专利名称：一种氯氟氰菊酯人工抗原及其合成方法
技术领域：
本发明涉及一种氯氟氰菊酯人工抗原及其合成方法，属于有机化学及免疫 化学技术领域。
背景技术：
在免疫化学领域中，为使无免疫原性的小分子物质(常称为半抗原，Hapten) 能在动物体内诱发产生抗体，常要将这种半抗原与某种大分子载体如蛋白质或 多肽等交联结合而成为人工抗原，再注射进动物体内产生抗体，提纯抗体之后， 即可用于免疫分析，它是当前临床医学、食品检测、农药残留分析中最活跃的 领域之一。
拟除虫菊酯是一类重要的杀虫剂，因其具有高效、低毒、击倒快、残留少 特点，被广泛使用于茶园、果园、农田等害虫的防治，其中氯氟氰菊酯是应用 较多的一种，因其使用量逐年增加，己对生态环境产生了一定的影响，联合国 粮农组织和世界卫生组织(FAO/WTO)对其在果树等一些作物上己给出了严格 的残留限量标准(一般为0.01mg/kg)，这使得氯氟氰菊酯残留量的检测监控显得 十分迫切和必要。
目前国际上惯用的氯氟氰菊酯残留的标准分析方法是气相色谱(GC)和高 效液相色谱(HPLC)法。但是这些传统的检测方法需要昂贵的设备、专门的操 作人员、样品处理复杂、成本高、时间长，不能满足快速简便的现场检测要求 和大面积推广使用。而酶联免疫分析方法(ELISA)由于具有特异、敏感、简单、 快速、费用低及样品纯化要求低等优点，在农药残留分析中显示了广阔的应用 前景。
由于氯氟氰菊酯是小分子物质(分子量小于1000)，本身不具有免疫原性，
必须与大分子载体偶联制备人工抗原，才能诱导特异性抗体的产生。为此，必 须设法先将农药小分子与载体蛋白质偶联制备出农药人工抗原。然而氯氟氰菊 酯分子不能直接通过双功能交联剂与蛋白质共价偶联，需要先通过化学反应在 农药分子上引入活性功能团，以此作为半抗原，再使之与蛋白质偶联。因此半 抗原的设计、合成是建立氯氟氰菊酯酶联免疫分析方法的关键所在。
目前，关于氯氟氰菊酯人工抗原的合成国外尚无文献报道，只有国内文献
(农药学学报，2007， 9(4)， 415-418)曾对氯氟氰菊酯的酸和醇部分分别进行 修饰，合成两种半抗原，进而制备其抗体，但是采用该法获得的人工抗原免疫 原性较差。拟除虫菊酯类农药的半抗原的合成常用方法还有通过多步反应在其苯环或环丙垸部分接上一个连接臂，最近几年有人将拟除虫菊酯的氰基水解成 羧酸或水解后再接上比较长的连接臂与蛋白质偶联。但是这些方法反应步骤长， 试剂昂贵，且多为进口试剂，国内很难买到。
发明内容
本发明的目的在于提供一种氯氟氰菊酯人工抗原及其合成方法。
本发明的技术方案 一种氯氟氰菊酯半抗原，化学名称为(x-氰基-3-(4-氨基 苯氧萄节基-3-(2-氯-3,3,3-三氟-l-丙烯基)-2，2-二甲基环丙垸羧酸酯，简写为CY。
一种氯氟氰菊酯人工抗原，用所述的氯氟氰菊酯半抗原与牛血清白蛋白偶 联制得的产品，化学名称为01-氰基-3- (4-氨基苯氧基)苄基-3-(2-氯-3，3，3-三氟 -1-丙烯基)-2,2-二甲基环丙垸羧酸酯-牛血清白蛋白，简写为CY-BSA。
所述氯氟氰菊酯人工抗原的合成方法，以氯氟氰菊酯为原料，依次通过硝 化反应、还原反应，成功合成带有活性基团-NH2的半抗原CY，半抗原CY通过 重氮化法与牛血清白蛋白偶联制得氯氟氰菊酯人工抗原CY-BSA，步骤为
以氯氟氰菊酯为原料，依次通过硝化反应、还原反应，成功合成带有活性基 团-NH2的半抗原CY，合成路线如下
1 )、 a-氰基-3-(4-硝基苯氧基)苄基-3-(2-氯-3，3，3-三氟-l-丙烯基)-2,2-二甲基
