶活性的化合物受体酪氨酸激酶的表皮生长因子家族(同型二聚体或异二聚体的EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4)、受体酪氨酸激酶的血管内皮生长因子家族(VEGFR)、血小板衍生生长因子-受体(PDGFR)、成纤细胞生长因子-受体(FGFR)、胰岛素样生长因子受体1(IGF-1R)、Trk受体酪氨酸激酶家族、Axl受体酪氨酸激酶家族、Ret受体酪氨酸激酶、Kit/SCFR受体酪氨酸激酶、c-Abl家族成员及它们的基因融合产物(例如BCR-Abl)、蛋白激酶C(PKC)的成员和丝氨酸/苏氨酸激酶的Raf家族、MEK、SRC、JAK、FAK、PDK或PI(3)激酶家族的成员，或PI(3)激酶相关的激酶家族的成员，和/或细胞周期蛋白依赖性激酶家族(CDK)的成员，以及其活性具有另外的机制例如不涉及蛋白或脂激酶抑制的抗血管生成化合物。
靶向、降低或抑制VEGFR的活性的化合物尤其是抑制VEGF受体酪氨酸激酶、抑制VEGF受体或抑制与VEGF结合的化合物、蛋白质或抗体，并特别是那些在以下文献中一般性并明确公开的化合物、蛋白质或单克隆抗体WO 98/35958中的例如1-(4-氯苯氨基)-4-(4-吡啶基甲基)酞嗪或其可药用盐，如其琥珀酸盐；WO 00/27820中的，例如N-芳基(硫代)邻氨基苯甲酸酰胺衍生物如2-[(4-吡啶基)甲基]氨基-N-[3-甲氧基-5-(三氟甲基)苯基]苯甲酰胺或2-[(1-氧-4-吡啶基)甲基]氨基-N-[3-三氟甲基苯基]苯甲酰胺，或WO 00/09495、WO 00/59509、WO 98/11223、WO00/27819和EP 0 769 947中的；那些由M.Prewett等在Cancer Research 59(1999)5209-5218中、由F.Yuan等在Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.93，pp.14765-14770，Dec.1996中、由Z.Zhu等在Cancer Res.58，1998，3209-3214中，以及由J.Mordenti等在Toxicologic Pathology，Vol.27，no.1，pp14-21，1999中描述的；WO 00/37502和WO 94/10202中的；由M.S.O′Reilly等，Cell 79，1994，315-328描述的AngiostatinTM；由M.S.O′Reilly等，Cell88，1997，277-285描述的EndostatinTM；邻氨基苯甲酸酰胺；ZD4190；ZD6474；SU5416；SU6668；或抗-VEGF抗体或抗-VEGF受体抗体如RhuMab。
抗体表示完整的单克隆抗体、多克隆抗体、至少2种完整抗体形成的多特异性抗体，以及抗体片段，只要它们表现所希望的生物活性。
靶向、降低或抑制表皮生长因子受体家族的活性的化合物尤其是抑制EGF受体酪氨酸激酶家族的成员如EGF受体、ErbB2、ErbB3和ErbB4或抑制与EGF或EGF相关配体的结合，或对ErbB和VEGF受体激酶具有双重抑制性效果的化合物、蛋白质或抗体，并特别是那些在以下文献中一般性并明确公开的化合物、蛋白质或单克隆抗体WO 97/02266中的，例如实施例39的化合物，或EP 0 564 409、WO 99/03854、EP 0520722、EP 0 566 226、EP 0 787 722、EP 0 837 063、US 5,747,498、WO 98/10767、WO 97/30034、WO 97/49688、WO 97/38983以及特别是WO 96/30347(例如称为CP 358774的化合物)、WO 96/33980(例如ZD 1839化合物)和WO95/03283(例如ZM105180化合物)或PCT/EP02/08780中的；例如曲妥单抗(trastuzumab)(HerpetinR)、西妥昔单抗(cetuximab)、Iressa、OSI-774、CI-1033、EKB-569、GW-2016、E1.1、E2.4、E2.5、E6.2、E6.4、E2.11、E6.3或E7.6.3。
靶向、降低或抑制PDGFR的活性的化合物尤其是抑制PDGF受体的化合物，例如N-苯基-2-嘧啶-胺衍生物，如imatinib。
靶向、降低或抑制c-AbI家族成员及它们的基因融合蛋白产物的活性的化合物是，例如N-苯基-2-嘧啶-胺衍生物，如imatinib；PD180970；AG957；或NSC 680410。
