专利名称：精确育种的制作方法
精确育种
本申请为2004年10月18日进入中国国家阶段、申请号为038086433、申请日为 2003年2月20日、发明名称为“精确育种”的发明专利申请的分案申请。发明领域
本申请要求美国临时申请序列号60/357，661和60/377，602的优先权，其在这里引作参考。本发明涉及通过修饰植物基因组中特异的、熟知的DNA而提高植物的营养、健康和农艺特性的方法。与传统的植物育种相反，本发明的方法不会将未知的或有潜在毒性的基因引入到植物遗传组成中。此外，本发明的方法与常规的遗传工程策略不同，不将异源物种，即不能与将要通过遗传工程修饰的植物交互可孕的植物的核酸掺入到植物的基因组中。通过本发明的植物育种方法开发的植株显示改善的农艺特性。本发明特别优选的植株包括显示改善了健康和块茎贮藏特性的马铃薯，以及显示提高了疾病和干旱耐受性的草坪草。
背景
典型地一直是通过传统的植物育种或者遗传工程来改善植物的农艺特性。传统的育种一般导致将未知的核酸从一种植物转移到另一种植物。遗传工程技术将异源核酸引入到植物基因组中，即DNA不是来源于植物或者不是来源于与将要通过遗传工程修饰的植物天然交互可孕的植物。例如，遗传工程将非植物核酸引入到植物基因组中。传统的育种和遗传工程策略两者都产生含有不期望和不需要的遗传物质的植物基因组，得到的杂交的或转基因的植物显示不利的特性。可以证明这两种策略的缺陷对转基因植物是有害的，对食用这些产品的动物和人也是有害的。
传统育种依赖于未知DNA的转移
植物育种一般依靠植物染色体的随机重组以产生具有新的和改善特性的变种。因此，通过筛选从植物杂交获得的众多子代，育种者能够鉴定出那些显示期望特性，例如产量增加、活力增强、疾病和昆虫抗性提高、或者在干旱条件下生存能力增强的植株。然而，传统的育种方法是费力和耗时的，而且新的变种一般仅仅显示相对适度的改善。
此外，传统的植物育种一般导致将许许多多的未知基因转移到植物基因组中。很可能那些转移的基因中的一些编码潜在的有害的变应原，例如马铃薯块茎蛋白、凝集素、壳多糖酶、蛋白酶、奇异果甜蛋白(thaumatin)样蛋白、脂转移蛋白、淀粉酶、胰蛋白酶抑制剂, 以及种子忙藏蛋白(Breiteneder 等，J Allergy Clin Tmmunol 106:27 — 36)。
类似地，可能在毒素的生物合成中涉及渐渗基因，其中毒素包括山黛豆素 (lathyiOgens)、肼、芥子油苷和致甲状腺肿物、香豆素、皂苷、生物碱、糖苷生物碱、生物胺、 酶抑制剂，如凝集素(血细胞凝集素)、胰蛋白酶抑制剂、鳌合底物如肌醇六磷酸和草酸、核糖毒素(ribotoxins)、抗微生物肽、氨基酸如β — N—草酰氨基一 L 一丙氨酸、苍术苷、夹竹桃苷、紫杉醇，和异喹啉(Pokorny，Cas Lek Cesk 136 :267 — 70，1997)。通过努力“开发”以前没有用作食物消费的野生作物亲属的的遗传多样性，进一步提高了意外地将这些毒物引入到人和动物食物供应品中的风险(Hoisington等，Proc Natl Acad Sci USA 96:5937 - 43,1999)。
尽管传统的植物育种能够容易地将在不期望的抗营养化合物中涉及的基因引入到粮食作物和植物中，但是其不能容易地将它们除去。例如，花了约15年时间通过灭活Lpa 基因减少谷物和水稻中有害的肌醇六磷酸水平(Raboy，J Nutr 132 :503S — 505S，2002)。 用长的时间框架来实现积极的结果是不实际的，特别是由于现在急切地需要更有效地和高效地提高粮食作物质量的方法。最近才发现与抗营养化合物的合成有关的基因的一个实例是多酚氧化酶(PPO)基因，其氧化某些酚类化合物产生象苯氧基自由基和醌衍生物那样的致突变的、致癌的和细胞毒性试剂(Kagan等，Biochemistry 33 :9651 — 60,1994)。在植物如马铃薯的基因组中存在这个基因的多重拷贝，使得特别难于通过育种来减少PPO的活性。
如果对它们的遗传基础知道得很少或者一无所知，那么甚至需要更多的时间来除去抗营养化合物。例如，一直没有将基因与在一些被加热到160 V或者更高时的马铃薯中高浓度丙烯酰胺的累积相联系，丙烯酰胺是一种烈性神经毒素和诱变剂(Tareke等，J Agric Food Chem. 50 :4998 — 5006,2002)。因此在使用传统育种的加工期间很难高效地开发新的能产生较少丙烯酰胺的马铃薯变种。因此，需要种植具有较低水平的这类危险化合物，但是没有使用未知或异源核酸的马铃薯和其它富含碳水化合物的食物，例如小麦。
可在加工期间累积并且很难通过育种减少到最少或消除的其它抗营养化合物包括美拉德反应(Maillard — reaction)产物N —亚硝基一N — (3 —酮一1,2 — 丁二醇)一 3’ 一硝基酪胺(Wang 等，Arch Toxixol 70 :10 — 5，1995)，以及 5 —羟甲基一2 —糠醛 (Janzowski 等，Food Chem Toxicol 38:801 — 9,2000)。一直没有被很好地表征的另外的美拉德反应产物也已知显示诱变特性(Shibamoto，Prog Clin Biol Res 304 :359 — 76， 1989)。
由于传统的植物育种固有的不精确，要迅速地提高粮食作物中有益的营养化合物的水平同样可能是困难的。例如，期望提高各种作物中“抗性淀粉”的水平(Topping等， Physiol Rev 81 :1031 — 64，2001 )。这种淀粉最终负责促进免疫应答，抑制潜在的病原体， 以及降低包括结肠直肠癌在内的疾病的发病率(Brid等，Curr Issues Intest Microbiol I 25 - 37，2000)。然而，仅可得到的抗性淀粉水平增加的植株是象玉米突变株“amylose extender”,“dull”,和“sugary — 2”那样低产量的变种。新的高抗性淀粉来源如马铃薯的产生将能够将这种促进健康的成分较广泛地结合到饮食中。
不能安全地操纵植物的基因型经常导致使用外部的化学药品以诱导期望的基因型。尽管众多的育种程序延迟块茎发芽，然而例如，买不到不用发芽抑制剂处理就可以贮藏数月的马铃薯变种。后者，如异丙基一 N —氯苯基一氨基甲酸酯(CIPC)，与急性毒性和肿瘤发展有关联，并可能以lmg/kg和5mg/kg之间的浓度存在于加工的马铃薯食品中。
遗传工程依赖于外源DNA的转移
遗传工程可以用于修饰、产生或除去植物的某些特性。尽管在提高植物的营养价值和健康特征方面一直存在有限的进步，但是绝大多数靶植物特性的改善促进了容易栽培作物。因此，某些植物抵抗草苷膦除草剂，因为它们含有细菌的5 —烯醇丙酮酰莽草酸一 3—憐酸合成酶基因(Padgette 等，Arch Biochem Biophys. 258 :564 — 73,1987)。 类似地,遗传工程已经生产了抗昆虫、抗病毒和抗真菌的植物变种(Shah等，Trends inBiotechnology 13 :362 — 368,1995 ；Gao 等，Nat Biotechnol. 18 1307 — 10, 2000 ；0susky 等，Nat Biotechnol. 18 :1162 — 6，2000)，但是几乎没有一种具有增强营养或健康的益处。