环丙烷羧酸酯的合成
向150mL的三口烧瓶中加入18g氯氟氰菊酯，30mL乙酸酐搅拌溶解，滴 加2mL发烟硝酸与10mL乙酸的混合液，滴加完毕，室温继续搅拌反应3.5h;
将反应液倒入冰水中，搅拌，出现大量黄白色粘稠物质，用乙酸乙酯对水 液进行萃取，收集有机相，无水Na2S04干燥过夜，抽滤，减压蒸馏得金黄色粘 稠液体，经过硅胶柱层析脱色纯化得无色透明油状化合物；
2)、半抗原CY的合成
称取上步得到的产物4g，溶于50mL乙醇中，加入9.8g SnCl2 2H20搅拌 得白色的浊液，N2保护反应，70-75"下反应35min;
反应液冷却后，倒入水中，搅拌加入乙酸乙酯，用NaHC03溶液调节pH7，抽滤，蒸馏水、乙酸乙酯依次洗涤滤饼，收集滤液中的有机相，无水Na2S04干 燥，抽滤，减压蒸馏得红褐色的油状物，通过硅胶柱层析脱色纯化得红棕色的 油状化合物即(x-氰基-3-(4-氨基苯氧基)苄基-3-(2-氯-3,3,3-三氟-1-丙烯基)-2,2-二甲基环丙烷羧酸酯，半抗原CY; 3)、人工抗原CY-BSA的制备
按下述化学反应式进行氯氟氰菊酯人工抗原(CY-BSA)的合成
称取上步合成的半抗原CY23.2mg于50mL的烧瓶中，加入4mL DMF溶解， 再加入0.5M的HC1溶液lmL和0.1M的NaN02溶液0.6mL， 4'C下搅袢反应 30min，加入1.8mg尿素，继续搅拌5min，得氯氟氰菊酯半抗原重氮化组分；
称取90mg牛血清白蛋白溶解于20mL0.2M、 pH 8.7的硼酸盐缓冲溶液中， 4。C下将制备的重氮化组分逐滴加入到牛血清白蛋白溶液中，搅拌12h，之后将 偶联液装入透析袋中，fC下，于0.01M、 pH7.5的PBS缓冲溶液中搅拌透析， 每天换3次透析液，共透析4-6天，透析结束后将透析袋中乳状液分装于lmL 的离心管中，于-2(TC冰箱中存放备用，即为氯氟氰菊酯人工抗原01-氰基-3- (4-氨基苯氧基)节基-3-(2-氯-3,3,3-三氟-l-丙烯基)-2，2-二甲基环丙烷羧酸酯-牛血清 白蛋白，人工抗原CY-BSA。
本发明所述的牛血清白蛋白(BSA)还可改用卵清蛋白(OVA)。 本发明的有益效果本发明与现有技术相比具有以下优点 本发明通过对氯氟氰菊酯直接硝化，在苯环上引入硝基，进而用SnCl2 2H20 还原，通过简单的两步反应，制备出苯环上含有活性基团(一NH2)的半抗原 (CY)，避免了使用昂贵试剂；合成的半抗原通过重氮法成功与牛血清白蛋白 (BSA)偶联，经过透析纯化，紫外光谱扫描，证明了人工抗原合成成功。本 方法操作简便，且使用的试剂廉价易得，克服了其它方法繁琐、生产率低等缺 点，为以后筛选出氯氟氰菊酯的特异性抗体和建立免疫分析方法提供基础。
图1半抗原CY 、载体蛋白BSA及人工抗原CY-BSA的UV光谱图。
具体实施例方式
实施例l:氯氟氰菊酯半抗原(CY)的合成
以氯氟氰菊酯为原料，依次通过硝化反应、还原反应，成功合成带有活性
6基团-NH2的半抗原CY，合成步骤如下
1 )、 ct-氰基-3-(4-硝基苯氧基)苄基-3-(2-氯-3,3,3-三氟-l-丙烯基)-2,2-二甲基
环丙垸羧酸酯的合成
向150mL的三口烧瓶中加入18g氯氟氰菊酯，30mL乙酸酐搅拌溶解，滴 加2mL发烟硝酸与10mL乙酸的混合液，滴加完毕，室温继续搅拌反应3.5h;
将反应液倒入冰水中，搅拌，出现大量黄白色粘稠物质，用乙酸乙酯对水 液进行萃取，收集有机相，无水Na2S04干燥过夜，抽滤，减压蒸馏得金黄色粘 稠液体，经过硅胶柱层析脱色纯化得无色透明油状化合物；