靶向、降低或抑制蛋白激酶C、Raf、MEK、SRC、JAK、FAK和PDK家族成员，或PI(3)激酶或PI(3)激酶相关的家族成员，和/或细胞周期蛋白依赖性激酶家族(CDK)成员的化合物特别是那些在EP 0 296 110中公开的星形孢菌素衍生物，如米哚妥林；更多的化合物的实例包括，例如UCN-01、沙芬戈、BAY 43-9006、薯司他丁-1、哌立福辛；依莫佛新；RO 318220和RO 320432；GO 6976；Isis 3521；或LY333531/LY379196。
其它抗血管生成化合物是例如反应停(THALOMID)和TNP-470。
靶向、降低或抑制蛋白或脂磷酸酶的活性的化合物是，例如磷酸酶1、磷酸酶2A、PTEN或CDC25抑制剂，如冈田酸或其衍生物。
诱导细胞分化过程的化合物是，例如视黄酸、α-、γ-或δ-生育酚或α-、γ-或δ-生育三烯酚。
如此处使用的术语环加氧酶抑制剂包括，但不限于，例如塞来考昔(CelebrexR)、罗非考昔(VioxxR)、艾托考昔、伐地考昔或5-烷基-2-芳基氨基苯乙酸如5-甲基-2-(2′-氯-6′-氟苯胺基)苯乙酸。
如此处使用的术语“组蛋白脱乙酰基酶抑制剂”包括，但不限于MS-27-275、SAHA、pyroxamide、FR-901228或丙戊酸。
如此处使用的术语“二膦酸盐”包括，但不限于，etridonic acid、氯甲双磷酸、替鲁膦酸、帕米膦酸、阿仑膦酸、伊班膦酸、利塞膦酸和唑来膦酸。
如此处使用的术语“基质金属蛋白酶抑制剂”包括，但不限于胶原拟肽和非拟肽抑制剂、四环素衍生物，如异羟肟酸(hydroxamate)拟肽抑制剂巴马司他及其口服生物可利用的类似物马马司他、普啉司他、BMS-279251、BAY12-9566、TAA211或AAJ996。
如此处使用的术语“mTOR抑制剂”包括，但不限于雷帕霉素(西罗莫司)或其衍生物，例如32-脱氧雷帕霉素、16-戊-2-炔基氧基-32-脱氧雷帕霉素、16-戊-2-炔基氧基-32(S)-二氢-雷帕霉素、16-戊-2炔基氧基-32(S)二氢-40-0-(2-羟乙基)-雷帕霉素和更优选地40-0-(2-羟乙基)-雷帕霉素。雷帕霉素衍生物的更多实例包括例如如USP 5,362,718公开的CCI779或40-[3-羟基-2-(羟甲基)-2-甲基丙酸脂]-雷帕霉素或其可药用盐，例如如WO99/15530公开的ABT578或40-(四唑基)-雷帕霉素，特别是40-表-(四唑基)-雷帕霉素，或例如在WO 98/02441和WO01/14387中公开的雷帕霉素类似物(rapalog)，如AP23573。
如果式I化合物与其它免疫抑制剂/免疫调节剂、抗炎剂或化学疗法治疗一起施用，共同施用的免疫抑制剂、免疫调节剂、抗炎剂或化学治疗化合物的剂量当然将取决于所采用的共同施用的药物的类型，例如，其是类固醇还是钙依赖磷酸酶抑制剂、取决于采用的特定药物、取决于接受治疗的疾病等。
根据前述的内容，本发明提供更进一步的方面5.如上面所述的方法，方法包括将治疗有效的、非毒性量的式I化合物和至少另外一种药物，如免疫抑制剂、免疫调节剂、抗炎药物或化学治疗药物，例如如上指出的这类药物共同施用，例如，同时或依次施用。
6.药物组合物，例如，套药包，其包含a)第一种药剂，其为如此处公开的处于游离或可药用盐形式的式I化合物，以及b)至少一种共同施用的药剂，例如免疫抑制剂、免疫调节剂、抗炎剂或化学治疗药物，例如如上公开的这类药物。该套药包可包括关于其施用的说明书。
如此处使用的，术语“共同施用”或“联合施用”等等，表示包括将所选择的治疗剂施用给单个患者，并旨在包括其中这些治疗剂不必以相同的施用途径或在相同时间施用的治疗用药法。
如此处使用的术语“药物组合物”表示通过混合或组合多于一种活性成分而得到的产物，并既包括活性成分的固定组合又包括非固定组合。术语“固定组合”表示活性成分如式I的化合物和共同施用的药剂以单一实体或单一剂量的形式同时施用给患者。术语“非固定组合”表示活性成分如式I化合物和共同施用的药剂作为分离的实体同时一起或依次而无明确的时间限制施用给患者，其中这种施用给患者身体提供了治疗有效水平的2种化合物。后者也应用于联合疗法，例如施用3种或更多种活性成分。
用于制备本发明化合物的方法本发明也包括用于制备本发明的免疫调节性化合物的方法。在所描述的反应中，如果希望在终产物中存在活性官能团的话，就有必要保护这些活性官能团，例如羟基、氨基、亚氨基、硫或羧基，以避免在反应中它们参与不希望的反应。可根据标准操作使用常规的保护基团，例如，参见T.W.Greene和P.G.M.Wuts的″Protective Groups in Organic Chemistry″，John Wiley and Sons，1991。
