专利名称：抗兔出血症病毒vp60蛋白单克隆抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗兔出血症病毒(RHDV) VP60蛋白单克隆抗体，属于生物技术领域，涉 及抗体工程技术，具体为抗兔出血症病毒(RHDV) VP60蛋白单克隆抗体。
背景技术：
兔出血症(RHD)，又称兔瘟，是由兔出血症病毒(RHDV)引起的一种以急性、高度 传染性、大面积死亡为特征的兔传染病，感染兔通常48 72 h死亡，主要特征为传染性 极强、呼吸系统出血、肝坏死、脏器水肿、淤血和出血等变化，给全世界养兔业造成了 巨大的经济损失。国际兽医局将该病列为B类传染病，我国农业部96号令颁布为二类疫 病。
朋DV属杯状病毒，病毒粒子呈球型，为二十面体对称，无囊膜。病毒含有一条单股 正链RNA，由7437个核苷酸组成，与一般的杯状病毒不同，RHDV只有2个开放阅读框架 (ORF) ， ORFI位于基因组5'端，从核苷酸10延伸至核苷酸7041，约占整个基因组的94%。 朋DV的ORFI基因序列为NH2-P16-P23-2C解旋酶-P30-VPg-3C样蛋白酶-3D聚合酶-衣 壳蛋白-COOH。衣壳蛋白是RHDV唯一的结构蛋白，称为VP60，其基因片段长度为1 740 bp， 共编码580个氨基酸，与诱导抗病毒感染的免疫反应直接相关。用纯化的RHDV病毒作为 免疫原制备单克隆抗体的效价通常偏低，不利于RHDV单克隆抗体的应用。利用杆状病毒 表达系统表达的RHDV VP60重组蛋白制备的单克隆抗体可为VP60蛋白研究和RHDV免疫 学方法建立提供必要的试剂和技术手段，对探索VP60蛋白的生物学功能区域和建立RHDV 特异、敏感的检测方法等具有重要意义。
发明内容
技术问题 本发明的目的是提供抗兔出血症病毒VP60蛋白单克隆抗体。本发明 的单克隆抗体是用杆状病毒表达系统表达的重组VP60蛋白为抗原，免疫BALB/c小鼠， 利用杂交瘤技术制备获得的，能特异识别RHDV衣壳蛋白。兔出血症病毒重组VP60蛋白 是将RHDV VP60基因克隆于杆状病毒表达系统的穿梭载体并通过转染在昆虫细胞中表达 的蛋白。
技术方案
一种抗兔出血症病毒RHDV衣壳蛋白VP60单克隆抗体，其特征在于该单克隆 抗体是杂交瘤细胞株A3C产生的，杂交瘤细胞株A3C于2009年3月24日宝藏于中国 典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC一C200921。制备方法包括
1) RHDV重组VP60蛋白的制备根据RHDV VP60序列设计一对引物，用RT-PCR方 法扩增RHDV衣壳蛋白VP60基因，通过克隆、转化得到重组穿梭载体Bacmid-VP60，用此质粒转染Sf9昆虫细胞，得到重组病毒rAcV-Bac-VP60，用此重组病毒感染Sf9昆虫 细胞，经免疫荧光法、Western-blotting、血凝实验鉴定重组VP60蛋白表达，获得免疫 用重组VP60蛋白；2) 小鼠免疫用血凝效价为13 kg 2的RHDV重组VP60蛋白免疫6 8周龄的雌性 BALB/c小鼠，免疫程序为皮下注射弗氏完全佐剂乳化的抗原200iiL/只，2周后皮下 注射弗氏不完全佐剂乳化的等量抗原，间隔2周后，再皮下注射弗氏不完全佐剂乳化的 等量抗原，融合前3天腹腔注射等量不加佐剂的抗原加强免疫；3) 细胞融合取SP2/0骨髓瘤细胞与免疫的BALB/c小鼠脾细胞按l : 5 1 : 10的比例混合于50 mL离心管中，充分混匀，l,OOOrpm离心10min，弃上清，用手掌轻击管底，使细胞松散 均匀，置40。C水浴预热，用lmL吸管在45s内加完预热至4(TC的50。/。PEG-4000 1mL，边 加边轻轻振荡，然后在90s内加入30mL预热至37'C的DMEM不完全培养基，室温静置 10min， 1,000rpm离心10min，弃上清，加入20mL含20^FCS和HAT的DMEM培养基重悬。 