根据标准的公知技术，将包括基因和调节元件的基因“表达盒”插入到从土壤杆菌分离的转移DNAs (“T 一 DNAs”)的边缘序列内并整合到植物基因组中。因此，土壤杆菌介导的T - DNA材料的转移经典地包括下列标准步骤(I)遗传元件的体外重组，其中至少一个元件是异源的，以生产用于转化筛选的表达盒，(2)常常将这种表达盒与至少一种含有外源DNA的其它表达盒一起插入到双载体的T - DNA区，其通常由两侧是T 一 DNA 边缘序列的土壤杆菌DNA的几百个碱基对构成，(3)将位于T - DNA边缘之间的序列，常常伴随另外双载体序列的一些或全部一起，从土壤杆菌(Agrobacterium)转移到植物细胞中，以及(4)筛选稳定转化的植物细胞。参见，例如美国专利号4，658，082、6，051，757、 6，258，999,5, 453，367,5, 767，368,6, 403，865,5, 629，183,5, 464，763,6, 201，169、 5，990，387,4, 693，976,5, 886，244,5, 221，623,5, 736，369,4, 940，838,6, 153，812、 6，100，447,6,140，553,6,051，757,5,731，179,5,149，645、和 EP 0120，516、EP 0257，472、 EP 0561，082、1，009，842A1、0 853, 675AU0 486，233B1、0 554，273A1、0270，822A1、0 174， 166A1和 WO 01/25459。
因此，遗传工程方法取决于将外源核酸引入到食物供应中。那些技术将由几个到多于20个的从病毒、细菌和植物中分离的非固有的遗传元件组成的复杂的融合转移转化的植物种中。这样的外源元件包括调节元件如启动子和终止子，以及在新特性的表达中涉及的或者作为转化事件鉴定或筛选标记的基因。尽管在规章批准前要检验含有外源DNA的食物的安全，但是许多消费者仍然关心表达外源蛋白的食用食品的远期效应，该外源蛋白是通过从其它非植物种中获得的基因产生的。
一个普遍使用的调节元件是花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S “超级”启动子，其在植物工程中一般用于诱导与其直接连接的转基因的高水平表达。然而，该35S启动子也能提高其附近的天然基因的表达(Weigel等，Plant Physiol.，122 :1003 — 13，2000)。这类启动子可能因此在内源基因的表达中诱导不可预知的改变，可能导致不良效果，如增加生物碱产量。优选的“强”启动子通常是那些从病毒中分离的启动子，这些病毒如水稻tungro 杆状病毒、玉米条斑病毒、木薯叶脉病毒、紫茉莉病毒、花生褪绿条死病花椰菜花叶病毒、玄参花叶病毒和小球藻病毒。其它经常使用的启动子克隆自细菌种，以及包括胭脂氨酸合酶和章鱼氨酸合酶基因的启动子。
为了达到基因转录的适当终止，将终止子序列融合到转基因的3’一末端并且终止子序列包括土壤杆菌的胭脂氨酸合成酶和章鱼氨酸合成酶基因的遗传元件。可以使用其它的遗传元件来进一步增强基因表达或将表达的蛋白靶向某些细胞小室。这些元件包括促进转基因表达的内含子和将外源基因靶向某些细胞小室的信号肽序列，常常来自外源植物种。
在新特性的表达中所涉及的某些基因最经常源于异源来源。如果使用天然基因， 那么经常将它们反向以在转基因植物中使该基因的表达沉默，并与外源DNA如选择性标记基因共转化。这种“反义”技术的主要缺点是反向的DNA通常含有在启动子和终止子之间插入的新的和未表征过的可读框。因此，所有用来源于淀粉相关基因RI (Kossmann等，美国专利6，207，880)、L 一和H 一型葡聚糖磷酸化酶基因(Kawchuk等，美国专利5，998，701，1999)、多酚氧化酶基因(Steffens，美国专利6，160，204，2000)、以及淀粉分支酶I和II基因(Schwall 等,Nature Biotechnology 18 :551 — 554,2000)的反义构建物遗传修饰的马铃薯植株都潜在地表达由至少50个氨基酸(表I)构成的新肽。这些新肽可能妨碍植物发育和/或减少马铃薯的营养价值，因而是不受欢迎的。
将常规的标记物基因掺入到遗传构建物中并用于选择转化事件。它们赋予转化植物抗生素抗性或除草剂抗性(美国专利No. 6，174，724)、代谢优点(美国专利 No. 5，767，378)或者形态异常表型(美国专利No. 5，965，791)。这类标记物一般来自细菌来源。
此外，由于T — DNA转移的不忠诚，在植物如番茄、烟草和马铃薯中约75%的转化事件除了含有T — DNA外还含有质粒“主链”序列(Kononov等，Plant J. 11 :945 — 57， 1997)。这种主链序列的存在是不受欢迎的，因为它们是外源的并且一般含有复制起点和抗生素抗性基因标记。
的确存在除去象异源标记基因那样元件的各种方法，但是很少有一种可很容易地适用于植物遗传工程。根据一种这样的方法，将标记基因和期望的基因或核苷酸序列置于不同的载体上。用含有两个载体的单个土壤杆菌菌株(美国专利No. 6，265，638)或者用两个土壤杆菌菌株，其中每个菌株携带两个载体中的一个，用以感染植株可能会偶然导致无关联的整合事件，其可以通过异杂交繁殖进行遗传分离。这种方法的主要缺点是基因座的遗传分离可能是非常费力和耗时的，特别是如果与T 一 DNA整合事件联系在一起的话。此外， 这种方法不能广泛地在无性生殖的植物中应用，该植物无性繁殖，如肯塔基蓝草，或者营养体繁殖的作物如马铃薯，由于近交衰退、高水平的杂合性以及低繁殖力水平，其不能很容易地被培育。
另一个除去异源遗传元件的方法依靠将外源基因如选择性标记基因，插入到转座元件中。该修饰的转座元件可能接着以低频率从基因组中被剪接出去。接着必需与未转化的植株进行传统的杂交以便将转座的元件与宿主分离(美国专利No. 5，482，852)。正如对于以前的方法已经描述的那样，这种可选择的方法不能用于营养体繁殖或者无性生殖的植物系统。
除去标记基因的第三种方法使用Pl噬菌体的Cre/lox位点特异性重组系统 (Dale&Ow, Pro. Natl. Acad. Sci. USA,88 :10558 — 62，1991)。在两个 Iox 位点之间将标记基因与Cre重组酶基因和在Cre的诱导中涉及的嵌合基因(两个基因都具有它们自己的启动子和终止子)一起插入，导致在再生过程期间切除由Iox位点描绘的区域(Zuo等，Nat. Biotechnol.，19 :157 — 61，2001)。这种复杂的过程是效率低和不可靠的，并且可能导致基因组不稳定。