式I化合物可以通过如下反应方案中的方法制备 其中，A、W、X、Y、Z、R1、R2、R3和n是如上面式I的定义。式I化合物可以通过将式2化合物与式3化合物在存在合适的溶剂(例如甲醇，等等)和合适的酸(例如乙酸，等等)时反应而制备。反应在约0-60℃的温度下进行，并可以进行约48小时完成。
用于制备本发明化合物的其它方法通过将游离碱形式的化合物与可药用无机或有机酸反应将本发明化合物制备为可药用酸加成盐。备选地，本发明化合物的可药用碱加成盐可以通过将游离酸形式的化合物与可药用无机或有机碱反应而得以制备。备选地，本发明化合物的盐形式可以用起始材料或中间产物的盐制备。
游离酸或游离碱形式的本发明化合物可以分别从相应的碱加成盐或酸加成盐形式制备。例如，处于酸加成盐形式的本发明化合物通过用合适的碱(例如氢氧化铵溶液、氢氧化钠，等等)处理而可以转化为相应的游离碱。处于碱加成盐形式的本发明化合物通过用合适的酸(例如，盐酸，等等)处理而可以转化为相应的游离酸。
非氧化形式的本发明化合物可以从本发明化合物的N-氧化物通过在合适的惰性有机溶剂(例如，乙腈、乙醇、含水二烷，等等)中在0-80℃下用还原剂(例如，硫、二氧化硫、三苯膦、硼氢化锂、硼氢化钠、三氯化磷、三溴化磷，等等)处理而制备。
本发明化合物的前体药物衍生物可以通过本领域技术人员已知的方法(例如，对于进一步的细节，参见Saulnier等，(1994)，Bioorganic andMedicinal Chemistry Letters，Vol.4，p.1985)制备。例如，合适的前体药物可以通过将未衍生的本发明化合物与合适的氨甲酰化剂(例如，1，1-酰氧基烷基carbanochloridate、碳酸对硝基苯酯)反应而制备。
本发明化合物的受保护的衍生物可以通过本领域技术人员已知的方法制备。可应用于产生保护基团及其除去的技术的详细描述可在T W.Greene，″Protecting Groups in Organic Chemistry″，第3版，John Wileyand Sons公司，1999中找到。
本发明化合物可以在本发明方法过程中作为溶剂合物(例如，水合物)方便地制备或形成。本发明化合物的水合物可以通过用有机溶剂如二氧芑、四氢呋喃或甲醇从水/有机溶剂混合物中再结晶而方便地制备。
本发明化合物可以通过将该化合物的外消旋混合物与光学活性拆分剂反应来形成一对非对映异构化合物，分离非对映体并回收光学纯的对映体而制备为它们单独的立体异构体。而对映体的拆分可以用本发明化合物的共价非对映体衍生物进行，优选可分离的复合物(例如，晶体非对映盐)。非对映体具有独特的物理性质(例如，熔点、沸点、溶解度、反应性，等等)并可以利用这些不同容易地分离。非对映体可以通过色谱分离，或优选地通过基于溶解度不同的技术分离/拆分。然后通过任何不会导致外消旋作用的可行的方法将光学纯的对映体与拆分剂一起回收。可用于将化合物的立体异构体从它们的外消旋混合物中拆分出来的技术的更详细描述可以在Jean Jacques，Andre Collet，，Samuel H.Wilen，，“Enantiomers，Racematesand Resolutions”，John Wiley And Sons，公司，1981中找到。
总之，式I化合物可以通过涉及以下的方法制备(a)将式2化合物与式3化合物反应；并(b)任选地将本发明化合物转化为可药用盐；(c)任选地将本发明化合物的盐形式转化为非盐形式；(d)任选地将本发明化合物的非氧化形式转化为可药用N-氧化物；(e)任选地将本发明化合物的N-氧化形式转化为其非氧化形式。
(f)任选地将本发明化合物的分别的异构体从异构体混合物拆分出来。
(g)任选地将本发明未衍生化的化合物转化为可药用前体药物衍生物；并(h)任选地将本发明化合物的前体药物衍生物转化为其未衍生化形式。
有关起始材料的产生没有特别进行描述，这些化合物是已知的或可以根据本领域已知的方法或如下文实施例中公开的方法类似地制备。
本领域技术人员将明白，上面的转化仅是用于制备本发明化合物的方法的代表，并且将明白可同样使用其它熟知的方法。
实施例以下实施例提供了制备代表性化合物的详细描述，并用于举例说明，而不用于限制本发明。