分装到已有饲养细胞的96孔板上，于5。/。C02培养箱培养，7d后，观察细胞的生长状况， 用含有20Q/。FCS和HT的DMEM培养基换出l/2培养基；14d后，改用含20。/。FCS和HT的 DMEM培养基培养，当融合的细胞生长至96孔板孔底面积的l/5时，取上清进行抗体检测；4) 杂交瘤筛选用包被液为0. 05 mol/L pH 9. 6碳酸盐缓冲液对起始血凝效价为13 bg 2的兔出血 症肝病料上清液和杆状病毒表达系统表达的血凝效价为13 log 2VP60蛋白进行倍比稀释， 用稀释至l: 27的液体包被ELISA板，100yL/孔，置4。C包被过夜；PBST洗涤3次，每 次5min，最后一次拍干；以2%明胶封闭每孔，200uL/孔，37'C放置2h; PBST洗漆3 次，每次5min，最后一次拍干；将细胞上清、1 : IOO稀释的阳性参考血清和1 : 100稀 释的阴性参考血清，加入相应孔内，100uL/孔，37。C作用90 min; PBST洗涤3次，每 次5min，最后一次拍干；加入1 : 2000稀释的酶标羊抗鼠IgG， 100uL/孔，37'C放置 60min; PBST洗涤5次，每次5min，最后一次拍干；加入底物TMB- H202， 100uL/孔， 室温避光显色10min;每孔加入50uL 2 mol/L硫酸终止反应；经酶标仪测定0D450nm 值以空白对照调零，P为各检测孔的值，N为阴性参考血清的0D45。值，当阴性参考血清 的OD柳值^0.1，阳性参考血清的OD柳值与阴性参考血清的OD45o值的比值^2.1，即阴、 阳性对照成立的前提下，P/N^2.1的检测孔判为阳性，1. 5《P/N<2.1的检测孔判为可 疑，P/N<1. 5的检测孔判为阴性；5) 有限稀释法对杂交瘤细胞亚克隆首先将阳性孔活细胞用台盼兰进行染色和计数，用DMEM完全培养基稀释成100 个细胞/15mL培养基，将稀释的细胞悬液加入96孔细胞培养板，每孔0.15mL， 37'C， 5 。/。C02培养箱中培养，4 5d后，显微镜下可观察到克隆细胞的形成，记录下只有单个 克隆生长孔，8 9d时取细胞上清，及时进行ELISA检测；选择阳性的单克隆细胞再进 行同样的亚克隆3次以上，直至亚克隆后所有细胞孔上清检测均为阳性、且各孔检测OD 值较接近；将多次亚克隆培养后的阳性孔细胞扩大培养，并冻存，获得稳定分泌抗RHDV VP60蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株A3C;6)抗RHDVVP60蛋白单克隆抗体的制备将石蜡油注射成年BALB/c小鼠，0. 5 mL /只，致敏7天后，将阳性杂交瘤细胞株 A3C用0.01MPBS稀释后注入小鼠腹腔，每只小鼠注射5xlC^ lxl(^个细胞，0.2mL， 5 IO天后采取腹部明显鼓起小鼠的腹水，11000g，离心5min，收集上清，小量分装，-70 'C保存。有益效果本发明的特点和优点如下1、 本发明提供的RHDV重组蛋白VP60抗原制备方法简便可行；2、 本发明提供的抗RHDV衣壳蛋白VP60的单克隆抗体特异性强，制备方法简单；3、 本发明提供的特异性单克隆抗体可用于VP60蛋白的研究和RHDV免疫学检测方 法的建立。4、 获得稳定分泌抗RHDVVP60蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株A3C，测得A3C腹 水ELISA效价为1:327600，经鉴定该单克隆抗体既可与表达的重组VP60蛋白特异性结 合，又可与RHDV特异性结合，均出现单一一条反应条带，证明抗RHDVVP60蛋白单 克隆抗体是RHDV衣壳蛋白VP60特异性抗体。