最近的研究报道了一些植物基因本身可以被用作转化标记。这类植物标记的实例包括 Pga22(Zuo 等，Curr Opin Biotechnol. 13 173 — 80, 2002)、CkiI (Kakimoto, Science 274 :982 — 985，1996)和 Esrl (Banno 等，Plant Cell 13:2609 — 18,2001)。然而，所有这些基因都引起细胞分裂素反应，这赋予了转基因植物不良的表型。此外，一旦通过上述方法中的任何一种进行了转化，就将仍然需要除去这类植物标记。
转化植物的可选择的方法也是基于外源遗传元件的体外重组，并依赖于在大肠杆菌(E. coli)中用于保养的细菌质粒序列，其中的部分序列是在转化过程中共整合的。用外源DNA转化植物的这类方法的实例描绘在美国专利Nos. 5，591，616,6, 051，757、 4，945，050,6, 143，949,4, 743，548,5, 302，523、和 5，284，253。
通过省略再生前的任何筛选步骤也可能获得无标记的转基因植物。这种方法的缺点是通过这种方法产生的绝大多数事件将代表未转化植物或嵌合植物，因为它们通常不是来源于单个转化的植物细胞。使用无标记物的步骤来鉴定在所有细胞中都含有相同的DNA 插入片段的转基因植物是极其困难和费力的。
因此，需要改善植物使其超过可通过传统的育种杂交和常规的遗传基因工程技术得到的植株是非常重要的，其不依赖于将未知的或外源核酸插入到植物基因组中。相应地， 本发明提供了用于精确修饰植物自身的遗传材料的方法和组合物。因此，发明的“精确育种”策略不诱导不受欢迎的表型并且不将未知的或外源的核酸引入植物基因组中。
概述
本发明提供遗传性地提高植物的营养价值和农艺特性而不将未知的或外源DNA 永久地或稳定地掺入到该植物基因组中的方法。根据本发明的方法，从期望的植物种或者从与期望的植物性亲和的植物种中分离特异性的、熟知的核酸、基因元件以及基因，经过修饰，接着重新插回到所期望的植物种的基因组中。该修饰可能需要突变分离的核酸序列，删除分离核酸的部分序列，或者简单地将分离的核酸连接到另一个多核苷酸上，例如将分离的核酸亚克隆到质粒载体中。
相应地，通过本发明的方法学产生的转基因植物不具有包含任何外源物种核酸的基因组。因此，本发明的方法生产的转基因植物其基因组不包含非植物种的启动子，不包含非植物种的终止子，不包含非植物种的5’ 一非翻译区，不包含非植物种的3’ 一非翻译区， 不包含非植物种的标记基因，不包含非植物种的调节元件，不包含非植物种的基因，以及不包含从非植物种的基因组中获得的任何其它多核苷酸。
因此，本发明提供一种生产稳定的转基因植物的方法，该植物显示不被非转化植物表现的修饰表型，包括(a)用期望的多核苷酸转化植物细胞；(b )从转化的细胞中生长植物；和(()筛选用所述期望的多核苷酸稳定转化的显示新表型的植物，其中从相应的非转化植物细胞中长出的植物不显示该新表型。优选地，期望的多核苷酸基本上由下列序列构成(i)核酸序列，其分离自和/或天然属于植物细胞基因组，或属于相同种的其它植物，或者是分离自和/或天然属于与分离的植物细胞所来源的植物性亲和的植物种的基因组；和(ii)至少一种DNA序列，其是边缘样序列，其具有一序列，该序列天然属于所述植物细胞的基因组或天然属于相同种植物细胞的基因组，或者天然属于与分离的植物细胞所来源的植物性亲和植物的序列，其中边缘样序列能够将期望的多核苷酸稳定地整合到所述植物细胞的基因组中。
本发明的优选的方法需要产生显示不被非转化植物所表现的修饰表型的转基因植物，包括(a)用土壤杆菌感染外植体,该土壤杆菌(Agrobacterium)带有(i) 一种“P — DNA”载体，其含有期望的转基因植物天然具有的多核苷酸，和(ii ) 一种含有包含选择性标记基因表达盒的“LifeSupport”载体；(b)选择选择性标记基因短暂表达的时间，优选I 一 10天，3 — 7天，或者4 一 5天；(c)将外植体转移到再生培养基中以允许形成嫩枝；(d)筛选众多嫩枝以确定哪些嫩枝在其基因组中包含期望的多核苷酸的至少一个拷贝，以及在那些嫩枝中哪些枝条在其基因组中不含有任何外源核酸，如选择性标记基因4P(e)允许在其基因组中含有期望的多核苷酸而不含有任何标记基因DNA的嫩枝长成整个植株，其中所得到的整个植物显示修饰表型，该表型不被从相同种的非转化植物细胞中长出的植物所显示
根据这样的方法，期望的多核苷酸(i)基本上仅由分离自和/或天然属于植物细胞种或其性亲和种的基因组的元件构成；(ii)包括至少一种边缘元件，该元件具有一个分离自或者天然属于植物细胞种或其性亲和种基因组的序列，该序列能够将期望的多核苷酸稳定地整合到暴露于载体的植物细胞的基因组中；和(i i i )被稳定地整合到转化植物的基因组中；其中该方法不将非植物种或外源DNA整合到转化植物的基因组中。
此外，可以使用任何选择性标记基因作为成功转化的指示物。例如，可以使用“新霉素磷酸转移酶”标记基因，或者使用“hpt”标记基因以分别赋予对氨基糖苷类抗生素、 卡那霉素和潮霉素的抗性。其它的标记基因包括“bar”标记基因，其赋予对除草剂膦丝菌素的抗性；“DHFR”标记基因，其赋予对氨甲蝶呤的抗性；以及“ESPS”标记基因，其赋予对 Round - up除草剂的抗性。在现有技术中公知如何进行这类标记基因的表达以确定标记基因是否已经在转化植物细胞的基因组中稳定地表达。相应地，技术人员知道如何跟踪标记基因的表达以确定标记基因仅在转化植物细胞中短暂地表达。
在本发明的另一个方面中，提供制备稳定地转化植物的方法，包括以下步骤(I)鉴定靶基因；(2)分离与所述靶基因相关的前导或尾随DNA序列；(3)可任选地修饰所述分离的前导或尾随DNA; (4)可操作地将所述的前导或尾随DNA连接到天然的调节元件上以形成表达盒；(5)将所述的表达盒插入位于双载体上的P — DNA中,其中该双载体也携带一个可操作的细胞分裂素基因，使得通过细胞分裂素基因的表达而检测的外源性的其它双载体序列意外插入；(6)将修饰的双载体引入土壤杆菌中；(7)使用LifeSupport介导的转化将重排的天然DNA稳定地整合到植物细胞的基因组中；(8)再生含有重排的天然DNA的植物细胞；(9)弃去显示过度生产细胞分裂素表型并且不能完全再生的植物；以及(10)维持与未转化植物难区分的期望植物用于进一步分析。
在本发明的另一个方面中，提供修饰所选植物种的性状表达的方法。在一个实施方案中，该方法包括(I)鉴定将被修饰的性状；(2)构建基本上由分离自或天然属于所选植物种的遗传元件构成的重组DNA分子，其中当重组的DNA分子被整合到所选植物种的基因组中时，修饰了转化植物种的性状表达；(3)使用LifeSupport介导的转化将重组的DNA 分子稳定地整合到所选植物种的细胞中；以及(4)鉴定显示性状的表达已被修饰的转化植株。