实施例13-{[5-(4-环己基-3-三氟甲基-苄氧基亚氨基)-5，6，7，8-四氢-萘-2-基甲基]-氨基}-丙酸 将β-丙氨酸(0.2mmol)和Et3N(0.16mmol)加入至MeOH(1mL)中的5-氧代-5，6，7，8-四氢-萘-2-甲醛(0.1mmol)溶液中。将混合物在50℃下加热，搅拌1小时。冷却至室温后，以一份加入NaBH3CN(0.3mmol)并搅拌得到的混合物30分钟。然后加入O-(4-环己基-3-三氟甲基-苄基)-羟胺(0.12mmol)至上面的反应混合物，通过加入AcOH将该溶液的pH调至5-6。通过制备LCMS纯化得到3-{[5-(4-环己基-3-三氟甲基-苄氧基亚氨基)-5，6，7，8-四氢-萘-2-基甲基]-氨基}-丙酸；1H NMR(600MHz，CD3OD)δ8.00(d，1H)，7.65(s，1H)，7.59(d，1H)，7.52(d，1H)，7.35-7.26(m，2H)，5.22(s，2H)，4.21(s，2H)，3.30(t，2H)，2.94(m，1H)，2.78(m，6H)，1.90-1.70(m，7H)，1.60-1.45(m，2H)，1.45-1.30(m，3H)；MS(ES+)503.2(M+1)+。
实施例21-[5-(4-环己基-3-三氟甲基-苄氧基亚氨基)-5，6，7，8-四氢-萘-2-基甲基]-氮杂环丁烷-3-甲酸 1H NMR(600MHz，CD3OD)δ7.99(d，1H)，7.64(s，1H)，7.59(d，1H)，7.53(d，1H)，7.30-7.20(m，2H)，5.33(s，2H)，4.36(s，2H)，4.35-4.25(m，4H)，3.75-3.65(m，1H)，2.95-2.85(m，1H)，2.78(t，4H)，1.90-1.70(m，7H)，1.60-1.35(m，5H)。MS(ES+)515.2(M+1)+。
实施例33-{[6-氯-4-(4-环己基-3-三氟甲基-苄氧基亚氨基)-苯并二氢吡喃-7-基甲基]-氨基}-丙酸 1H NMR(600MHz，CD3OD)δ7.94(s，1H)，7.66(s，1H)，7.61(d，1H)，7.55(d，1H)，7.16(s，1H)，5.25(s，2H)，4.34(s，2H)，4.23(t，2H)，3.38(t，2H)，2.95(t，2H)，2.90-2.85(m，1H)，2.79(t，2H)，1.90-1.85(m，2H)，1.80-1.75(m，3H)，1.60-1.30(m，5H)。MS(ES+)539.2(M+1)+。
实施例43-{4-[5-(4-环己基-3-三氟甲基-苄氧基亚氨基)-5，6，7，8-四氢-萘-2-基]-哌嗪-1-基}-丙酸 1H NMR(400MHz，CD3OD)δ7.82(d，1H)，7.63(s，1H)，7.56(d，1H)，7.50(d，1H)，6.84(d，1H)，6.75(s，1H)，5.15(s，2H)，3.75-3.35(m，8H)，3.47(t，2H)，2.95-2.80(m，1H)。2.89(t，2H)2.75-2.60(m，4H)，1.90-1.70(m，7H)，1.60-1.30(m，5H)。MS(ES+)558.3(M+1)+。
实施例51-[8-(4-环己基-3-三氟甲基-苄氧基亚氨基)-5，6，7，8-四氢-喹啉-3-基甲基]-氮杂环丁烷-3-甲酸 1H NMR(600MHz，CD3OD)δ8.42(s，1H)，7.70(s，1H)，7.58(s，1H)，7.52(d，1H)，7.45(d，1H)，5.23(s，2H)，4.40(s，2H)，4.30-4.20m，4H)，3.65-3.55(m，1H)，2.90-2.75(m，5H)，1.85-1.75(m，4H)，1.75-1.65(m，3H)，1.50-1.20(m，5H)。MS(ES+)516.2(M+1)+实施例63-{[8-(4-环己基-3-三氟甲基-苄氧基亚氨基)-5，6，7，8-四氢-喹啉-3-基甲基]-氨基}-丙酸 1H NMR(600MHz，CD3OD)δ8.55(s，1H))，7.96(s，1H)，7.60(s，1H)，7.55(d，1H)，7.45(d，1H)，5.28(s，2H)，4.25(s，2H)，3.25(t，2H)，2.90-2.75(m，5H)，2.70(t，2H)，1.90-1.80(m，2H)，1.80-1.70(m，2H)，1.70-1.60(m，3H)，1.50-1.40(m，2H)，1.40-1.20(m，3H)。MS(ES+)504.3(M+1)+。
使用合适的起始材料，通过重复在上面实施例中描述的方法，可以获得下面如表1确定的式I化合物表1
实施例22式I化合物显示生物学活性A.体外闪烁临近测定法(SPA)用于测量GTP[γ-35S]结合至从表达人EDG/S1P受体的CHO细胞制备的膜上。
