专利名称：一种检测狂犬病毒抗体的酶联免疫试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测狂犬病毒抗体的酶联免疫试剂盒。
背景技术：
狂犬病又名恐水症，是一种侵害中枢神经系统的急性病毒性传染病，多由患病的动物咬人而得，一旦发病死亡率高达100%。目前国内外预防狂犬病的主要手段是对暴露人群注射狂犬病疫苗。世界卫生组织建议，狂犬病毒的中和抗体滴度达到0. 5IU/ml时具有保护力。对于已注射疫苗的人血清中抗狂犬病毒抗体滴度的评价，可以作为临床评估该疫苗有效性的指标。目前常用的检测狂犬病毒抗体的检测方法有荧光抗体病毒中和试验(FAVN)、快速荧光斑点抑制试验(RFFIT)、小鼠中和试验(MNT)以及酶联免疫吸附试验(ELISA)。其中酶联免疫吸附试验操作安全，灵敏度高，结果稳定，准确性强，得到普遍的认可。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测狂犬病毒抗体的酶联免疫试剂盒。为了实现本发明目的，本发明的一种检测狂犬病毒抗体的酶联免疫试剂盒，包括1)包被有0. 05 μ g/ml 0. 1 μ g/ml重组狂犬病病毒G蛋白的酶标板；2)样品稀释液含有0. 5%0 1%。酪蛋白钠盐的磷酸盐缓冲液；3)洗涤液含有0. 5%0 1%。吐温的磷酸盐缓冲液；4)酶标记物用辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠抗人IgGFc片段单克隆抗体；5)显色剂A 含有0. 4%。 0. 6%。过氧化氢脲的柠檬酸盐缓冲液；6)显色剂B 含有0. 2%。 0. 25%。四甲基联苯胺的柠檬酸盐缓冲液；7)终止液1. 5mol/L 2mol/L硫酸溶液；8)阴性对照正常人血清；9)阳性对照含有狂犬病毒抗体的人血清。前述的试剂盒，所述重组狂犬病病毒G蛋白按照下述方法制备，包括步骤1)以编码狂犬病病毒G蛋白的碱基序列作为目的基因片段根据NCBI上公布的数据以及亲/疏水性程序软件分析，选取狂犬病病毒G蛋白全序列从149位502位的共354 个氨基酸残基所对应的碱基序列作为目的基因片段，合成共1062个碱基(bp)的目的基因片段；2)将该目的基因片段通过表达载体导入宿主细胞，筛选得到表达狂犬病病毒G蛋白的工程细胞；3)培养工程细胞，得到包涵体；4)破碎细胞，纯化，得到重组狂犬病病毒G蛋白。前述的试剂盒，所述表达载体为pET系列质粒(pET_5a)。
前述的试剂盒，所述宿主细胞为E. coli BL21 (DE3)。本发明还提供上述检测狂犬病毒抗体的酶联免疫试剂盒的使用方法，包括如下步骤1)加样取包 被好的酶联板，每次实验设空白对照孔、阴性血清对照孔、阳性血清对照孔和样品孔，在各孔先加样品稀释液ΙΟΟμ 1，再依次向各对应孔中加入阴性血清、阳性血清和样品各ΙΟμΙ，混勻。空白对照孔只加样品稀释液ΙΟΟμ 1。贴上不干胶条，置于37°C 温育20min。2)洗板倒扣掉酶联板中的液体，并向各孔加入洗涤液300 μ 1，静置30s后，扣掉酶联板中的液体，反复洗涤5次，最后一次要将液体拍干。3)加二抗向各孔中加入二抗酶标记物100μ 1，空白对照孔不加，贴上不干胶条， 置于37°C温育20min。4)洗板，同步骤2)。5)显色依次向各孔加显色剂A和显色剂B各50μ1，混勻，置于37°C温育15min。6)终止依次向各孔加入终止液50 μ 1，混勻。7)测定用酶联仪对空白孔调零，测定各孔的光吸收值(0D值)。8)判定结果根据测定OD值与临界值(cut-off值)的比值判断。若比值大于1， 则该血清为阳性，说明其中含有狂犬病毒抗体，疫苗具有保护效力；若比值小于1，则该血清为阴性，说明其中不含抗体。临界值的确定用注射过狂犬病毒疫苗的人血清对小鼠进行脑内中和试验，并测定中和抗体效价，将未注射过狂犬疫苗的人血清稀释至0.5IU/ml。对1000份上述血清按照步骤1)-7)进行酶联免疫吸附试验，测得的OD值求平均(又)以及标准差(SD)，cut-offiti +3SD。本发明提供的检测狂犬病毒抗体的酶联免疫试剂盒，用于在注射过狂犬病毒疫苗后，检测血清中是否存在相应抗体，以评价免疫效果。本发明是利用间接酶联免疫吸附试验检测狂犬病毒抗体的试剂盒，以抗体滴度为0. 5IU/ml的内部质控血清测定值作为临界值 (cut-off值)，具有高灵敏度和特异性。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例检测狂犬病毒抗体的酶联免疫试剂盒的制备本发明的检测狂犬病毒抗体的酶联免疫试剂盒，包括1)包被有0. 1 μ g/ml重组狂犬病病毒G蛋白的酶标板；2)样品稀释液含有1%。酪蛋白钠盐的磷酸盐缓冲液；3)洗涤液含有1%。吐温的磷酸盐缓冲液；4)酶标记物用辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠抗人IgGFc片段单克隆抗体；5)显色剂A 含有0. 6%。过氧化氢脲的柠檬酸盐缓冲液；6)显色剂B 含有0. 25%。四甲基联苯胺的柠檬酸盐缓冲液；7)终止液2mol/L硫酸溶液；8)阴性对照正常人血清；