在一个优选的实施方案中，通过用两种不同的土壤杆菌(Agrobacterium)菌株感染外植体将期望植株的天然多核苷酸插入期望植物的基因组中。第一个土壤杆菌菌株能够将天然DNA从P — DNA载体转移到植物细胞中；第二个菌株能将带有选择性标记基因的表达盒的T 一 DNA转移到植物细胞中。后一种载体的实例包括这里描述的所谓“LifeSupport” 载体。通过优选能短暂表达标记基因I 一 10天、3 — 7天，或4 一 5天的植株，并随后将外植体转移到再生培养基中，获得众多事件，其中部分事件代表含有至少一个多核苷酸拷贝的植株，但是缺乏T - DNA或标记基因的任何拷贝。
在另一个实施方式中，使用单一的土壤杆菌菌株，其带有P — DNA载体和 LifeSupport载体,其中P — DNA载体在P — DNA边缘样序列之间具有期望的天然兴趣基因或多核苷酸，LifeSupport载体含有标记基因的。标记基因可以，或者不可以在P — DNA边缘样序列、T - DNA边缘序列，或其它T - DNA样边缘序列之间插入。
因此,在另一个优选的实施方案中，P — DNA载体含有至少两个表达盒，其中一个包含由天然启动子驱动的天然的可筛选的或可选择的标记基因，然后是天然终止子。
通过优选选择表达至少2天，以及更优选至少5天的天然标记基因表达，随后将外植物转移到再生培养基中，获得众多事件，其代表含有至少一个拷贝的引入的DNA被稳定地整合到它们的基因组中的植株。在优选的实施方案中，植物来源的标记基因编码5 —烯醇丙酮酸一 3 —憐酸莽草酸(5 — enolpyruvul 一 3 — phosphoshikimic acid)合酶或色氨酸脱羧酶突变体。在更优选的实施方案中，选择性标记物编码耐盐性。在最优选的实施方案中，耐盐性基因具有SEQ ID 35中显示的核苷酸序列，并在马铃薯中用于选择转化事件。在另一个实施方案中，经过修饰的性状表达的特点是表达增加、表达降低或不能检测的表达的增加。
在本发明的另一个方面中，提供通过下列方法制备的植物，(I)鉴定将要被修饰的性状；(2)构建基本上由从所选植物种中分离的遗传元件构成的重组DNA分子，其中当重组的DNA分子被整合到所选植物种的基因组中时，它修饰转化的植物种中该性状的表达；(3)通过LifeSupport介导的转化将重组DNA分子稳定地整合到所选植物种的细胞中；以及(4)鉴定显示经过修饰性状表达的转化植株。
在进一步方面中，提供修饰所选植物种中性状表达的方法。这种方法包括(I)鉴定将被修饰的性状；(2)构建基本上由下列部分构成的重组DNA分子(a)从所选植物种中分离的遗传元件，其中当遗传元件被整合到所选植物种的基因组中时，它修饰转化植物种中该性状的表达；和(13)从相同的植物种中分离的选择性标记基因；(3)通过LifeSupport 介导的转化将重组DNA分子稳定地整合到所选植物种的细胞中；(4)检测选择性的标记基因；以及(5)鉴定显示经过修饰性状表达的转化植株。
在一个另外的方面中，提供显示性状表达经过修饰的植物。在一个实施方案中，将重组DNA分子稳定地整合到该植物的基因组中，其中该DNA分子基本上由从相同种或从与该种性亲和的植物中分离的遗传元件构成，其中该重组DNA分子修饰性状的表达。
在本发明的另一个方面中，提供被称作“植物一DNA”(“P — DNA”)的分离的核苷酸序列。在一个优选的实施方案中，该P - DNA本身缺乏任何基因或其部分，并用末端T -DNA “边缘样”序列来描绘，它与任何烈性土壤杆菌菌株的T - DNA边缘核苷酸序列有至少 50 %，至少75 %，至少90 %或者至少95 %的序列同一性，其支持将整个P — DNA从土壤杆菌高效转移到植物细胞。
在一个优选的实施方案中，“边缘样”序列促进和便于与其相连的多核苷酸的整合。在另一个优选的实施方案中，每个修饰的P - DNA的末端序列的长度为5 - 100碱基对、10 - 80碱基对、15 - 75碱基对、15 — 60碱基对、15 — 50碱基对、15 — 40碱基对、 15 一 30喊基对、16 — 30喊基对、20 — 30喊基对、21 — 30喊基对、22 — 30喊基对、23 — 30碱基对、24 - 30碱基对、25 — 30碱基对、或者26 — 30碱基对。更优选地，边缘样序列的长度为20和28个核苷酸。
在优选的实施方案中，本发明的P — DNA左边和右边的边缘序列是分离自和/或天然属于将被修饰的植物的基因组，并且核苷酸序列不与任何已知的土壤杆菌(Agrobacterium)来源的T 一 DNA的边缘序列相同。因此，在一个实施方案中，P 一 DNA边缘序列可能具有 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、或更多个不同于土壤杆菌种，如根癌农杆菌或发根植物单胞菌(Agrobacterium rhizogens)T 一 DNA边缘序列的核苷酸。或者，在另一个实施方案中，本发明的P — DNA边缘或边缘样序列与土壤杆菌种，如根癌农杆菌或发根植物单胞菌(Agrobacterium rhizogens)的T 一 DNA边缘序列具有至少95%、至少90%、至少80%、至少75%、至少70%、至少60%或至少50%的序列同一'I"生。更优选地，天然植物的P — DNA边缘序列与土壤杆菌(Agrobacterium)的T 一 DNA 边缘序列具有高于或等于 99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、 88%,87%,86%,85%,84%,83%,82%,81 %,80%,79%,78%,77%,76%,75%,74%, 73%、72%、71%、70%、69%、68%、67%、66%、65%、64%、63%、62%、61%、或 60% 的核苷酸序列同一性。
在一个优选的实施方案中，可从植物基因组中分离边缘样序列，接着进行修饰或者突变以改变效率，通过该效率能够将核苷酸序列整合到另一个核苷酸序列中。在另一个实施方案中，可在本发明的边缘样序列内添加或者掺入其它的多核苷酸序列。因此，在另一个实施方案中，可修饰P — DNA的左边缘或P — DNA的右边缘以使其具有5’ 一和3’ 一多克隆位点或者另外的限制性酶切位点。在进一步的实施方式中，可修饰P — DNA边缘序列以提高伴随载体的主链DNA不被整合到植物基因组中的可能性。
在一个甚至更优选的实施方案中，通过在聚合酶链反应中使用简并引物而从任何植物中分离P - DNAs0在一个优选的实施方式中，P - DNA来自马铃薯，用25个碱基对的末端来描绘，该末端与常规的T - DNA边缘序列分别有80和88%的同一性，具有SEQ ID NO. I显不的核苷酸序列。在另一个最优选的实施方案中，P — DNA来源于小麦,用25个碱基对的末端来描绘，该末端与常规的T - DNA边缘分别有72%和92%的同一性，含有SEQ ID NO. 34中显示的核苷酸序列。