图1重组转移载体的酶切鉴定，图中l是限制性内切酶(Sal I/Xho I酶切)消化 重组转移载体，2是DNA分子量标准(DL-2 000) ， 3是DNA分子量标准(DL-15 000)。图2重组Bacmid的PCR鉴定，图中1是DNA分子量标准(DL-15 000) ， 2是DNA分 子量标准(DL-2 000)， 3是用pUC/M13上、下游引物对重组Bacmid PCR鉴定，4是用 pUC/M13上游引物与特异性VP60基因下游引物对重组BacmidPCR鉴定，5是用pUC/M13 上、下游引物对Bacmid PCR鉴定。图3表达蛋白的免疫荧光鉴定，在感染重组病毒的细胞内有强烈的荧光反应。杂交瘤细胞株A3C，于2009年3月24日宝藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC， 地址武汉武汉大学邮编430072,保藏编号为CCTCC—C200921。
具体实施方式
6(一)表达重组VP60蛋白表达载体的构建参照GenBank中中国吉林株RHDV基因组序列(AY523410),利用Primer 5. 0软件自 行设计一对引物。上游引物P1: 5， -ATA GTCGAC ATG GAG GGC AAA G-3';下游引物P2: 5， -GCC TCG AGT CAG ACA TAA GM MG CCA-3，。在上游引物的5'端加入Sal I酶切 位点，下游引物的5'端引入Xho I酶切位点。用RT-PCR方法扩增RHDV衣壳蛋白VP60 基因(王芳等，兔出血症病毒衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达及对家兔的免疫保护效果， 畜牧兽医学报，2008，39(10)，1382~1387),经酶切消化后连接到供体质粒pFastBac l (购 买于Invitrogen公司)上，转化DH5a感受态细胞，提取质粒用Sal I和Xho I酶切，经 鉴定得到重组转移载体pFastBaC l-VP60(王芳等，兔出血症病毒衣壳蛋白在昆虫细胞中 的表达及对家兔的免疫保护效果，畜牧兽医学报，2008,39(10)，1382~1387)(图2)，然 后用此质粒转化含有穿梭载体Bacmid(购买于Invitrogen公司)的E. coli DHlOBac(购 买于Invitrogen公司)感受态细胞，提取质粒，以通用pUCM13上游引物(购买于 Invitrogen公司)和特异性VP60下游引物进行PCR鉴定。同时设立未插入外源基因片 段的DH10Bacmid质粒(购买于Invitrogen公司)对照组，以pUCM13上、下游引物(购 买于Invitrogen公司)进行PCR鉴定。经筛选得到重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-VP60 (王芳等，兔出血症病毒衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达及对家兔的免疫保护效果，畜牧兽 医学报，2008,39(10)，1382~1387)(图3)。(二)重组VP60蛋白的表达1、 昆虫细胞转染以Lipofectamin 2000为共转染试剂，用重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-VP60(王芳 等，兔出血症病毒衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达及对家兔的免疫保护效果，畜牧兽医学 报，2008, 39 (10),1382~1387)转染Sf9 (购买于Invitrogen公司)单层细胞。转染后每 12h观察一次，直到细胞病变明显时，收集细胞及上清液，作为重组杆状病毒原液4'C保 存。