EDG-1(S1P1)GTP[γ-35S]结合测定法膜蛋白悬液从稳定表达人EDG-1N-末端c-myc标签的CHO细胞克隆制备。在DMSO/50mM HCl中制备10mM-0.01nM的试验化合物，并然后稀释进测定缓冲液(20mMHEPES，pH7.4，100mM NaCl，10mM MgCl2，0.1％无脂BSA)中。将含有10mM GDP的测定缓冲液与麦胚凝集素包被的SPA-珠(1mg/孔)混合，随后加入人EDG-1膜蛋白悬液(10μg/孔)和试验化合物。然后在室温下在振荡器上将珠/膜/化合物组分混合10-15分钟。将GTP[γ-35S](200pM)和珠/膜/化合物测定混合物加入至96孔OptiplateTM的各个孔中(终体积为225μl/孔)，密封并在室温下、在恒定摇动下孵育110-120分钟。离心(2000rpm，10分钟)后，用TopCountTM仪器测量发光。
通过用ORIGIN V.6.1的剂量反应曲线拟合工具拟合GTP[γ-35S]结合曲线(原始数据)获得EC50。基准结合(无化合物)和通过激动剂获得的GTP[γ-35S]结合的最高刺激作为拟合的范围。将7种不同的浓度用于产生浓度反应曲线(每种浓度使用两个或三个数据点)。
以与EDG-1GTP[γ-35S]结合测定类似的方式，进行EDG-3、-5、-6和-8GTP[γ-35S]结合测定，使用来自CHO的膜，或在EDG-8的情况下使用RH7777膜，膜来自稳定表达c-末端c-myc标记的或未标记的受体的细胞。表达EDG受体的膜的浓度在13-19μg/孔的范围内。根据上面的测定法检测本发明化合物并观察到表现出对EDG-1受体的选择性。例如，3-{[5-(4-环己基-3-三氟甲基-苄氧基亚氨基)-5，6，7，8-四氢-萘-2-基甲基]-氨基}-丙酸在上面的测定法中具有0.78nM的EC50，并且与对一种或多种包括EDG-3、EDG-5、EDG-6和EDG-8在内的其它受体的选择性相比较，对EDG-1的选择性至少强1000倍。
B.体外FLIPR钙流出测定法用FLIPR钙流出测定法检测本发明化合物对EDG-1、EDG-3、EDG-5和EDG-6的激动剂活性。简而言之，将表达EDG受体的CHO细胞保持在含有5％FBS、500μg/ml G418的F-12K培养基(ATCC)中。在测定之前，将细胞铺于384孔黑色透明底的板中，密度为10,000个细胞/孔，每孔25μl的含有1％FBS的F-12K培养基。第二天，将细胞用洗涤缓冲液洗涤3次(25μl/次)。将约25μl的染料加入至每孔并在37℃和5％CO2下孵育1小时。然后用洗涤缓冲液洗涤细胞4次(25μl/次)。加入25μl SEQ2871溶液至每孔细胞后测定钙流出量。用表达每种不同EDG受体的细胞进行相同的测定。在3-分钟时间间隔内记录FLIPR钙流出测定中的滴定值，并定量为相对于EDG-1活化的最大峰高百分比反应。
C.体内用于测定血淋巴细胞损耗和评估心脏影响的筛选测定法循环淋巴细胞的测量溶解化合物于DMSO中并稀释获得4％DMSO(v/v，终浓度)的终浓度，并然后进一步稀释进恒定体积的吐温8025％/H2O，v/v。吐温8025％/H2O(200μl)、4％DMSO和FTY720(10μg)分别用作阴性和阳性对照。在短时间异氟烷麻醉下给小鼠(C57bl/6雄鼠，6-10周龄)用管饲法经口施用250-300μL的化合物溶液。
施用药物6小时和24小时后在短时间异氟烷麻醉下从眶后窦收集血液。将全部血液样品接受血液分析。用自动化分析仪测定外周淋巴细胞数目。外周血液淋巴细胞的亚群用荧光染料结合的特异性抗体染色并用荧光激活细胞分选仪(Facscalibur)分析。两只小鼠用于评估所筛选的每种化合物的淋巴细胞损耗活性。结果为ED50，其定义为表现50％的血液淋巴细胞损耗所需的有效剂量。根据上面的测定法检测本发明化合物，并优选地发现本发明化合物表现出少于1mg/kg的ED50，更优选为少于0.5mg/kg的ED50。例如，化合物2表现出0.2mg/kg的ED50。
心脏影响的评估用AnonyMOUSE ECG筛选系统监控化合物对心脏功能的影响。在施用化合物前后记录清醒的小鼠(C57bl/6雄鼠，6-10周龄)的心电图。然后用e-MOUSE软件分析和处理ECG信号。另外，腹膜内注射进一步稀释于200μl水、15％DMSO中的90μg化合物。4只小鼠用于评估每种化合物的心脏影响。
D体内抗血管生成活性将含有在0.5ml 0.8％w/v琼脂(含肝素，20U/ml)中的(i)1-磷酸-鞘氨醇(5μM/室)或(ii)人VEGF(1μg/室)的多孔小室皮下植入小鼠的胁腹中。S1P或VEGF诱导血管化组织在小室周围生长。这种反应是依赖剂量的并可以通过测量组织的重量和血液含量定量。在植入小室前4-6小时开始经口或由静脉内用式I化合物处理小鼠并继续4天，一天一次。最后一次剂量后24小时处死小鼠，用以测量血管化组织。测定小室周围的血管化组织的重量和血液含量。与仅用载体处理的动物比较，用式I化合物处理过的动物显示减少了血管化组织的重量和/或血液含量。当以约0.3-约3mg/kg的剂量施用时，式I化合物是抗血管生成的。