可以对这样的P - DNA进行修饰以使其包含位于边缘样序列之间的其它多核苷酸。在一个优选的实施方案中，经过修饰的P — DNA在5’ 一到3’ 一方向上基本上由促进 DNA转移的第一个边缘样序列、启动子、可操作地连到启动子上的期望的多核苷酸、终止子以及也促进DNA转移的第二个边缘样序列构成。在一个另外的实施方案中，期望的多核苷酸代表在正义和/或反义方向上的前导序列、尾随序列或者基因的一个或几个拷贝。在更优选的实施方案中，修饰的P — DNA含有突变PPO基因和转化酶抑制剂基因两者的表达盒。
因此，在优选的实施方案中，期望的多核苷酸包括前导序列的正义和反义序列。在更优选的实施方案中，前导序列与所选植物种细胞的内在基因有关。在更优选的实施方案中，如导序列与从下列基因构成的组中选出的基因有关PPO基因、Rl基因、L或H型α甸聚糖磷酸化酶基因、UDP葡萄糖葡糖基转移酶基因、HOSl基因、S —腺苷高半胱氨酸水解酶基因、II类肉桂酸一 4 一羟化酶基因、肉桂酰一辅酶A还原酶基因、肉桂酰醇脱氢酶基因、 咖啡酰辅酶A O—甲基转移酶基因、肌动蛋白解聚因子基因、Nin88基因、Lol p 5基因、变应原基因、P450羟化酶基因、ADP—葡萄糖焦磷酸化酶基因、脯氨酸脱氢酶基因、内一 1，4 一 β 一葡聚糖酶基因、玉米黄质环氧酶基因、以及I 一氨基环丙烷一 I 一羧酸合酶基因。
在另一个优选的实施方案中，期望的多核苷酸包括尾随序列的正义和反义序列。 在优选的实施方案中，尾随序列与从下列基因构成的组中选出的基因有关ΡΡ0基因、Rl基因、L或H型α葡聚糖磷酸化酶基因、UDP葡萄糖葡糖基转移酶基因、HOSl基因、S 一腺苷高半胱氨酸水解酶基因、II类肉桂酸一 4 一羟化酶基因、肉桂酰一辅酶A还原酶基因、肉桂酰醇脱氢酶基因、咖啡酰辅酶A O —甲基转移酶基因、肌动蛋白解聚因子基因、Nin88基因、 Lol P 5基因、变应原基因、P450羟化酶基因、ADP—葡萄糖焦磷酸化酶基因、脯氨酸脱氢酶基因、内一 I，4 一 β 一葡聚糖酶基因、玉米黄质环氧酶基因、以及I 一氨基环丙烧一 I 一羧酸合酶基因。
在优选的实施方案中，期望的多核苷酸，如基因分离自和/或天然属于将被转化的植物。在另一个优选的实施方案中，修饰或突变期望的多核苷酸。在一个实施方案中， 分离的多核苷酸的突变可能使得期望的多核苷酸与其未突变型有高于或等于99%、98%、 97%,96%,95%,94%,93%,92%,91 %,90%,89%,88%,87%,86%,85%,84%,83%, 82%,81 %,80%,79%,78%,77%,76%,75%,74%,73%,72%,71 %,70%,69%,68%, 67%、66%、65%、64%、63%、62%、61%、或 60% 的异化。
在本发明优选的实施方案中，位于P —DNA内的表达盒的启动子是组成型启动子。 在更优选的实施方案中，组成型启动子是马铃薯的泛素一 3基因的启动子。在甚至更优选的实施方案中，组成型启动子是马铃薯的泛素一 7基因的启动子。
在另一个实施方案中，位于P — DNA内的表达盒的启动子是可调节的启动子。在更优选的实施方案中，可调节的启动子对温度敏感。在甚至更优选的实施方案中，可调节的启动子是ci21A启动子或C17启动子,每个都是从马铃薯中分离(Schneider等，Plant Physiol. 113 :335 — 45，1997 ；Kirch 等，Plant Mol Biol 33 :897 — 909，1997)出来的。
在另一个实施方案中，可以临时方式调节位于P — DNA内的表达盒的启动子。在优选的实施方案中，启动子是rbcS启动子(Ueda等，Plant Cell I :217 — 27，1989)。
在另一个实施方案中，通过脱落酸、创伤、茉莉酮酸甲酯或赤霉酸中的任何一个调节位于P — DNA内的表达盒的启动子。在进一步的实施方案中，这种启动子是选自Rab 16A 基因的启动子、α —淀粉酶基因的启动子或Pin2基因的启动子的启动子。
在另一个实施方案中，位于P — DNA内的表达盒的启动子是组织特异性的启动子。 在特别优选的实施方案中，这种启动子是从马铃薯中分离的GBSS启动子。
在一个实施方案中，本发明提供能够在大肠杆菌(E. coli)和土壤杆菌两者中复制，并含有P - DNA或经过修饰的P — DNA的P — DNA载体。在优选的实施方案中，这种载体在其主链中也含有细胞分裂素的基因表达盒以便能够选择抗主链整合的事件。
在另一个优选的实施方案中，期望的核苷酸序列进一步包括间隔元件。在更优选的实施方案中，间隔元件是Ubi内含子序列或GBSS间隔序列。
在另一个优选的实施方案中，期望的核苷酸序列包括编码功能失活蛋白的突变的天然基因，如果在转基因植物中表达，其降低该蛋白的全部活性。在更优选的实施方案中， 这种突变的基因编码缺乏结合铜的结构域的功能失活的多酚氧化酶。
在另一个优选的所实施方案中，期望的核苷酸序列包括编码功能上有活性的蛋白的天然基因。在更优选的实施方案中，这种基因编码与烟草液泡转化酶抑制剂同源的蛋白。
在另一个实施方案中，位于P — DNA内的表达盒的终止子是Ubi3终止子序列或所选植物种基因的3’ 一非翻译区。
在本发明的另一个方面，提供一种修饰靶植物细胞的方法。在一个实施方案中，该方法包括(1)使用LifeSupport介导的转化将修饰的P — DNA插入到祀植物细胞中至少一个细胞的基因组中；和(2)观察在靶植物细胞中是否有表型的改变；其中在修饰的P -DNA中启动子转录与天然基因相关的正义和/或反义的非翻译序列以减少该天然基因的表达，因而修饰靶植物细胞。在另一个优选的实施方案中，在修饰的P - DNA中启动子转录一种基因使得在靶植物细胞中过度表达该基因。
在另一个方面，提供一种制备含有修饰P - DNA的所选植物种的转基因植物细胞的方法。该方法包括用P - DNA载体和LifeSupport载体共转染所选植物种的植物细胞， 其中LifeSupport载体包括两侧是T 一 DNA的左边缘和T 一 DNA的右边缘的标记基因和插入到载体主链中的突变型virD2基因，选择短暂地表达标记基因的植物细胞，以及分离含有整合到其基因组中的修饰P - DNA但不含有来自LifeSupport载体的任何核苷酸的植物细胞。在优选的实施方案中，该标记基因赋予抗卡那霉素的抗性。在最优选的实施方案中在卡那霉素抗性基因之后是酵母ADH终止子。
在优选的实施方案中，作为转化目标的所选植物种的植物细胞在培养物中。在另一个优选的实施方案中，作为转化目标的所选植物种的植物细胞在植物内。
本发明也提供所选种的植株，其包含至少一个其基因组含有修饰的P - DNA的细胞。在优选的实施方案中，该修饰的P — DNA在5 ’ 一到3 ’ 一方向上基本上由其功能象T 一 DNA边缘序列并且随后跟以P - DNA序列的第一个末端、启动子、可操作地连接到启动子和终止子两者上的期望的核苷酸序列、以及用第二末端描绘的另外的P - DNA序列构成。在另一个实施方案中，期望的多核苷酸代表在正义和/或反义方向上的前导序列、尾随序列和基因的一个或几个拷贝。