2)、半抗原01-氰基-3-(4-氨基苯氧基)苄基-3-(2-氯-3,3，3-三氟-1-丙烯基)-2,2-二甲基环丙烷羧酸酯(CY)的合成
称取上步反应得到的粗产物4g，溶于50mL乙醇中，加入9.8g SnCl2 '21120， 搅拌得白色的浊液，N2保护反应，70-75。C下反应35min;
反应液冷却后，倒入150mLH2O中，搅拌，乳白色浆状，加入200mL乙酸 乙酯，并用10。/。的NaHC03溶液调节pH-7，加入适量的硅藻土，抽滤，蒸馏水、 乙酸乙酯洗涤滤饼，收集滤液中的有机相，无水Na2S04干燥2h，抽滤，减压蒸 馏除去溶剂得红褐色的油状物，通过硅胶柱层析脱色纯化得红棕色的油状物；
分析数据IR(KBr)v: 3441， 1616， 1508， 1454， 1400， 1163， 785cm"; iH-NMR (500MHz， DMSO): 5ppm 7.40 (m, 1H)， 7.19 (t, J = 7.84， 7.84 Hz, 1H), 7.06 (s， 1H), 7.00 (s, 1H)， 6.95 (t, J = 7.99， 7.99 Hz, 1H)， 6,87 (dd, J = 16.35, 8.33 Hz: 1H), 6.81 (m， 1H)， 6.68 (s， 1H), 6.63 (s, 1H), 6.59 (d， J = 8.62 Hz, 1H)， 5.06 (s, 1H), 4.01 (d, J = 7.09 Hz, 1H), 2.32 (m, 1H)， 1.97 (s， 1H)， 1.26 (m, 3H)， 1.16 (d， J = 9.98 Hz，3H); MS(m/z): 487.1(M+Na+)， 464(W);元素分析C23H2qC1F3N203 %:实 测值(理论值)C 59.36(59.43)， H 4.39(4.34)， N6.12(6.03)。
实施例2:氯氟氰菊酯人工抗原(CY-BSA)的合成
称取上步合成的半抗原CY23.2mg于50mL的烧瓶中，加入4mL DMF溶解， 再加入0.5M的HC1溶液lmL和0.1M的NaN02溶液0.6mL， 4"C下搅拌反应 30min，加入1.8mg尿素，继续搅拌5min，得氯氟氰菊酯半抗原重氮化组分；
称取90mg牛血清白蛋白(BSA)溶解于20mL 0.2M的硼酸盐缓冲溶液 (pH=8.7)中，4'C下将制备的重氮化组分逐滴加入到蛋白质溶液中，搅拌12h， 之后将偶联液装入透析袋中，4匸下，于0.01M的PBS缓冲溶液(pH=7.5)中 搅拌透析，每天换3次透析液，共透析4-6天，透析结束后将透析袋中乳状液分 装于lmL的离心管中，于-20'C冰箱中存放备用。
人工抗原的鉴定人工抗原的鉴定采用紫外光谱法，将半抗原CY，载体蛋 白BSA，偶联物CY-BSA对应的不同浓度的紫外光谱图做对照(图l)，偶联后 的紫外光谱曲线有变化；从光谱数据分析蛋白的吸收峰由278nm移动至355nm， 可以证明半抗原已经和载体蛋白偶联。
本发明所述的牛血清白蛋白(BSA)可改换采用卵清蛋白(OVA)。
权利要求
1、一种氯氟氰菊酯半抗原，其特征在于化学名称为α-氰基-3-(4-氨基苯氧基)苄基-3-(2-氯-3，3，3-三氟-1-丙烯基)-2，2-二甲基环丙烷羧酸酯，简写为CY。
2、 一种氯氟氰菊酯人工抗原，其特征在于用权利要求1所述的氯氟氰菊酯半抗原与牛血清白蛋白偶联制得的产品，化学名称为(x-氰基-3- (4-氨基苯氧基)苄基-3-(2-氯-3,3,3-三氟-l-丙烯基)-2，2-二甲基环丙垸羧酸酯-牛血清白蛋白，简写为CY-BSA。
