专利名称：：一种酪蛋白磷酸化的方法
技术领域：
：本发明涉及改进蛋白功能性质领域，更具体的说，是涉及一种将酪蛋白进行磷酸化的方法。
背景技术：
：酪蛋白是一类含磷蛋白质，磷是生物膜的重要组成成分，是生物体不可缺少的元素之一。酪蛋白分子具有双亲性，柔韧性好，且具有较高的营养价值，常作为食品组分或添加剂应用于食品工业，还可添加到其他食品中强化蛋白质。酪蛋白能够在水中形成胶体，具有一定的粘度和良好的持水特性在冰淇淋生产中，添加酪蛋白酸钠做稳定剂，具有增强脂肪乳化，保湿和改善粘度等作用。酪蛋白中存在着明显的疏水区和亲水区，因此具有较好的乳化性和发泡性在饮料工业中，酪蛋白可以作为酸性饮料的稳定剂，酒和啤酒的澄清剂，苹果汁的脱色剂。利用酪蛋白制品的乳化特性，可以用来生产含较高脂类的食品，也可应用于牙膏，护手霜等产品中。另外，在饲料中添加碘化酪蛋白还可提高乳牛的产奶量。但在食物蛋白开发过程中，由于酪蛋白的一些功能性质也使其在食品工业应用上受到了一定限制。为了扩大其应用范围，采用适度的磷酸化改性方法可使其原有的功能特性更适于食品加工。而蛋白质的磷酸化作用对其消化无显著影响。目前，在酪蛋白的磷酸化改性方法中大多是采用三氯氧磷作为磷酸化试剂。三氯氧磷是一种非常活泼的试剂，反应放出的热量和pH的骤降会使蛋白变性，同时，实验条件很剧烈，不易控制。而且，反应引起蛋白质分子间交联，蛋白质分子发生交联后，分子量进一步增大，从而导致溶解度下降。
发明内容本发明是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种以三聚磷酸钠为磷酸化试剂，反应条件温和，容易控制，使改性后的酪蛋白的营养价值和各方面性质更适合于食品加工的酪蛋白磷酸化的方法。本发明通过下述技术方案实现本发明酪蛋白磷酸化的方法以分析纯干酪素为原料，溶解于磷酸盐緩冲液中，磁力搅拌至完全溶解后，真空抽滤，得到酪蛋白溶液。将溶液的pH控制在碱性，加入一定浓度的三聚磷酸钠溶液，再经过真空纤维膜透析、冷冻干燥可以得到棉花状的白色的磷酸化酪蛋白。具体操作步骤如下(1)制备酪蛋白溶液将干酪素溶解于磷酸盐緩冲液中，在4(TC搅拌至完全溶解，之后进行真空抽滤，去掉干酪素中的固体杂质及部分未溶的蛋白质和脂类，得到酪蛋白溶液；其中干酪素与磷酸盐緩沖液的重量/体积比为1:100~150左右。所述磷酸盐緩冲液由磷酸二氢钠和磷酸氢二钠配置而成，所述磷酸盐緩沖液的浓度为0.2mol/L、pH值为7。(2)磷酸化调整酪蛋白溶液的pH值为7.G~9.G，之后在上述碱性酪蛋白溶液中加入质量体积百分比浓度为3%~5%的三聚磷酸钠溶液，在30匸5(TC恒温2-4小时进行磷酸化反应，之后冷却到室温。溶液中酪蛋白与三聚磷酸钠的质量比为1:3~5。调整酪蛋白溶液的pH值时所用溶液最好为稀氢氧化钠溶液，氢氧化钠溶液的浓度为0.01mol/L，由于緩沖液中也是用的钠盐，使得引入杂质离子少。在磷酸化过程中，三聚磷酸盐可和蛋白质的氨基发生化学反应，把反应条件控制在弱碱性，即pH值为7~9时，自由氨基的活性较大，即使在中性到碱性的条件下也可以反应。