在另一个实施方案中，设想包含至少一个其基因组含有修饰的P - DNA的细胞的植物。
在本发明的另一个方面，提供减少所选植物种中的基因表达的方法。该方法包括用P — DNA载体对来自所选植物种的植物细胞进行LifeSupport介导的转化，其中将这种载体的修饰的P - DNA稳定地整合到所述植物细胞的基因组中。在本发明的另一个方面， 修饰的P - DNA包括期望的能减少来自所选植物种的内源基因表达的多核苷酸。
在本发明的另一个方面，可以诱变所选植物种的天然基因并使用本发明的方法重新引入到植物中。优选地，使用P - DNA载体将突变基因，例如突变的PPO基因整合到植物细胞的基因组中。
本发明也提供减少所选的植物种中多酚氧化酶基因的不希望要的表达的方法。在优选的实施方案中，该方法包括将修饰的P - DNA整合到所选植物种的基因组中，该修饰的 P - DNA仅由从所选植物种或者从与所选植物种性亲和的植物中分离的核苷酸序列构成， 在5’ 一到3’ 一方向上基本上由功能象T - DNA边缘序列并且随后跟以侧翼P - DNA序列的第一个P — DNA末端；启动子；期望的核苷酸，其是与特异性的PPO基因相关的正义方向的尾随核苷酸序列；特异性的PPO基因尾随核苷酸序列的反义方向序列；终止序列，以及用第二末端的描绘其功能象T 一 DNA边缘的另外的P — DNA序列构成，其中启动子产生能减少特异性的PPO基因表达的双链RNA分子，因此减少植物的特异组织中的黑斑伤痕。在另一个实施方案中，从先于特异性的PPO基因的5’一非翻译区中获得前导核苷酸序列的正义和反义方向的核苷酸序列。在进一步的实施方案中，可以通过另一个多核苷酸序列，在这里称作内含子或“间隔区”，将与PPO基因相关的正义和反义方向的前导或尾随序列分离。在优选的实施方案中，前导或尾随序列与马铃薯PPO基因相关。在更优选的实施方案中，前导或尾随序列与在马铃薯块茎中表达的马铃薯PPO基因相关。在最优选的实施方案中，前导或尾随序列与在马铃薯的块茎中除了表皮之外的所有部分中都表达的马铃薯PPO基因相关。
本发明也提供在所选植物种的块茎中减少丙烯酰胺生产、贮藏期间诱导发芽、磷酸盐蓄积、和/或冷诱导变甜的方法。
在优选的实施方案中，该方法包括用修饰的P - DNA对所选植物种进行 LifeSupport介导的转化,该修饰的P — DNA仅包括从所选植物种或从与所选植物种性亲和的植株中分离的核苷酸序列，在5’ 一到3’ 一方向上基本上由具有左边缘样序列的第一个 P - DNA、启动子、期望的核苷酸序列，其是来自与Rl基因相关的前导序列的正义方向的核苷酸序列、这个前导序列的反义方向序列、终止序列、以及右边缘样序列构成。一旦表达，产生能减少Rl基因表达的前导一 RNA双链体，因而在植物中减少冷诱导的变甜。在另一个实施方案中，期望的正义和反义方向的核苷酸序列代表与Rl基因相关的尾随序列。在进一步的实施方案中，可以通过另一个多核苷酸序列，这里称作内含子或“间隔区”，将与Rl相关的正义和反义方向的前导序列或尾随序列分离。
在另一个优选的实施方案中，该方法包括用修饰的P - DNA对所选植物种进行 LifeSupport介导的转化，其中该修饰的P — DNA与上面描述的P — DNA相似，但含有与α 葡聚糖磷酸化酶基因相关的前导或尾随序列。
在另一个优选的实施方案中，该方法包括用修饰的P - DNA对所选植物种进行 LifeSupport介导的转化，其中该修饰的P — DNA含有转化酶抑制剂基因。
在另一个优选的实施方案中，使用在前面段落中描述的修饰的P - DNA以减少美拉德反应的额外的不想要的产物的蓄积，其发生在富含碳水化合物的食物，如马铃薯块茎的加热期间。这些不想要的产物包括一直与各种病理学相关的高级糖化末端产物(AGEs)。
本发明也提供提高植物和粮食作物贮藏器官中抗性淀粉水平的方法。
在优选的实施方案中，该方法包括用修饰的P - DNA对所选植物种进行 LifeSupport介导的转化，其中该修饰的P — DNA含有与淀粉分支酶I和II基因有关的尾随序列的融合的表达盒。
本发明还提供减少所选植物种中的黑斑擦伤的方法，包括(i)将用边缘样序列描绘的P — DNA整合到所选植物种的基因组中，其中P - DNA仅包含天然属于或分离自所选植物种的多核苷酸，或者包含天然属于或分离自与所选植物种性亲和的植物种的多核苷酸， 其中P —DNA在5’ 一到3’ 一方向上基本上由启动子、PPO基因的正义方向的前导核苷酸序列、前导核苷酸序列的反义方向序列以及终止序列构成，其中所述的启动子产生双链RNA 分子，其中所述的双链RNA分子造成内源性PPO基因表达减少，因此减少植物中的黑斑擦伤。
本发明还提供减少所选植物种中的黑斑擦伤的方法，包括将用边缘样序列描绘的 P - DNA整合到所选植物种的基因组中，其中P - DNA仅包含天然属于或分离自所选植物种的核苷酸序列，或者包含天然属于或分离自与所选植物种性亲和的植物种的多核苷酸， 其中P —DNA在5’ 一到3’ 一方向上基本上由启动子、PPO基因的正义方向的尾随核苷酸序列、尾随核苷酸序列的反义方向序列以及终止序列构成，其中所述的启动子产生双链RNA分子，其中所述的双链RNA分子造成PPO基因表达减少，因此减少植物中的黑斑擦伤。
本发明还提供减少所选植物种中的冷诱导变甜的方法，包括将用边缘样序列描绘的P — DNA整合到所选植物种的基因组中，其中P - DNA仅包含从所选植物种中分离的核苷酸序列，或者包含天然属于或分离自与所选植物种性亲和的植物种的多核苷酸，其中 P —DNA在5’ 一到3’ 一方向上基本上由启动子、与Rl基因相关的正义方向的前导核苷酸序列、前导核苷酸序列的反义方向序列以及终止序列构成，其中所述的启动子产生双链RNA 分子，其中所述的双链RNA分子减少Rl基因的表达，因此减少植物中冷诱导的变甜。
本发明还提供减少所选植物种中的冷诱导变甜的方法，包括将用边缘样序列描绘的P — DNA整合到所选植物种的基因组中，其中P — DNA仅包含从所选植物种中分离的核苷酸序列，或者由天然属于或分离自与所选植物种性亲和的植物种的多核苷酸，其中P - DNA 在5’ 一到3’ 一方向上基本上由启动子、与Rl基因相关的正义方向的尾随核苷酸序列、尾随核苷酸序列的反义方向序列以及终止序列构成，其中所述的启动子产生双链RNA分子， 其中所述的双链RNA分子减少Rl基因的表达，因此减少植物中冷诱导的变甜。
本发明也提供包含主要在块茎中表达的马铃薯GBSS基因和马铃薯蛋白酶抑制剂基因的启动子的分离的核苷酸序列。分离的启动子分别具有SEQ ID NO. :6和SEQ ID NO. 40中所显示的核苷酸序列。
在一个方面，本发明提供修饰所选植物性状的方法，包括
a.用期望的多核苷酸稳定地转化所选植物的细胞，其中期望的多核苷酸基本上由所选植物、同种植物或者与所选植物性互交可孕的植物的天然核酸序列构成，
b.从转化的植物细胞中获得稳定转化的植物，其中转化的植物含有稳定整合到基因组中的期望的多核苷酸，并且其中期望的多核苷酸修饰该性状。