将含目的基因VP60的重组杆状病毒命名为rAcV-Bac-VP60(王芳等，兔出血症病毒 衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达及对家兔的免疫保护效果，畜牧兽医学报，2008， 39 (10),1382~1387)。2、 间接免疫荧光检测(IFA)鉴定用此重组病毒感染于24孔细胞培养板上培养的对数生长期Sf9昆虫细胞，培养至发 生病变时，用间接免疫荧光法(IFA)检测重组蛋白的表达，结果显示，重组杆状病毒感 染的Sf9细胞具有很强的特异性荧光(图4)，说明VP60蛋白得到表达。3、 Western-blotting鉴定将重组病毒以W的体积比感染Sf9细胞，96h后收集病变细胞及培养液，分装于1. 5m L离心管中，3000rpm/min，离心5 min，培养上清保留，细胞用PBS重悬细胞洗涤2次 后，溶于500 uLPBS，反复冻融3次后，超声裂解，3000rpm/min，离心5 min，取上 清，加入上样缓冲液，煮沸5分钟，11000g，离心lmin，取上清20 pL进行蛋白质电泳(SDS-PAGE)，同时以感染野生Bacmid的Sf9细胞裂解产物和Sf9细胞裂解产物作 为对照样品。采用半干转印法，取下凝胶，0.65 mA/cm2，转印1.5h后，将其转印于硝 酸纤维膜(NC膜)上，应用RHDV高免血清按常规方法进行Western-blotting反应，电泳 和转印结果显示VP60基因在昆虫细胞中表达了大小约为60kD的特异性条带，而对照 样品感染野生Bacmid的Sf9细胞裂解产物和Sf9细胞裂解产物均未显示相应的条带。 免疫印迹与电泳的目的条带位置相符，说明目的蛋白得到表达。 4、血凝试验(HA)和血凝抑制试验(HI)鉴定分别取感染重组病毒的细胞裂解上清和细胞培养上清50 u L于圆底大孔血凝板以生 理盐水作2倍比稀释后，加入等体积1%人"0"型红细胞悬液，振荡均匀后，置于4'C作 用45分钟后观察结果。同时以其他重组杆状病毒感染细胞产物作为阴性对照，以RHDV 病兔肝脏l: 5匀浆上清作为阳性对照。结果显示，感染细胞裂解上清和细胞培养上清血 凝效价均可达212以上，而其他重组杆状病毒感染细胞产物无血凝反应。于圆底大孔血凝板加入50uLRHDV血清，以生理盐水作2倍比稀释后，加入4个血 凝单位的表达蛋白于每孔，将血凝板置37'C，作用30分钟后，每孔加1%人"0"型红细 胞悬液50ixL，立即摇匀，置4'C作用45分钟。结果显示，表达的VP60蛋白的血凝特性 可被RHDV高免血清所抑制，表明表达的VP60蛋白具有与RHDV相似的生物学活性。 (三)杂交瘤细胞株的建立1、小鼠免疫用血凝效价为13 log 2 RHDV重组VP60蛋白免疫6 8周龄的雌性BALB/c小鼠，免疫 程序为皮下注射弗氏完全佐剂乳化的抗原200ixL/只，2周后皮下注射弗氏不完全佐剂 乳化的等量抗原，间隔2周后，再皮下注射弗氏不完全佐剂乳化的等量抗原，融合前3 天腹腔注射等量不加佐剂的抗原加强免疫。 2、细胞融合按常规方法进行(刘秀梵，单克隆抗体在农业上的应用(第l版)[M].合肥安徽 科学技术出版社，1994:18 30.)。取SP2/0骨髓瘤细胞与VP60蛋白免疫的BALB/c小鼠 脾细胞按l : 5 1 : 10的比例混合于50mL离心管中，充分混匀，l,OOOrpm离心10min， 弃上清。用手掌轻击管底，使细胞松散均匀，置40。C水浴预热。用lmL吸管在45s内加完 预热至4(TC 50%PEG-4000 1mL，边加边轻轻振荡，然后在90s内加入30mL预热至37。C 的DMEM(购买于Invitrogen公司)不完全培养基，室温静置10min， 1,000ipm离心10min， 弃上清，加入20mL含20XFCS(小牛血清，购买于上海慧人生物科技工程研究所)和HAT (购买于Invitrogen公司)DMEM培养基重悬。分装到已有饲养细胞的96孔板上，于5% C02培养箱培养，7d后，观察细胞的生长状况，用含有20。/。