专利名称：一种大豆hkt类蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程领域。具体涉及与耐盐性相关的高亲和性钾离子转 运蛋白(high-affinity K transporter, HKT)及其编码基因与应用，并涉及来 源于大豆的与耐盐性相关的服T类蛋白GmSKCl及其编码基因与其在培育耐盐植 物品种中的应用。
背景技术：
土壤的盐渍化和次生盐渍化是影响农业生产和生态环境的重要因素之一。全 世界至少有20%的耕地盐渍化，特别是在干旱和半干旱地区，土壤次生盐渍化日 趋严重。我国约有盐渍化和和次生盐渍化土地4千万hm2以上，成为制约农业发 展的主要环境因素。选育耐盐品种是缓解土壤盐渍化对农业生产影响的有效途径 之一。因此，提高农作物的耐盐能力，对于扩大可耕地面积和改善农业生产均具 有重要的现实意义。目前，应用基因工程技术进行育种已经成为提高作物耐盐性 的重要方法之一。高等植物在应答环境中的高盐条件下的逆境胁迫时，HKT (high-affinity K transporter)类蛋白在提高植物本身的耐盐能力方面起着 重要作用。服T类蛋白是广泛存在于植物、酵母、细菌以及真菌中的一个超级蛋 白家族。HKT类蛋白既作为高亲和K+转运载体，也是一种Na+转运体，也可能有 双重功能但选择性不同。越来越多的结果表明在盐胁迫条件下，限制Na+吸收、 增加Na+外排，同时保证K+的吸收，维持细胞质低Na7K+比是植物耐盐性的关键。 在小麦中首次发现了 HKT类蛋白，植物中该类蛋白的功能研究尚少。
大豆是我国五大作物之一，弄清其耐盐分子机理，进而为提高其耐盐性提供 基础，具有重要的理论及现实意义。
发明内容
技术问题
本发明的目的是提供一种大豆HKT类蛋白及其编码基因与应用。 技术方案
本发明所提供的大豆HKT类蛋白，名称为GmSKCl，来源于大豆属大豆 (W/c^e历ax ( L.))，是具有序列表中的SEQ ID NO. 2所述氨基酸序列的蛋 白质。
3上述的大豆HKT类蛋白的编码基因，其cDNA基因具有序列表中fia5J67基因 SEQ ID NO. 1的DNA序列；其中，序列表中的fimST67基因SEQ ID NO. 1由1260 个脱氧核苷酸组成，本序列为^^AT7基因的读码框，编码具有序列表中SEQ ID NO. 2的氨基酸残基序列的蛋白质。
含有本发明fiTASXa基因SEQ ID NO. 1的表达载体是指pMDC83-fi7ASX"植物 过量表达载体，宿主菌是指将^57T"基因转入的根癌农杆菌菌株EHA105。
扩增fiaSK7基因的引物是， GraSKCl ORF sense: 5ATGGGTTTAGTTTTTCTCC-3，， GmSKCl ORF antisense: 5TTACATCATGACAACGAAG-3，。
上述大豆HKT类蛋白GmSKCl蛋白及其编码基因6k5Ja基因可在培育耐盐性 植物中得到应用。
有益效果
6kSK7的表达受高盐的诱导，在150mMNaCl的胁迫下，ft^AT7在大豆的根 及叶片等组织中受到强烈诱导，在茎中的表达量呈现基本不变的趋势。导入过量 表达&ASAT7的烟草与未转基因烟草相比，其耐盐性显著提高，说明fi^AT7基因 对提高植物的耐盐能力方面起着重要作用。
本发明的fi^AT7对培育耐盐植物品种特别是耐盐大豆，提高农作物特别是 大豆的产量具有重要意义。
利用植物表达载体，将本发明的GmSKCl的编码基因导入植物细胞，可获得 对高盐胁迫耐受力增强的转基因细胞系及转基因植株。
使用fi^Ar7构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种 增强型启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛 选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的选择性标记基因
(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、 卡那霉素标记物等)。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因， 直接以逆境筛选转化植株。
携带有本发明fiaS^67的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病 毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植 物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是水 稻、小麦、玉米等单子叶植物，也可以是大豆、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜 蓿等双子叶植物。
下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。
图1为^aST67在高盐胁迫下的表达特性图
图2为含有fia5^67的植物表达载体的部分结构示意图 大豆GwS《C7，在大肠杆菌中，抗卡那霉素和潮霉素。农杆菌是EHA105。
图3为转基因植株Linel6、 Line27、 Line31和野生型植株在OmM和200mM 的NaCL胁迫下，野生型烟草(WT)与转基因株系等的株高、根长及鲜重等性状的考 察(*,尸《0. 05; **，尸《 0. 01)。
具体实施例方式