在优选的的实施方案中，该方法进一步包括用在植物细胞中短暂表达的选择性标记基因共转染植物细胞，鉴定转化的植物细胞，从转化的植物细胞中获得转化的植物，其中没有将选择性标记基因稳定地整合，而将期望的多核苷酸稳定地整合到基因组中。
在优选的实施方案中，期望的多核苷酸包括P - DNA、GBSS启动子、Ubi7启动子、 Ubi3启动子、PIP启动子、修饰的PPO基因、转化酶抑制剂基因、耐盐性基因、与Rl相关的前导序列、与磷酸化酶相关的前导序列、与Rl相关的尾随序列、与SBE相关的尾随序列、Ubi内含子、GBSS间隔区、UbiT。
在另一个优选的实施方案中，本发明的“植物”是单子叶植物，从由小麦、草皮、草坪草、谷类植物、玉米、水稻、燕麦、小麦、大麦、高梁、兰花、蝴蝶花、百合、洋葱、香蕉、甘蔗、 高梁、以及棕榈构成的组中选出。
在另一个实施方案中，本发明的“植物”是双子叶植物，从由avacado、马铃薯、烟草、番茄、甜菜、花茎甘蓝、木薯、甘薯、胡椒、棉花、一品红、豆科植物、苜蓿、大豆、胡萝卜、草莓、莴苣、橡树、枫树、胡桃、玫瑰、薄荷、南瓜、雏菊、以及仙人掌构成的组中选出。
在另一个实施方案中，通过土壤杆菌介导的转化来转化本发明方法的植物和植物细胞。优选地，土壤杆菌介导的转化依赖于使用至少一种双载体。在另一个实施方案中，土壤杆菌介导的转化方法使用第一双载体和第二双载体。在优选的实施方案中第一个双载体含有期望的多核苷酸，第二双载体含有选择性的标记基因，其中选择性的标记基因可操作地连接到启动子和终止子上。
根据本发明的方法，被修饰的性状是从下列性状构成的组中选出提高的健康和营养特性、改善的贮藏性、提高的产量、增强的耐盐性、增强的重金属耐受性、提高的干旱耐受性、提高的疾病耐受性、提高的昆虫耐受性、提高的水应力耐受性、增强的冷和霜冻耐受性、增加颜色、增加甜味、提高活力、改善口味、改善质地、降低磷酸盐含量、提高发芽率、提高微营养摄入、改善淀粉组成、提高花的寿命。
本发明也包括通过本发明方法制备的植物。
在另一个方面，本发明提供修饰所选植物性状的方法，包括
(a)鉴定要修饰的性状；
(b)构建第一个多核苷酸，其基本上由从所选植物、同种植物、或与所选植物性互交可孕的植物中分离的天然遗传元件构成，其中天然的遗传元件能够修饰控制该性状的基因的表达；
(C)构建包含可操作地连接到启动子和终止子上的选择性标记基因的第二多核苷酸；
(d)用第一和第二多核苷酸共转染来自所选植物的植物细胞；
(e)选择选择性标记基因的短暂表达；
(f)对用第一个多核苷酸稳定转化但是不含有整合到基因组中的第二个DNA分子的植物细胞进行筛选；和
(g)从显示该性状的表达经过修饰的转化的植物细胞中获得稳定转化的植物。
在一个实施方案中，遗传元件包括启动子、兴趣序列、终止子、增强子、内含子、间隔区或调节元件中的至少一个。在另一个实施方案中，权利要求4的方法，其中在第二个多核苷酸转染前，用第一个多核苷酸转染植物细胞，或者反过来。
在一个实施方案中，兴趣序列是基因。在另一个实施方案中，该基因是突变的或是野生型的多酚氧化酶基因或者是突变的或野生型的Rl基因。在一个另外的实施方案中，兴趣序列是前导序列或尾随序列，其中前导或尾随序列代表植物细胞天然基因的上游或下游序列。在另一个实施方案中，兴趣序列包括可操作地连接到反义前导序列上的正义方向的前导序列。在另一个实施方案中，兴趣序列包括可操作地连接到反义尾随序列上的正义方向的尾随序列。在另一个实施方案中，启动子是可诱导的启动子。在另一个实施方案中，终止子是酵母ADH终止子序列。
根据本发明，前导序列构建物在5’ 一到3’ 一方向上包括启动子、正义方向上的前导序列、前导序列的反义序列、以及终止子，其中前导序列构建物的表达产生便于向下调节与其相关的基因表达的双链RNA分子。在一个另外的实施方案中，前导序列与PPO基因、Rl 基因、L型磷酸化酶基因、或者α葡聚糖磷酸化酶基因的编码区相关并位于其上游。
在另一个实施方案中，尾随构建物在5’ 一到3’ 一方向上包括启动子、正义方向上的尾随序列、尾随序列的反义序列、以及终止子，其中尾随序列构建物的表达产生便于向下调节与其联系的基因表达的双链RNA分子。在优选的实施方案中，尾随序列与PPO基因、Rl 基因、L型磷酸化酶基因、或者α葡聚糖磷酸化酶基因的编码区相关并位于其下游。
该方法进一步包括将植物细胞暴露于包含标记元件的第二载体,其中该标记在转化的植物中短暂地表达，并且不被稳定地整合到转化植物的基因组中。在一个实施方案中， 该标记是除草剂的抗性基因、抗生素抗性基因、或ΝΡΤΙΙ。
优选地，通过土壤杆菌介导的转化来转化植物细胞。在一个实施方案中，土壤杆菌介导的转化依赖于使用至少一个双载体。在另一个实施方案中，该土壤杆菌 (Agrobacterium)介导的转化方法使用第一双载体和第二双载体。在一个另外的实施方案中，第一双载体带有第一多核苷酸，第二双载体带有第二多核苷酸。
本发明提供另一个修饰所选植物中基因表达的方法，包括
(a)鉴定功能基因；
(b)构建基本上由从所选植物、与所选植物同种的植物、或者与所选植物性互交可孕的植物中分离的天然遗传元件构成的第一多核苷酸，其中该天然遗传元件能够修饰该基因的表达；
(c)构建包含功能性选择性标记基因的第二多核苷酸；
(d)用第一和第二多核苷酸共转染来自所选植物的植物细胞；
(e)选择选择性标记基因的短暂表达；
(f)筛选用第一个多核苷酸稳定地转化，但不含有整合到基因组中的第二多核苷酸的植物细胞；和
(g)从显示该基因的表达经过修饰的转化植物细胞中获得转化植物。
优选地，通过土壤杆菌介导的转化来转化植物细胞。在一个实施方案中，土壤杆菌介导的转化依赖于使用至少一个双载体。在另一个实施方案中，土壤杆菌介导的转化方法使用第一双载体和第二双载体。在一个另外的实施方案中，第一双载体带有第一多核苷酸， 第二双载体带有第二多核苷酸。
在另一个实施方案中，第一多核苷酸包括P - DNA、GBSS启动子、Ubi7启动子、Ubi3 启动子、PIP启动子、修饰的PPO基因、转化酶抑制剂基因、耐盐性基因、与Rl相关的前导序列、与磷酸化酶相关的前导序列、与Rl相关的尾随序列、与SBE相关的尾随序列、Ubi内含子、GBSS间隔区、UbiT中的至少一个。
在另一个实施方案中，第二多核苷酸包括选择性标记基因、Ω —突变的virD2多核苷酸、codA多核苷酸、以及codA upp融合多核苷酸中的至少一个。
本发明也包括通过这种方法制备的植物。
在一个另外的实施方案中，提供显示与其来源的非转基因植物相比性状的表达经过修饰的转基因植物，其中用基本上由天然的遗传元件构成的期望的多核苷酸稳定地转化转基因植物，该天然的遗传元件从该植物、同种植物、或者与该植物性互交可孕的植物中分离，其中该多核苷酸修饰性状的表达。
在另一个优选的实施方案中，本发明的“植物”是单子叶植物，从由小麦、草皮、草坪草、谷类植物、玉米、水稻、燕麦、小麦、大麦、高梁、兰花、蝴蝶花、百合、洋葱、香蕉、甘蔗、 高梁、以及棕榈构成的组中选出。