FCS和HT (购买于Invitrogen 公司)的DMEM培养基换出l/2培养基。14d后，改用含20。/。FCS和HT的DMEM培养基培养，当融合细胞生长至96孔板孔底面积的l/5时，取上清进行抗体检测。3、 杂交瘤筛选用重组VP60蛋白和RHDV包被进行双重间接ELISA，分别对细胞培养上清进行检测， 筛选出对RHDV和VP60重组蛋白呈为阳性的杂交瘤细胞。用包被液为0. 05 mol/L pH 9. 6 碳酸盐缓冲液对起始血凝效价为13log2的兔出血症肝病料上清液和杆状病毒表达系统表 达血凝效价为13log2的VP60蛋白进行倍比稀释，用稀释至l: 2'的液体包被ELISA板， 100uL/孔，置4'C包被过夜；PBST洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；以2%明胶封 闭每孔，200nL/孔，37。C放置2h; PBST洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；将细胞上清、i: ioo稀释的阳性参考血清和i: ioo稀释的阴性参考血清，加入相应孔内，ioouL/孔，37。C作用90 min; PBST洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；加入1 : 2000 稀释的酶标羊抗鼠IgG， 100pL/孔，37。C放置60min; PBST洗涤5次，每次5min，最后 一次拍干；加入底物TMB- H202， 100 u L/孔，室温避光显色10min;每孔加入50 u L 2 mol/L 硫酸终止反应；经酶标仪测定0D450nm值以空白对照调零，P为各检测孔的值，N为阴 性参考血清的OD徊值，当阴性参考血清的OD柳值芸O.l，阳性参考血清的OD柳值与阴性 参考血清的0D45。值的比值^2.1，即阴、阳性对照成立的前提下，P/NS2.1的检测孔判 为阳性，1. 5《P/N<2. 1的检测孔判为可疑，P/N〈1.5的检测孔判为阴性。4、 有限稀释法对杂交瘤细胞亚克隆对于筛选所得的分泌特异性单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，及时采用有限稀释法(刘 秀梵，单克隆抗体在农业上的应用(第1版)[M].合肥安徽科学技术出版社， 1994:35-36.)进行亚克隆。首先将阳性孔活细胞用台盼兰进行染色和计数，用DMEM 完全培养基(注首次亚克隆应加HT)稀释成100个细胞/15mL培养基，将稀释的细胞 悬液加入96孔细胞培养板，每孔0.15mL， 37°C， 5%(:02培养箱中培养，4 5d后， 显微镜下可观察到克隆细胞的形成，记录下只有单个克隆生长孔，8~9d时取细胞上清， 及时进行ELISA检测；选择阳性的单克隆细胞再进行同样的亚克隆3次以上，直至亚克 隆后所有细胞孔上清检测均为阳性、且各孔检测OD值较接近。将多次亚克隆培养后的 阳性孔细胞扩大培养，并冻存，获得稳定分泌抗RHDV VP60蛋白单克隆抗体的杂交瘤 细胞株A3C。杂交瘤细胞株A3C，于2009年3月24日宝藏于中国典型培养物保藏中心 CCTCC,地址武汉武汉大学邮编430072，保藏编号为CCTCC一C200921 。 (四)抗RHDVVP60蛋白单克隆抗体的制备将石蜡油注射成年BALB/c小鼠，0. 5 mL /只，致敏7天后，将阳性杂交瘤细胞用0. 01MPBS稀释后注入小鼠腹腔，每只小鼠注射5xl06 lxl07， 0.2 mL， 5~10夭后采 取腹部明显鼓起小鼠的腹水，11000g，离心5min，收集上清，小量分装，-70匸保存。