下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。 实施例1、大豆GmSKCl及其编码基因的cDNA克隆与鉴定 以大豆耐盐品种Lee68 (公知公用，Abel & MacKenzie， 1964， fr叩Scie/7ce 14， 157 - 161)为材料，通过生物信息学的方法，以已报道的水稻HKT蛋白序歹J(0s服T8， 登陆号BAB93392)为种子序列，搜索大豆的EST数据库，找到一条高度同源的EST 片段，基因命名为^ 57K7。以大豆嫩叶的cDNA为模板进行PC財广增，结果扩增出 与预期大小一致的条带，随后进行PCR产物的割胶纯化、连接及转化工作，挑取 阳性克隆测序。测序结果显示已经克隆到大豆fi^5Z67基因的部分序列，发现其5' 端和3'端均不完整。进行了3'端的延伸，并进行克隆测序，序列分析后发现3'端 序列获得完整。利用已经部分公布的大豆WGS序列，搜索大豆WGS数据库，结果5' 端得到了延伸，并设计特异引物分别从大豆基因组及大豆嫩叶的cDNA中进行克隆 验证。拼接后发现大豆6kS"AT7基因的ORF全长为1260bp，编码419个氨基酸。
根据fizA^T7基因序列设计引物 GmSKCl ORF sense: 5ATGGGTTTAGTTTTTCTCC-3'，
GmSKCl ORF antisense: 5TTACATCATGACAACGMG-3，应用RT-PCR方法，从大 豆总RNA中扩增6k5^a基因。取大豆耐盐品种Lee68叶片，置于液氮中研碎， 悬于4mol/L硫氢酸胍中，并用酸性苯酚、氯仿抽提，向上清中加入无水乙醇进 行沉淀，最后将沉淀溶于水中得到总RNA。取5Pg总RNA用反转录试剂盒(Promega 公司)按试剂盒的方法进行反转录，以得到的cDNA片段为模板进行PCR扩增反 应。20|il PCR反应体系为lpl—链cDNA (0.05wg) 、 引物(20(aM)、 2|il IOXPCR缓冲液、0. 4(il dNTP(10函)和1U Taq DNA聚合酶，用超纯水补足 20nl。反应在Bio-RAD PTC200型PCR仪上进行，其程序为94°C变性5min;再 94°C lmin， 56°C lmin， 72°C 1. 5min,共32个循环；然后72°C延伸10 min; 4°C
5保存。PCR产物经回收后序列分析，结果表明该PCR产物具有序列表中SEQ ID NO. 1
的核苷酸序列。
实施例2、大豆ft^vK7基因在高盐胁迫下的表达特征
对大豆耐盐品种Lee68进行NaCl胁迫处理用于分析大豆fmSK7在盐胁迫下的 表达情况。为了进行RT-PCR分析ftaSvK7在盐胁迫下的表达变化趋势，采用水培 (Hoagland营养液)的方式种植大豆品种Lee68，待植株的第一簇复叶长出后， 使用包含150mMNaCI的Hoagland营养液进行胁迫处理，取盐处理后0h、 6h、 12h、 24h、 36h及48h等6个时期的根、茎及叶，液氮速冻后-8(TC保存备用。
总RNA的提取同实施例一。以大豆组成型表达的AO'/ 基因(GenBank accession No. V00450)为内部参照，以来自大豆不同组织及盐诱导不同时间段的 不同组织的总RNA为模板，进行RT-PCR分析。RT-PCR分析表明(图1)，在150mM NaCI胁迫下，^5K7在根和叶等组织中的表达量均受到强烈诱导，而其在茎中 的表达量基本不变。根中的表达量在盐处理12小时后有一个明显的上调，叶中 的表达量在盐处理24小时后有一个明显的上调。
实施例3、 fta57Ta编码蛋白的功能鉴定
利用Invitrogen公司的Gateway⑧Technology with Clonase II试剂盒， 将ftaSK7正向插入到表达载体pMDC83 (Sokolov et al， 2005， PNAS， 103:9732-9737)(图2)中，得到pMDC83-ft^AT7植物过量表达载体，用冻融法 将pMDC83-fto5JK7转入根癌农杆菌菌株EHA105 (Avsian-Kretchmer et al, 2004, Plant Physiology, 135:1685-1696)中。pMDC83-fia5"AT7通过农杆菌EHA105的介 导转化烟草，PCR检测结果表明获得62株阳性植株，结合RT-PCR分析结果选择了3 个阳性转基因株系(Linel6、 Line27、 Line31)，将Linel6、 Line27和Line31的 种子种入MS培养基，待野生型烟草(WT)以及L代转基因株系(Linel6、 Line27、 Line31)萌发生长成小苗后(约15天)，将它们转入含0mM NaCl和200mM NaCl的 1/2MS基本培养基中进行盐处理(约12天)，结果表明在200raM的NaCL胁迫下，野 生型烟草(WT)基本上全部萎黄，长势极差，而在同样条件下的三个转基因株系 (Linel6、 Line26和Line31)的T1代植株长势良好；在0mM NaCl和200mM NaCl胁 迫下，分析了野生型烟草(WT)与转基因株系等的株高、根长及植株鲜重等性状， 转基因株系生长良好，在株高、根长和鲜重等方面与野生型烟草相比均达显著或 极显著水平如图3。说明过量表达6k^K7基因能提高转基因烟草的耐盐能力。
6<110>南京农业大学
〈120> —种大豆HKT类蛋白及其编码基因与应用
〈130〉 说明书
<160〉 4
<170〉 Patentln version 3. 1
<210> 1
<211> 1260
〈212〉 DNA
<213> 大豆属大豆(Glycine max L.) <220>
<221> GmSKCl基因读码框(0KF)
<222〉 (1)..(1260)
〈223〉
<400> 1
atgggtnagtttttctcctccttttgcataatctaggccacatgcsgcgaattattgtg60
ctat'ataaatggctcccatttccacacacaCC3tggg3gtacttctattt120