E体外抗肿瘤活性使用最初从乳腺癌分离的小鼠乳腺癌细胞系，例如JygMC(A)。在方法开始前将细胞数目调整为5×105以用于在新鲜培养基中接种。将细胞与含有2.5mM胸腺嘧啶核苷而无FCS的新鲜培养基孵育12小时并然后用PBS洗涤两次，然后加入含有10％FCS的新鲜培养基并额外孵育另外的12小时。此后，将细胞用含有2.5mM胸腺嘧啶核苷而无FCS的新鲜培养基孵育12小时。为了让细胞解除阻断，将细胞用PBS洗涤两次并再次接种于含有10％FCS的新鲜培养基中。同步化后，将细胞用或不用多种浓度的式I化合物孵育3、6、9、12、18或24小时。用0.2％EDTA处理后收集细胞，用冰冷的70％乙醇溶液固定，在37℃下用250μg/ml RNA酶A(1-A型Sigma化学公司)水解30分钟并用10mg/ml的碘化丙锭染色20分钟。孵育期过后，通过Coulter计数仪计数细胞和通过SRB比色测定确定细胞的数目。在这些情况下，式I化合物以10-12-10-6M的浓度范围抑制肿瘤细胞增殖。
应该理解，这里描述的实施例和实施方案仅用于说明目的，并暗示了本领域技术人员根据本发明可做多种修饰或改变，它们均包括在本申请的精神和理解内以及后附的权利要求书范围内。为全部目的，将所有在此引用的出版物、专利和专利申请通过引用作为参考。
权利要求
1.式I化合物及其可药用盐、水合物、溶剂合物、异构体和前体药物 其中n是0、1或2；R1选自C6-10芳基和C5-10杂芳基；其中R1的任意芳基或杂芳基由选自C6-10芳基C0-4烷基、C5-6杂芳基C0-4烷基、C3-8环烷基C0-4烷基、C3-8杂环烷基C0-4烷基或C1-10烷基的基团任选取代；其中R1的任意芳基、杂芳基、环烷基或杂环烷基可由1-5个选自卤素、C1-10烷基、C1-10烷氧基、卤素取代的C1-10烷基和卤素取代的C1-10烷氧基的基团任选取代；以及R1的任意烷基可任选地将亚甲基用选自-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-NR4-和-O-的原子或基团替代；其中R4选自氢或C1-6烷基；R2和R3独立地选自氢、C1-6烷基、卤素、羟基、C1-6烷氧基、卤素取代的C1-6烷基和卤素取代的C1-6烷氧基；A选自-X1C(O)OR4、-X1OP(O)(OR4)2、-X1P(O)(OR4)2、-X1P(O)OR4、-X1S(O)2OR4、-X1P(O)(R4)OR4和1H-四唑-5-基；其中X1是键或C1-6亚烷基以及R4选自氢和C1-6烷基；W选自键、C1-6亚烷基和C2-6亚链烯基；X选自C2-4亚烷基和C2-4亚链烯基；其中X的一个亚甲基可以用选自-O-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-和-NR5-的原子或基团替代；其中R5是氢、C1-6烷基和-C(O)R6；其中R6选自氢和C1-6烷基；其中X的任意亚烷基或亚链烯基可进一步由1-3个选自卤素、羟基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤素取代的C1-10烷基和卤素取代的C1-10烷氧基的基团取代；Y选自C6-10芳基和C5-10杂芳基，其中Y的任意芳基或杂芳基任选由1-3个选自卤素、羟基、硝基、C1-10烷基、C1-10烷氧基、卤素取代的C1-10烷基和卤素取代的C1-10烷氧基取代；Z是C1-6亚烷基；其中Z的不超过两个的亚甲基可以由选自-NR7-、C3-8环亚烷基、C3-8杂环亚烷基和亚苯基的二价基团替代；其中R7选自氢、C1-6烷基和(CH2)1-2COOH；其中Z可以进一步由1-3个选自卤素、羟基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤素取代的C1-6烷基和卤素取代的C1-6烷氧基的基团取代；或当-NR7-替代Z的至少一个亚甲基时，R7和Y与R7连接其上的氮原子一起形成C8-14亚杂芳基。
2.权利要求2的化合物，其中n是0或1且Z选自 其中Z的左边和右边星号分别表示其与式I的-[C(R2)(R3)]n-基团和与A之间的连接点；R7选自氢和C1-6烷基；以及J1、J2和J3独立地是亚甲基或选自S、O的杂原子和NR4；其中R4是氢或C1-6烷基；条件是杂原子的数目是2或更少。