(五) 抗RHDVVP60蛋白单克隆抗体的腹水效价测定用PBS缓冲液1:100稀释单克隆抗体腹水，然后进行倍比稀释，加入用杆状病毒表达 系统表达的VP60蛋白包被的酶标板，100 uL/孔，37°C，孵育90 min; PBST洗涤3次， 每次5min，最后一次拍干；加入l : 2000稀释的服P标记羊抗鼠IgG, 100uL/孔，37°C， 孵育60min; PBST洗涤5次，每次5min，最后一次拍千；加入底物TMB- HA， 100uL/孔， 室温避光显色10min;每孔加入50nL2mol/L硫酸终止反应；经酶标仪测定OD450值。以 阴性0D450值小于0.2，检测孔与阴性OM50值的比值大于2.1判为阳性，以阳性孔的最大 稀释度作为单克隆抗体的腹水效价。结果显示，A3C细胞株腹水间接ELISA效价为 1:327600。(六) 抗RHDV VP60蛋白单克隆抗体与重组蛋白和RHDV反应原性与特异性鉴定 用Western-blotting (冯仁青，郭振泉.现代抗体技术及其应用(第l版)[M].北京北京大学出版社，2006:199 206.)鉴定所得单克隆抗体腹水的反应原性与特异性。用表达的重组蛋白和RHDV在12X分离胶，5X浓縮胶中进行SDS-PAGE电泳后，将凝胶在Tris-Gly缓冲系统中转印到硝酸纤维膜(NC膜)上，0.65mA/cm2，转印100分钟，5%脱脂奶封闭，以单克隆抗体作为一抗，以HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，DAB显色试剂盒显色。结果显示，该单克隆抗体既可与表达的重组蛋白特异性结合，又可与RHDV特异性结合，均出现单一一条反应条带，证明抗RHDVVP60蛋白单克隆抗体是RHDV衣壳蛋白VP60特异性抗体。10
权利要求
1、一种抗兔出血症病毒RHDV衣壳蛋白VP60单克隆抗体，其特征在于该单克隆抗体是杂交瘤细胞株A3C产生的，杂交瘤细胞株A3C于2009年3月24日宝藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC—C200921。
2、 根据权利要求1所述的一种抗RHDV衣壳蛋白VP60单克隆抗体，其特征在于，是由以下方法制备而获得的1) RHDV重组VP60蛋白的制备根据RHDV VP60序列设计一对引物，用RT-PCR方法扩增RHDV衣壳蛋白VP60基因， 通过克隆、转化得到重组穿梭载体Bacmid-VP60，用此质粒转染Sf9昆虫细胞，得到重 组病毒rAcV-Bac-VP60 ，用此重组病毒感染Sf9昆虫细胞，经免疫荧光法、 Western-blotting、血凝实验鉴定重组VP60蛋白表达，获得免疫用重组VP60蛋白；2) 小鼠免疫血凝效价为13 log 2的RHDV重组VP60蛋白免疫6 8周龄的雌性BALB/c小鼠，免疫 程序为皮下注射弗氏完全佐剂乳化的抗原200uL/只，2周后皮下注射弗氏不完全佐剂 乳化的等量抗原，间隔2周后，再皮下注射弗氏不完全佐剂乳化的等量抗原，融合前3 天腹腔注射等量不加佐剂的抗原加强免疫；3) 细胞融合取SP2/0骨髓瘤细胞与免疫的BALB/c小鼠脾细胞按l : 5 1 : 10的比例混合于50 mL离心管中，充分混匀，l,OOOrpm离心10min，弃上清，用手掌轻击管底，使细胞松散 均匀，置40。C水浴预热，用lmL吸管在45s内加完预热至40。C的50。/。PEG-4000 1mL，边 加边轻轻振荡，然后在90s内加入30mL预热至37'C的DMEM不完全培养基，室温静置 10min， l,OOOrpm离心lOmin，弃上清，加入20mL含20^FCS和HAT的DMEM培养基重悬； 分装到已有饲养细胞的96孔板上，于5。/。C02培养箱培养，7d后，观察细胞的生长状况， 用含有20。/。FCS和HT的DMEM培养基换出l/2培养基；14d后，改用含20。/。FCS和HT的 DMEM培养基培养，当融合的细胞生长至96孔板孔底面积的l/5时，取上清进行抗体检测；4) 杂交瘤筛选用包被液为0. 05 mol/L pH 9. 