三聚磷酸钠和蛋白表面氨基的反应式为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>(3)纯化调节磷酸化后的酪蛋白溶液的pH值至中性，用真空纤维膜进行透析，去除溶液中的小分子量离子，如Na+，磷酸根及磷酸氢根，三聚磷酸根等，收集酪蛋白溶液，再将上述溶液冷冻干燥，得棉花状的白色的磷酸化酪蛋白。所用调节磷酸化后的酪蛋白溶液的pH值至中性所用的溶液为稀盐酸溶液，其浓度为0.01mol/L。透析可以选用6000-8000D的真空纤维膜，小于这个分子量的离子会渗透出透析袋，而大于这个分子量的酪蛋白会留在透析袋里边。在透析过程中，每隔两小时换一次水，并用质量体积比浓度为1°/的氯化钡溶液检验透析溶液中小分子量离子的含量，直到符合要求，一般需要24小时透析结束。使用氯化钡进行检验时，由于BaCl2和磷酸根的反应生成的磷酸钡不溶于水，所以反应较为灵敏。冷冻干燥的温度为-5(TC,压强为500-600Pa,时间为24小时，使用钢制托盘进行冷冻干燥。本发明具有下述技术效果1.本发明酪蛋白的磷酸化方法采用三聚磷酸钠为磷酸化试剂，三聚磷酸钠是FDA批准使用的，不仅保障了食品安全，改善食品蛋白质的功能特性和营养特性，而且不影响食品蛋白的消化率。当酪蛋白与STP(三聚磷酸钠)在pH-79反应时，三聚磷酸盐可和蛋白质的氨基发生化学反应，改性蛋白分子中新增加的磷酸根主要是连接在氮原子上。把反应条件控制在弱碱性，即pH值为7~9时，自由氨基的活性较大，即使在中性到碱性的条件下也可以反应，反应条件温和，容易控制。而且，不会引起蛋白质分子间交联反应。因此，使用三聚磷酸钠为磷酸化试剂，既营养又安全，而且，实验工艺筒单，磷酸化效果好。2.通过本发明的磷酸化方法得到的酪蛋白中含磷量高，提高了酪蛋白的营养价值。而且，营养价值和各方面性质更适合于食品加工。具体实施例方式以下结合具体实施例对本发明详细说明。实施例1称取1.OOOg干酪素，将其溶解于100mL用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠配置的浓度为0.2mol/L、pH为7的磷酸盐緩沖液中。在温度40。C时，磁力搅拌约10小时至完全溶解，之后用布氏漏斗进行真空抽滤，少量多次，去掉干酪素中的固体杂质及部分未溶的蛋白质和脂类，最后得淡黄色酪蛋白溶液。滴加0.01mol/L的氢氧化钠调节上述酪蛋白溶液的pH值为7.Q备用。量取上述pH值为7.Q的酪蛋白溶液30mL，加入质量体积百分比浓度为3。/o的三聚磷酸钠溶液30mL，磷S吏化反应在电热恒温水浴锅进行，温度控制在40°C,反应时间为3小时。磷酸化后冷却至室温。之后用0.01mol/L的盐酸溶液调节上述磷酸化所得溶液的pH值至中性，用6000-8000D的真空纤维膜透析24小时，收集酪蛋白溶液。透析过程中隔两小时换一次水。每次透析结束后用质量体积比浓度为1°/。的氯化钡溶液检验收集的酪蛋白溶液，时间差为两小时左右，直至没有沉淀出现为止。最后将透析后收集的酪蛋白溶液放入钢制托盘在温度-50°C，压强为500Pa的条件下进行冷冻干燥，约24小时后得棉花状的白色的磷酸化酪蛋白。实施例2称取1.OOOg干酪素，将其溶解于150mL用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠配置的浓度为0.2mol/L、pH为7的磷酸盐緩冲液中。