3.权利要求1的化合物，其中R1选自任选由C6-10芳基C0-4烷基、C5-6杂芳基C0-4烷基、C3-8环烷基C0-4烷基、C3-8杂环烷基C0-4烷基或C1-10烷基取代的苯基、萘基和噻吩基；其中，R1的任意芳基、杂芳基、环烷基或杂环烷基可任选由1-5个选自卤素、C1-10烷基、C1-10烷氧基、卤素取代的C1-10烷基和卤素取代的C1-10烷氧基的基团取代；以及R1的任意烷基可任选地将亚甲基由选自-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-NR4-和-O-的原子或基团替代；其中R4是氢或C1-6烷基。
4.权利要求1的化合物，其中Y选自苯基、吡啶、嘧啶、噻吩、呋喃、噻唑和唑；它们每个可由1-3个选自卤素、羟基、硝基、C1-10烷基、C1-10烷氧基、卤素取代的C1-10烷基和卤素取代的C1-10烷氧基的基团任选取代。
5.权利要求1的化合物，其中R2和R3同时为氢且A选自-C(O)OR4和1H-四唑-5-基；其中R4选自氢和C1-6烷基。
6.权利要求1的化合物，其中R1选自 其中星号是R1与W的连接点；R9是C6-10芳基C0-4烷基、C5-6杂芳基C0-4烷基、C3-8环烷基C0-4烷基、C3-8杂环烷基C0-4烷基或C1-10烷基；其中R9的任意芳基、杂芳基、环烷基或杂环烷基可由1-3个选自卤素、C1-10烷基、C1-10烷氧基、卤素取代的C1-10烷基和卤素取代的C1-10烷氧基的基团任选取代；以及R9的任意烷基可任选地将亚甲基由选自-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-NR4-和-O-的原子或基团替代，其中R4是氢或C1-6烷基；以及R10选自卤素、C1-10烷基、C1-10烷氧基、卤素取代的C1-10烷基和卤素取代的C1-10烷氧基。
7.权利要求1的化合物，所述的化合物选自3-{[5-(4-环己基-3-三氟甲基-苄氧基亚氨基)-5，6，7，8-四氢-萘-2-基甲基]-氨基}-丙酸；1-[5-(4-环己基-3-三氟甲基-苄氧基亚氨基)-5，6，7，8-四氢-萘-2-基甲基]-氮杂环丁烷-3-甲酸；3-{[6-氯-4-(4-环己烷-3-三氟甲基-苄氧基亚氢基)-苯并二氢吡喃-7-基甲基]-氨基}-丙酸；3-{[3-氯-5-(4-环己基-3-三氟甲基-苄氧基亚氨基)-5，6，7，8-四氢-萘-2-基甲基]-氨基}-丙酸；1-[3-氯-5-(4-环己基-3-三氟甲基-苄氧基亚氨基)-5，6，7，8-四氢-萘-2-基甲基]-氮杂环丁烷-3-甲酸；1-[5-(4-环己基-3-三氟甲基-苄氧基亚氨基)-3-甲氧基-5，6，7，8-四氢-萘-2-基甲基]-氮杂环丁烷-3-甲酸；3-{[5-(4-环己基-3-三氟甲基-苄氧基亚氨基)-3-甲氧基-5，6，7，8-四氢-萘-2-基甲基]-氨基}-丙酸；3-{[8-(4-环己基-3-三氟甲基-苄氧基亚氨基)-5，6，7，8-四氢-喹啉-3-基甲基]-氨基}-丙酸；1-[8-(4-环己基-3-三氟甲基-苄氧基亚氨基)-5，6，7，8-四氢-喹啉-3-基甲基]-氮杂环丁烷-3-甲酸；3-{4-[5-(4-环己基-3-三氟甲基-苄氧基亚氨基)-5，6，7，8-四氢-萘-2-基]-哌嗪-1-基}-丙酸；3-{[1-(4-环己基-3-三氟甲基-苄氧基亚氨基)-茚满-5-基甲基]-氨基}-丙酸；1-[8-(4-环己基-3-三氟甲基-苄氧基亚氨基)-5，6，7，8-四氢-萘-2-基甲基]-氮杂环丁烷-3-甲酸；3-{[8-(4-环己基-3-三氟甲基-苄氧基亚氨基)-5，6，7，8-四氢-萘-2-基甲基]-氨基}-丙酸；3-{[5-(4-环己基-3-三氟甲基-苄氧基亚氨基)-3-乙基-5，6，7，8-四氢-萘-2-基甲基]-氨基}丙酸；3-{[4-(4-环己基-3-三氟甲基-苄氧基亚氨基)-苯并二氢吡喃-6-基甲基]-氨基}-丙酸；3-{[4-(4-环己基-3-三氟甲基-苄氧基亚氨基)-苯并二氢吡喃-7-基甲基]-氨基}-丙酸；1-[4-(4-环己基-3-三氟甲基-苄氧基亚氨基)-苯并二氢吡喃-7-基甲基]-氮杂环丁烷-3-甲酸；3-{[4-(4-环己基-3-三氟甲基-苄氧基亚氨基)-3，4-二氢-2H-吡喃并[2，3-b]吡啶-7-基甲基]-氨基}-丙酸；1-[4-(4-环己基-3-三氟甲基-苄氧基亚氨基)-3，4-二氢-2H-吡喃并[2，3-b]吡啶-7-基甲基]-氮杂环丁烷-3-甲酸；1-[4-(4-环己基-3-甲基-苄氧基亚氨基)-苯并二氢吡喃-7-基甲基]-氮杂环丁烷-3-甲酸；以及3-{[4-(4-环己基-3-甲基-苄氧基亚氨基)-苯并二氢吡喃-7-基甲基]-氨基}-丙酸。