6碳酸盐缓冲液对起始血凝效价为13 bg 2的兔出血 症肝病料上清液和杆状病毒表达系统表达的血凝效价为13 bg 2的VP60结构蛋白进行稀 释，用稀释至l: 27的液体包被ELISA板，100uL/孔，置4'C包被过夜；PBST洗涤3次， 每次5min，最后一次拍干；以2%明胶封闭每孔，200yL/孔，37。C放置2h; PBST洗涤 3次，每次5min,最后一次拍干；将细胞上清、1 : 100稀释的阳性参考血清和1 : 100稀释的阴性参考血清，加入相应孔内，100 uL/孔，37。C作用90 niin; PBST洗涤3次， 每次5min，最后一次拍干；加入l : 2000稀释的酶标羊抗鼠IgG， 100uL/孔，37'C放置 60min; PBST洗涤5次，每次5min，最后一次拍干；加入底物TMB- H202， 100uL/孔， 室温避光显色10min;每孔加入50 ii L 2 mol/L硫酸终止反应；经酶标仪测定OD450nm 值以空白对照调零，P为各检测孔的值，N为阴性参考血清的0D45。值，当阴性参考血清 的0D45。值^0,1，阳性参考血清的0D顿值与阴性参考血清的0D45。值的比值^2.1，即阴、 阳性对照成立的前提下，P/N^2.1的检测孔判为阳性，1. 5《P/N<2.1的检测孔判为可 疑，P/N〈1.5的检测孔判为阴性；5) 有限稀释法对杂交瘤细胞亚克隆首先将阳性孔活细胞用台盼兰进行染色和计数，用DMEM完全培养基稀释成100 个细胞/15mL培养基，将稀释的细胞悬液加入96孔细胞培养板，每孔0.15mL， 37°C， 5 %(302培养箱中培养，4 5d后，显微镜下可观察到克隆细胞的形成，记录下只有单个 克隆生长孔，8 9d时取细胞上清，及时进行ELISA检测；选择阳性的单克隆细胞再进 行同样的亚克隆3次以上，直至亚克隆后所有细胞孔上清检测均为阳性孔、且各孔检测 OD值较接近；将多次亚克隆培养后的阳性孔细胞扩大培养，并冻存，获得稳定分泌抗 RHDVVP60蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株A3C，杂交瘤细胞株A3C，于2009年3月 24日宝藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址武汉武汉大学邮编430072， 保藏编号为CCTCC一C200921;6) 抗RHDVVP60蛋白单克隆抗体的制备将石蜡油注射成年BALB/c小鼠，0. 5 mL /只，致敏7天后，将阳性杂交瘤细胞株 A3C用0. OIMPBS稀释后注入小鼠腹腔,每只小鼠注射5xl06 1 ><107个细胞，0.2 mL， 5 IO天后采取腹部明显鼓起小鼠的腹水，11000g，离心5min，收集上清，小量分装，-70 'C保存。
全文摘要
本发明涉及抗兔出血症病毒(RHDV)VP60蛋白单克隆抗体，属于生物技术领域。取SP2/0骨髓瘤细胞与用RHDV重组VP60蛋白免疫的BALB/c小鼠脾细胞进行细胞融合，用HAT培养基进行选择性培养后，用重组VP60蛋白和RHDV进行双重ELISA筛选，分别对细胞培养上清进行检测、筛选获得稳定分泌抗RHDV VP60蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株A3C，测得A3C腹水ELISA效价为1∶327600，经鉴定该单克隆抗体既可与表达的重组VP60蛋白特异性结合，又可与RHDV特异性结合，均出现单一一条反应条带，证明抗RHDV VP60蛋白单克隆抗体是RHDV衣壳蛋白VP60特异性抗体。
文档编号C07K16/10GK101519447SQ20091002962
公开日2009年9月2日 申请日期2009年4月8日 优先权日2009年4月8日
发明者何孔旺, 张则斌, 徐为中, 芳 王, 波 胡, 范志宇, 蔡少平 申请人:江苏省农业科学院