9)阳性对照含有狂犬病毒抗体的人血清。 其中，重组狂犬病病毒G蛋白按照下述方法制备，包括步骤1)目的基因的获得选取狂犬病病毒G蛋白全序列从149位502位的共354个氨基酸残基所对应的碱基序列作为目的基因片段，合成共1062个碱基(bp)的目的基因片段。2)重组将所述目的基因片段和质粒pET_5a用限制性内切酶Bgl II和BamH I 双酶切，并利用T4连接酶将目的基因片段重组于质粒。3)转化采用氯化钙-丙三醇法将质粒转化至E. coli BL21，并对菌体进行复苏。4)验证将转化子涂布于含25 μ g/ml 50 μ g/ml氨苄霉素的培养基上培养16 18小时。挑取白色菌落提质粒，对质粒进行单酶切和双酶切，并根据SDS-PAGE电泳条带的分析对比确定质粒是否发生重组。5)表达挑取1个重组质粒的克隆，于液体培养基中培养至0D_值为0. 3 0. 5 时加入0. 05mmol/L 0. lmmol/LIPTG,大约3. 5小时后蛋白表达量最大。6)纯化对菌液进行超声破碎菌体，4000rpm离心，取上清液，用4B凝胶层析柱纯化并测定蛋白含量，确定蛋白浓度。实验例检测狂犬病毒抗体的酶联免疫试剂盒的应用及检测效果上述实施例制得的酶联免疫试剂盒的使用方法，包括如下步骤1)加样取包被好的酶联板，每次实验设空白对照孔、阴性血清对照孔、阳性血清对照孔和样品孔，在各孔先加样品稀释液100μ 1，再依次向各对应孔中加入阴性血清、阳性血清和样品各ΙΟμΙ，混勻。空白对照孔只加样品稀释液100 μ 1。贴上不干胶条，置于37°C 温育20min。2)洗板倒扣掉酶联板中的液体，并向各孔加入洗涤液300 μ 1，静置30s后，扣掉酶联板中的液体，反复洗涤5次，最后一次要将液体拍干。3)加二抗向各孔中加入二抗酶标记物100μ 1，空白对照孔不加，贴上不干胶条， 置于37°C温育20min。4)洗板，同步骤2)。5)显色依次向各孔加显色剂A和显色剂B各50μ1，混勻，置于37°C温育15min。6)终止依次向各孔加入终止液50 μ 1，混勻。7)测定用酶联仪对空白孔调零，测定各孔的光吸收值(0D值)。8)判定结果根据测定OD值与临界值(cut-off值)的比值判断。若比值大于1， 则该血清为阳性，说明其中含有狂犬病毒抗体，疫苗具有保护效力；若比值小于1，则该血清为阴性，说明其中不含抗体。临界值的确定用注射过狂犬病毒疫苗的人血清对小鼠进行脑内中和试验，并测定中和抗体效价，将未注射过狂犬疫苗的人血清稀释至0.5IU/ml。对1000份上述血清按照步骤1)-7)进行酶联免疫吸附试验，测得的OD值求平均(又)以及标准差(SD)，cut-offlK +3SD。将本发明试剂盒和宁波天润生物制品有限公司生产的试剂盒(国号准字 S2006008)分别对进口狂犬病毒疫苗与国产狂犬病毒疫苗免疫后人群、免疫与非免疫人群进行狂犬病毒抗体检测，结果如表1和表2所示。表1进口苗与国产苗全程免疫后抗体阳转情况比较
权利要求
1.一种检测狂犬病毒抗体的酶联免疫试剂盒，其特征在于，其包括1)包被有0.05 μ g/ml 0. 1 μ g/ml重组狂犬病病毒G蛋白的酶标板；2)样品稀释液含有0.5%。 1%。酪蛋白钠盐的磷酸盐缓冲液；3)洗涤液含有0.5%0 1%。吐温的磷酸盐缓冲液；4)酶标记物用辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgGFc片段单克隆抗体；5)显色剂A含有0. 4%。 0. 6%。过氧化氢脲的柠檬酸盐缓冲液；6)显色剂B含有0. 2%0 0. 25%。四甲基联苯胺的柠檬酸盐缓冲液； 7)终止液1.5mol/L 2mol/L硫酸溶液；8)阴性对照正常人血清；9)阳性对照含有狂犬病毒抗体的人血清。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述重组狂犬病病毒G蛋白按照下述方法制备，包括步骤1)根据NCBI上公布的数据以及亲/疏水性程序软件分析，选取狂犬病病毒G蛋白全序列从149位502位的共354个氨基酸残基所对应的碱基序列作为目的基因片段，合成共 1062个碱基的目的基因片段；2)将该目的基因片段通过表达载体导入宿主细胞，筛选得到表达狂犬病病毒G蛋白的工程细胞；3)培养工程细胞，得到包涵体；4)破碎细胞，纯化，得到重组狂犬病病毒G蛋白。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述表达载体为pET-5a质粒。
4.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述宿主细胞为E.coli BL21。
全文摘要
本发明提供了一种检测狂犬病毒抗体的酶联免疫试剂盒、其制备方法及检测方法。该试剂盒是将重组狂犬病毒G蛋白作为抗原包被在酶联板上，以辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠抗人IgG Fc片段单克隆抗体作为酶标记物。所述试剂盒还包括显色剂A、显色剂B、终止液、样品稀释液、阴性对照为正常人血清、阳性对照为含有狂犬病毒抗体的血清。本试剂盒灵敏度高，准确度高，操作安全，方便快捷。
文档编号C07K14/145GK102175867SQ20101062067
公开日2011年9月7日 申请日期2010年12月23日 优先权日2010年12月23日
发明者何佳琦, 王婷婷, 韩菲, 魏文进 申请人:北京民海生物科技有限公司