3、 一种权利要求2所述氯氟氰菊酯人工抗原的合成方法，其特征是以氯氟氰菊酯为原料，依次通过硝化反应、还原反应，成功合成带有活性基团-NH2的半抗原CY，半抗原CY通过重氮化法与牛血清白蛋白偶联制得氯氟氰菊酯人工抗原CY-BSA，步骤为1) 、 a-氰基-3-(4-硝基苯氧基)苄基-3-(2-氯-3,3,3-三氟-l-丙烯基)-2,2-二甲基环丙烷羧酸酯的合成向150mL的三口烧瓶中加入18g氯氟氰菊酯，30mL乙酸酐搅拌溶解，滴加2mL发烟硝酸与10mL乙酸的混合液，滴加完毕，室温继续搅拌反应3.5h;将反应液倒入冰水中，搅拌，出现大量黄白色粘稠物质，用乙酸乙酯对水液进行萃取，收集有机相，无水Na2S04干燥过夜，抽滤，减压蒸馏得金黄色粘稠液体，经过硅胶柱层析脱色纯化得无色透明油状化合物；2) 、半抗原CY的合成称取上步得到的产物4g，溶于50mL乙醇中，加入9.8g SnCl2 2H20搅拌得白色的浊液，N2保护反应，70-75'C下反应35min;反应液冷却后，倒入水中，搅拌加入乙酸乙酯，用NaHC03溶液调节pH7，抽滤，蒸馏水、乙酸乙酯依次洗涤滤饼，收集滤液中的有机相，无水Na2S04干燥，抽滤，减压蒸馏得红褐色的油状物，通过硅胶柱层析脱色纯化得红棕色的油状化合物；即a-氰基-3-(4-氨基苯氧基)苄基-3-(2-氯-3,3,3-三氟-1-丙烯基)-2，2-二甲基环丙垸羧酸酯，半抗原CY;3) 、人工抗原CY-BSA的制备称取上步合成的半抗原CY 23.2mg于50mL的烧瓶中，加入4mL DMF溶解，再加入0.5M的HC1溶液lmL和0.1M的NaN02溶液0.6mL， 4'C下搅拌反应30min，加入1.8mg尿素，继续搅拌5min，得氯氟氰菊酯半抗原重氮化组分；称取卯mg牛血清白蛋白溶解于20mL0.2M、 pH 8.7的硼酸盐缓冲溶液中，4'C下将制备的重氮化组分逐滴加入到牛血清白蛋白溶液中，搅拌12h，之后将偶联液装入透析袋中，4'C下，于0.01M、 pH7.5的PBS缓冲溶液中搅拌透析，每天换3次透析液，共透析4-6天，透析结束后将透析袋中乳状液分装于lmL 的离心管中，于-2(TC冰箱中存放备用，即为氯氟氰菊酯人工抗原01-氰基-3- (4-氨基苯氧基)苄基-3-(2-氯-3,3，3-三氟-l-丙烯基)-2，2-二甲基环丙垸羧酸酯-牛血清 白蛋白，人工抗原CY-BSA。
4、根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于所述的牛血清白蛋白可改 用卵清蛋白。
全文摘要
一种氯氟氰菊酯人工抗原及其合成方法，属于有机化学及免疫化学技术领域。氯氟氰菊酯的化学名为α-氰基-3-苯氧基苄基-3-(2-氯-3，3，3-三氟-1-丙烯基)-2，2-二甲基环丙烷羧酸酯，属于拟除虫菊酯类农药杀虫剂。本发明以氯氟氰菊酯为原料，依次通过硝化反应、还原反应，成功合成带有活性基团-NH<sub>2</sub>的半抗原CY，半抗原CY通过重氮法成功与牛血清白蛋白(BSA)偶联，获得氯氟氰菊酯人工抗原CY-BSA，为以后筛选出它的特异性抗体和建立免疫分析方法提供基础。
文档编号C07K14/765GK101519364SQ200910029609
公开日2009年9月2日 申请日期2009年3月28日 优先权日2009年3月28日
发明者林建国, 桑光明, 罗世能, 霈 邹, 陈传青 申请人:江苏省原子医学研究所