在温度4(TC时，磁力搅拌约10小时至完全溶解，之后用布氏漏斗进行真空抽滤，少量多次，去掉干酪素中的固体杂质及部分未溶的蛋白质和脂类，最后得淡黄色酪蛋白溶液。滴加0.Olmol/L的氬氧化钠调节上述酪蛋白溶液的pH值为8.0备用。量取上述pH值为8.G的酪蛋白溶液30mL,加入质量体积百分比浓度为4。/o的三聚磷酸钠溶液30mL，磷酸化反应在电热恒温水浴锅进行，温度控制在5(TC，反应时间为2小时。之后用0.01mol/L的盐酸溶液调节上述磷酸化所得溶液的pH值至中性，用6000-8000D的真空纤维膜透析24小时，收集酪蛋白溶液。透析过程中隔两小时换一次水。每次透析结束后用质量体积比浓度为1%的氯化钡溶液4企验收集的酪蛋白溶液，时间差为两小时左右，直至没有沉淀出现为止。最后将透析后收集的酪蛋白溶液放入钢制托盘在温度-50°C，压强为600Pa的条件下进行冷冻干燥，约24小时后得棉花状的白色的磷酸化酪蛋白。实施例3称取1.OOOg干酪素，将其溶解于120mL用磷酸二氬钠和磷酸氬二钠配置的浓度为0.2mol/L、pH为7的磷酸盐緩冲液中。在温度40。C时，磁力搅拌约10小时至完全溶解，之后用布氏漏斗进行真空抽滤，少量多次，去掉干酪素中的固体杂质及部分未溶的蛋白质和脂类，最后得淡黄色酪蛋白溶液。滴加0.01mol/L的氬氧化钠调节上述酪蛋白溶液的pH值为9.0备用。量取上述pH值为9.0的酪蛋白溶液30mL,加入质量体积百分比浓度为5。/o的三聚磷酸钠溶液30mL，磷酸化反应在电热恒温水浴锅进行，温度控制在30°C，反应时间为4小时。之后用0.01mol/L的盐酸溶液调节上述磷酸化所得溶液的pH值至中性，用6000-8000D的真空纤维膜透析24小时，收集酪蛋白溶液。透析过程中隔两小时换一次水。每次透析结束后用质量体积比浓度为ly。的氯化钡溶液^全验收集的酪蛋白溶液，时间差为两小时左右，直至没有沉淀出现为止。最后将透析后收集的酪蛋白溶液^:入钢制托盘在温度-50°C,压强为550Pa的条件下进行冷冻千燥，约24小时后得棉花状的白色的磷酸化酪蛋白。未磷酸化酪蛋白功能性质如表1所示，磷酸化后酪蛋白功能性质如表2所示。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>从上述表中可以看出，在实施例1中，未磷酸化的酪蛋白的磷含量是0.0086g(磷/g酪蛋白)，磷酸化后的酪蛋白的含磷量最高可达O.0175g(磷/g酪蛋白)，也就是说增量可以达到约0.0089g(新增磷/g酪蛋白)。酪蛋白中含磷量高，提高了酪蛋白的营养价值。乳化性参数由676.30m2/g提高到1092.55附Vg。在实施例2中，未磷酸化的酪蛋白的磷含量是0.0095g(磷/g酪蛋白)，磷酸化后的酪蛋白的含磷量最高可达0.0191g(磷/g酪蛋白)，也就是"i兌增量可以达到约0.0096g(新增磷/g酪蛋白)。酪蛋白中含磷量高，提高了酪蛋白的营养价值。乳化性参数由885.64附2/^提高到960.07m2/g。在实施例3中，未磷酸化的酪蛋白的磷含量是O.0102g(磷/g酪蛋白)，磷酸化后的酪蛋白的含磷量最高可达O.0215g(磷/g酪蛋白)，也就是说增量可以达到约0.0113g(新增磷/g酪蛋白)。