gtacttg犯ttaaatacaatgstgaagsgtacactctcgtacttttcacgcagccttcga180
ttcttggctggtttgatagccttccatttccactccttttttgttatttg240
atgatcctttctctggttggttacttgggtcttaaggtttcaatigcca^ggaaccctgtt300
aggctc肌tg￡lCttgg￡LCCtcttttacacctccgtttctgcttccacagcttctagcatg360
gtagccgttget组ggaggttttctccaattctcaactcattctcttcacccttctcatg420
Utcttggcgggg卿ttttcacttccatgctcgaccttctaitttgctggttataaatta480
ttagcatcaatccttttccaatgcaa^tcaaatagagctt540
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gtttttgatctctcctccatctcttcagcctcttcgttgt1260
<210> 2
<211> 419
<212> PRT
<213> 大豆属大豆(Glycine隨L.) <220〉
<221〉 GmSKCl蛋白序列
〈222〉 (1)..(419) 〈223〉
7<400〉 2 Met Gly Leu 1
Arg lie
His Thr
Lys Ser
50 Leu lie 65
Met lie
Arg Asn
Ser Ala
Ser Asn 130 Glu Val 145
Gin Asn
Gin lie
Asn Asn
Arg Leu 210 Tyr Leu 225
Met Thr
Lys lie
Cys Gly
Ser Gly 290 Leu Tyr 305
Thr Lys
Gly Tyr
Thr Val
Glu Trp 370 Val Ala 385
lie
Met
35
Thr
Ala
Leu
Pro
Ser 115 Ser
Phe
Lys
Glu
Asn 195 Lys
Val
Leu
Val
Phe 275 Leu
Pro
Lys
Glu
Leu 355 Lys
Ser
Val
Val
20
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Leu
Phe
Ser
Val 100 Thr
Gin
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Val
Leu 180 Pro
Tyr
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Val
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Leu
Pro
Glu
His 340 Gly
Thr
Leu
Phe 5
Leu
Val
Ser
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Leu
85
Arg
Ala
Leu
Ser
Ser 165 Gly
Cys
Asn
Val
Pro 245 Phe
Pro
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Cys
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Phe
Lys
Phe
Leu
Tyr
Leu
Tyr
Phe
70
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Leu
Ser
lie
Met 150 lie
Leu
Asp
Cys
Gin 230 Ser
Ser
Thr
Leu
Leu 310 Phe
Leu
Asn
lie
Gin 390
Leu
Lys
Leu
Phe
55
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Gly
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Ser
Leu 135 Leu
Asn
Val
Ser
Leu 215 Phe
Ala
Leu
Asn
lie 295 Arg
Ser
Ser
Leu
Met 375 Val
Leu
Trp
Phe
40
Ser
Ser
Tyr
Asp
Met 120 Phe
Asp
Pro
Leu
Asn 200 Ser
Val
Arg
Phe
Glu 280 Leu
Leu
Tyr
Asp
lie 360 Glu
Thr
Leu
Leu
25
Val
Arg
Phe
Leu
Leu 105 Val
Thr
Leu
Phe
Ser 185 lie
Tyr
Gly
Gin
Thr 265 Asn
Pro
Leu
Leu
Leu 345 Gin
Gly
Asn
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10
Pro
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Ser
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Gly
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Val 250 Val
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His
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Leu 330 Arg