8.药物组合物，所述药物组合物包含与可药用赋形剂组合的、治疗有效量的权利要求1的化合物。
9.用于在动物中治疗疾病的方法，其中所述动物中EDG/S1P受体介导的信号转导的改变可以预防、抑制或改善疾病的病理学和/或症状学，所述方法包括施用治疗有效量的权利要求1的化合物至该动物。
10.用于预防或治疗由淋巴细胞介导的病症或疾病的方法，所述方法用于在受试者中治疗急性或慢性移植排斥或T-细胞介导的炎性疾病或自身免疫疾病，用于抑制或控制失调的血管发生，或用于治疗由血管新生过程介导的或与失调的血管发生相关的疾病，所述方法包括施用治疗有效量的权利要求1的化合物或其可药用盐至需要它的受试者。
11.权利要求1的化合物的用途，用于制备在动物中治疗疾病的药物，其中在所述动物中EDG/S1P受体介导的信号转导的改变促成该疾病的病理学和/或症状学。
12.用于制备式I化合物的方法 其中n是0、1或2；R1选自C6-10芳基和C5-10杂芳基；其中R1的任意芳基或杂芳基由选自C6-10芳基C0-4烷基、C5-6杂芳基C0-4烷基、C3-8环烷基C0-4烷基、C3-8杂环烷基C0-4烷基或C1-10烷基的基团任选取代；其中R1的任意芳基、杂芳基、环烷基或杂环烷基可由1-5个选自卤素、C1-10烷基、C1-10烷氧基、卤素取代的C1-10烷基和卤素取代的C1-10烷氧基的基团任选取代；以及R1的任意烷基可任选地将亚甲基用选自-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-NR4-和-O-的原子或基团替代；其中R4选自氢或C1-6烷基；R2和R3独立地选自氢、C1-6烷基、卤素、羟基、C1-6烷氧基、卤素取代的C1-6烷基和卤素取代的C1-6烷氧基；A选自-X1C(O)OR4、-X1OP(O)(OR4)2、-X1P(O)(OR4)2、-X1P(O)OR4、-X1S(O)2OR4、-X1P(O)(R4)OR4和1H-四唑-5-基；其中X1是键或C1-6亚烷基以及R4选自氢和C1-6烷基；W选自键、C1-6亚烷基和C2-6亚链烯基；X选自C2-4亚烷基和C2-4亚链烯基；其中X的一个亚甲基可以用选自-O-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-和-NR5-的原子或基团替代；其中R5是氢、C1-6烷基和-C(O)R6；其中R6选自氢和C1-6烷基；其中X的任意亚烷基或亚链烯基可进一步由1-3个选自卤素、羟基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤素取代的C1-10烷基和卤素取代的C1-10烷氧基的基团取代；Y选自C6-10芳基和C5-10杂芳基，其中Y的任意芳基或杂芳基任选由1-3个选自卤素、羟基、硝基、C1-10烷基、C1-10烷氧基、卤素取代的C1-10烷基和卤素取代的C1-10烷氧基取代；Z是C1-6亚烷基；其中Z的不超过两个的亚甲基可以由选自-NR7-、C3-8环亚烷基、C3-8杂环亚烷基和亚苯基的二价基团替代；其中R7选自氢、C1-6烷基和(CH2)1-2COOH；其中Z可以进一步由1-3个选自卤素、羟基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤素取代的C1-6烷基和卤素取代的C1-6烷氧基的基团取代；或当-NR7-替代Z的至少一个亚甲基时，R7和Y与R7连接其上的氮原子一起形成C8-14亚杂芳基；所述方法包括(a)将式2化合物 与式3化合物 反应，其中A、W、X、Y、Z、R1、R2、R3和n是如上式I中定义的；以及(b)任选地将本发明化合物转化为可药用盐；(c)任选地将本发明化合物的盐形式转化为非盐形式；(d)任选地将本发明化合物的非氧化形式转化为可药用N-氧化物；(e)任选地将本发明化合物的N-氧化形式转化为其非氧化形式；(f)任选地将本发明化合物的单独的异构体从异构体混合物拆分出来；(g)任选地将本发明未衍生化的化合物转化为可药用的前体药物衍生物；以及(h)任选地将本发明化合物的前体药物衍生物转化为其未衍生化形式。
全文摘要
本发明涉及免疫抑制剂、它们的产生方法、它们的用途及含有它们的药物组合物。本发明提供了一类新的化合物，所述的化合物可用于治疗或预防由淋巴细胞相互作用介导的疾病或病症，特别是与EDG受体介导的信号转导相关的疾病。
文档编号C07D205/04GK1922135SQ200580005990
公开日2007年2月28日 申请日期2005年2月24日 优先权日2004年2月24日
发明者S·潘, W·高, N·S·格雷, Y·米 申请人:Irm责任有限公司