酪蛋白中含磷量高，提高了酪蛋白的营养价值。乳化性参数由1164.52W/g提高到1282.28m2/g。因此，磷酸化作用可以提高蛋白质的溶解性和乳化性，磷酸化后的酪蛋白功能性质有所改进，更加适于食品生产。尽管参照实施例对所公开的涉及一种酪蛋白磷酸化的方法进行了特别描述，以上描述的实施例是说明性的而不是限制性的，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，所有的变化和修改都在本发明的范围之内。权利要求1、一种酪蛋白磷酸化的方法，其特征是包括下述步骤(1)制备酪蛋白溶液将干酪素溶解于磷酸盐缓冲液中，在40℃搅拌至完全溶解，之后进行真空抽滤，去掉干酪素中的固体杂质及未溶的蛋白质和脂类，得到酪蛋白溶液；(2)磷酸化调整酪蛋白溶液的pH值为7.0～9.0，之后在上述碱性酪蛋白溶液中加入质量体积百分比浓度为3％～5％的三聚磷酸钠溶液，在30℃～50℃恒温2-4小时进行磷酸化反应，之后冷却到室温；溶液中酪蛋白与三聚磷酸钠的质量比为1∶3～5；(3)纯化调节磷酸化后的酪蛋白溶液的pH值至中性，用真空纤维膜进行透析，收集酪蛋白溶液，再将上述溶液冷冻干燥，得棉花状的白色的磷酸化酪蛋白。2、根据权利要求1所述的酪蛋白磷酸化的方法，其特征是所述磷酸盐緩冲液由磷酸二氢钠和磷酸氢二钠配置而成，所述磷酸盐緩冲液的浓度为0.2mol/L、pH值为7。3、根据权利要求1所述的酪蛋白磷酸化的方法，其特征是步骤(2)中调整酪蛋白溶液的pH值为7.Q~9.0时所用溶液为稀氢氧化钠溶液，步骤(3)所用调节磷酸化后的酪蛋白溶液的pH值至中性所用溶液为稀盐酸溶液。4、根据权利要求1所述的酪蛋白磷酸化的方法，其特征是酪蛋白溶液进行冷冻干燥的温度为-50°C，压强为500-600Pa,时间为24小时，使用钢制托盘进行冷冻干燥。5、根据权利要求1所述的酪蛋白磷酸化的方法，其特征是透析过程中选用6000-8000D的真空纤维膜；每隔两小时换一次水，并用质量体积比浓度为1°/的氯化钡溶液4全验透析溶液中小分子量离子的含量。6、根据权利要求1所述的酪蛋白磷酸化的方法，其特征是干酪素与磷酸盐緩冲液的重量/体积比为1:100~150。全文摘要本发明公开了一种酪蛋白磷酸化的方法，旨在提供一种以三聚磷酸钠为磷酸化试剂，反应条件温和，容易控制，使改性后的酪蛋白的营养价值和各方面性质更适合于食品加工的酪蛋白磷酸化的方法。将干酪素溶解于磷酸盐缓冲液中，在40℃搅拌至完全溶解，真空抽滤，得到酪蛋白溶液；调整酪蛋白溶液的pH值为7.0～9.0，加入3％～5％的三聚磷酸钠溶液，在30℃～50℃恒温进行磷酸化反应，之后冷却到室温；调节磷酸化后酪蛋白溶液的pH值至中性，透析，冷冻干燥，得到磷酸化的酪蛋白。本发明酪蛋白的磷酸化方法采用三聚磷酸钠为磷酸化试剂，不仅保障了食品安全，改善食品蛋白质的功能特性和营养特性，而且，反应条件温和，容易控制。文档编号C07K1/107GK101182347SQ200710150129公开日2008年5月21日申请日期2007年11月9日优先权日2007年11月9日发明者任云霞,鹏康,张坤生申请人:天津商业大学