Phe
Leu
Ala
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Phe
Glu
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75
Leu
Leu
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Leu
Phe 155 Pro
Pro
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Thr
Ser 235 Leu
Val
Leu
Val
Met 315 Lys
Cys
Val
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Arg 395
Leu
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Leu
Arg
60
Gin
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Phe
Glu
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Phe 300 Val
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Cys
Met
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Gly
Gly
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Gly
Asn
Ser
Ala 205 Ala
Val
Asn
Thr
Phe 285 Leu
Leu
Ser
Phe
Leu 365 Tyr
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Leu
30
Thr
Leu
Cys
Ser
Thr 110 Glu
Leu
Tyr
His
Asp 190
Ser
Val
Ser
Lys
Phe 270 Lys
Gly
Lys
lie
Leu 350 Cys
Glu
Gly
Met Gin 15
Ser Thr
Met Met
Ala Gly
Tyr Leu
80 Lys Pro 95
Ser Val
Val Phe
Gly Gly
Lys Leu 160 Ala Asn 175
Ser Glu
Cys Asp
Leu Gly
Leu Tyr 240 Gly lie 255
Ala Ser
Lys Asn
Asn Ala
Lys Val 320 Asp Val 335
Val Ala
Ser Leu
Lys Val
Glu Ser 400
8Val Phe Asp Leu Ser Ser lie Ser Ser Ala lie Leu Val Leu Phe Val 405 410 415
Val Met Met
〈210〉 〈211> <212> <213〉
<220> <221> <222> <223>
3
19
DNA
人工合成
GmSKCl ORF sense (l).. (19)
〈400> 3
atgggtttsg tttttctcc 19
<210> 〈211〉 <212> <213>
<220> <221> <222> <223>
4
19
DNA
人工合成
GmSKCl ORF antisense (l).. (19)
<400〉 4
ttacatcatg acaacgaag 19
9
权利要求
1、一种大豆高亲和性钾离子转运HKT类蛋白，命名为GmSKC1蛋白，是具有序列表中的SEQ ID NO.2所述氨基酸序列的蛋白质。
2、 权利要求1所述的大豆HKT类蛋白的编码基因。
3、 根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述大豆HKT类蛋白的 cDNA基因，具有序列表中ftaS"vK7基因SEQ ID NO. 1的DNA序列。
4、 含有权利要求2或3所述基因的表达载体。
5、 根据权利要求4所述的表达载体，是指pMDC83-^AaK7植物过量表达载体。
6、 含有权利要求2或3所述基因的宿主菌。
7、 根据权利要求5所述的宿主菌，是指将^A5JC7基因转入的根癌农杆菌菌 株EHA105。
8、 扩增权利要求2或3所述基因的引物，其特征是， GmSKCl ORF sense: 5ATGGGTTTAGTTTTTCTCC-3，， GmSKCl ORF antisense: 5TTACATCATGACAACGAAG-3'。
9、 权利要求1所述的大豆HKT类蛋白在培育耐盐性植物中的应用。
10、 权利要求2或3所述的大豆HKT类蛋白编码基因在培育耐盐性植物中的 应用。
全文摘要
本发明公开了一种大豆HKT类蛋白及其编码基因与应用，属于生物技术领域。该大豆HKT类蛋白，命名为GmSKC1蛋白，是具有序列表中的SEQ ID NO.2所述氨基酸序列的蛋白质。其编码基因为GmSKC1基因SEQ ID NO.1的DNA序列。本发明大豆HKT类蛋白及其编码基因可用于培育耐盐植物品种特别是耐盐大豆品种。GmSKC1的表达受高盐的诱导，在150mM NaCl的胁迫下，GmSKC1在大豆的根及叶片等组织中受到强烈诱导，在茎中的表达量呈现基本不变的趋势。过量表达GmSKC1的烟草与未转基因烟草相比，其耐盐性显著提高，说明GmSKC1基因对提高植物的耐盐能力方面起着重要作用。
文档编号C07K14/415GK101456909SQ200910029120
公开日2009年6月17日 申请日期2009年1月13日 优先权日2009年1月13日
发明者喻德跃, 陈华涛 申请人:南京农业大学