在另一个实施方案中，本发明的“植物”是双子叶植物，从由avacado、马铃薯、烟草、番茄、甜菜、花茎甘蓝、木薯、甘薯、胡椒、棉花、一品红、豆科植物、苜蓿、大豆、胡萝卜、草莓、莴苣、橡树、枫树、胡桃、玫瑰、薄荷、南瓜、雏菊、以及仙人掌构成的组中选出。
在另一个实施方案中，性状从下列性状构成的组中选出提高的健康和营养特性、 增加的贮藏性、提高的产量、增强的耐盐性、增强的重金属耐受性、提高的干旱耐受性、提高的疾病耐受性、提高的昆虫耐受性、提高的水应力耐受性、增强的冷和霜冻耐受性、增加的颜色、增加的甜味、提高的活力、改善的口味、改善的结构、降低的磷酸盐含量、提高的发芽率、提高的微营养摄入、改善的淀粉组成、提高的花的寿命。
在另一个实施方案中，期望的多核苷酸包括P — DNA、GBSS启动子、Ubi7启动子、 Ubi3启动子、PIP启动子、修饰的PPO基因、转化酶抑制剂基因、耐盐性基因、与Rl相关的前导序列、与磷酸化酶相关的前导序列、与Rl相关的尾随序列、与SBE相关的尾随序列、Ubi内含子、GBSS间隔区、UbiT中的至少一个。
本发明也包括大小在从20到IOObp范围的分离的边缘样核苷酸序列，其与根癌农杆菌的T - DNA边缘序列有52%与96%的序列相同。在优选的实施方案中，分离的核苷酸序列是从单子叶植物中分离的，单子叶植物从由小麦、草皮、草坪草、谷类植物、玉米、水稻、 燕麦、小麦、大麦、高梁、兰花、蝴蝶花、百合、洋葱、香蕉、甘蔗、高梁、以及棕榈构成的组中选出。在另一个实施方案中，核苷酸序列是从双子叶植物中分离的，该双子叶植物从由马铃薯、烟草、番茄、甜菜、花茎甘蓝、木薯、甘薯、胡椒、棉花、一品红、豆科植物、苜蓿、大豆、胡萝卜、草莓、莴苣、橡树、枫树、胡桃、玫瑰、薄荷、南瓜、雏菊、以及仙人掌构成的组中选出。
在另一个实施方案中，分离的核苷酸序列是从马铃薯中分离的，并且具有在SEQ ID NO. 94或95中显示的核苷酸序列。在优选的实施方案中，分离的核苷酸序列与根癌农杆菌的T - DNA边缘序列有52%的序列相同。本发明包括包含这样的核苷酸序列的载体。
本发明也提供制备用期望的多核苷酸稳定转化的植物的方法，包括
(a)从该植物中分离两侧是边缘样序列的P - DNA，其中边缘样序列与根癌农杆菌的T 一 DNA边缘序列有52%至96%的序列同一性；
(b)在P — DNA边缘样序列之间插入期望的多核苷酸以形成P - DNA构建物；和
(c)用P — DNA构建物转化来自该植物的植物细胞；和
(d)从用P - DNA构建物稳定转化的转化植物细胞中重新获得植株。
在一个实施方案中，在由主链整合标记基因构成的载体上携带该P — DNA构建物， 并且选择不含有主链整合标记基因的转化的植物细胞。在另一个实施方案中，该主链整合标记基因是细胞分裂素基因。在另一个实施方案中，不选择显示过量生产细胞分裂素表型的植物枝条。在另一个实施方案中，主链整合标记基因是IPT基因，不选择显示异常表型或者不能产生根的植物枝条。
在一个另外的实施方案中，植物细胞来自单子叶植物，该单子叶植物从由小麦、草皮、草坪草、谷类植物、玉米、水稻、燕麦、小麦、大麦、高梁、兰花、蝴蝶花、百合、洋葱、香蕉、 甘蔗、高梁、以及棕榈构成的组中选出。
在另一个实施方案中，该植物细胞来自双子叶植物，该双子叶植物从由马铃薯、烟草、番茄、甜菜、花茎甘蓝、木薯、甘薯、胡椒、棉花、一品红、豆科植物、苜蓿、大豆、胡萝卜、草莓、莴苣、橡树、枫树、胡桃、玫瑰、薄荷、南瓜、雏菊、以及仙人掌构成的组中选出。
优选地，通过土壤杆菌介导的转化来转化植物细胞。在一个实施方案中，土壤杆菌介导的转化依赖于使用至少一个双载体。在另一个实施方案中，该土壤杆菌介导的转化方法使用第一双载体和第二双载体。在一个另外的实施方案中，第一双载体具有第一多核苷酸，第二双载体具有第二多核苷酸。在一个进一步的实施方案中，第二双载体包括阴性的选择性标记基因和Ω —突变的virD2基因中的至少一个，其中阴性的选择性标记基因是位于 T - DNA右边缘和T - DNA左边缘内，并且其中Ω —突变的virD2基因位于第二双载体的主链内。在优选的实施方案中，第二双载体包括位于T - DNA右边缘和T - DNA左边缘内的阴性选择性标记基因，以及位于第二双载体主链内的Ω —突变的virD2基因。在本发明的一种实施方案中，所述第二双载体包括阴性的选择性标记基因和妨碍整合的基因中的至少一个，其中阴性的选择性标记基因位于T - DNA右边缘序列和T - DNA左边缘序列内，其中妨碍整合的基因位于第二双载体的主链内。
本发明也提供在5’ 一到3’ 一方向上基本上由第一 T — DNA边缘样序列、启动子、 可操作地连接到启动子上的期望的多核苷酸序列、终止子以及第二 T - DNA边缘样序列构成的P - DNA，其中边缘样序列与T - DNA边缘序列具有小于100%的序列同一性。
在优选的实施方案中，T - DNA边缘样序列、启动子、期望的多核苷酸以及终止子都是从相同植物、相同植物种、或性互交可孕的植物中分离出来的。
在另一个实施方案中，P - DNA进而基本上由选择性标记基因构成。
在另一个实施方案中，T - DNA边缘样序列、启动子、期望的多核苷酸、终止子和选择性标记基因都是从相同植物、相同植物种、或性互交可孕的植物中分离。
在另一个实施方案中，P - DNA中的期望的多核苷酸序列是基因编码区的上游或下游序列，其中该上游序列是前导序列，其中下游序列是尾随序列。在这个实施方案中，T -DNA边缘样序列、启动子、前导序列、尾随序列、终止子和选择性标记基因都是从相同植物、 相同植物种、或性互交可孕的植物中分离出来的。
在另一个实施方案中，由本发明提供包含这样的P - DNA构建物的载体。
在另一个实施方案中，启动子是可调节的启动子。在另一个实施方案中，可调节的启动子对温度敏感。在优选的实施方案中，可调节的启动子是小麦wcsl20启动子。在另一个实施方案中，启动子是在时序调控下。在另一个实施方案中，启动子是羧化酶启动子。在进一步的实施方案中，羧化酶启动子是玉米羧化酶启动子。
可以通过脱落酸、创伤、茉莉酮酸甲酯或赤霉酸中的任何一种来调节启动子。在另一个实施方案中，启动子是选自Rab 16A基因启动子、α淀粉酶基因启动子或者pin2基因启动子的启动子。在另一个实施方案中，启动子是组织特异性的启动子。
在一个另外的实施方案中，前导序列是所选植物种细胞的内源基因的5’一非翻译区的一部分。在另一个实施方案中，5’一非翻译区位于基因的起始密码子的上游，其中该基因从由PPO基因、Rl基因、HOSl基因、S —腺苷高半胱氨酸水解酶基因、II类肉桂酸一 4 一羟化酶基因、肉桂酰一辅酶A还原酶基因、肉桂酰醇脱氢酶基因、咖啡酰辅酶A O —甲基转移酶基因、肌动蛋白解聚因子基因、Nin88基因、Lol p 5基因、变应原基因、P450羟化酶基因、ADP—葡萄糖焦磷酸化酶基因、脯氨酸脱氢酶基因、内一 1，4 一 β 一葡聚糖酶基因、玉米黄质环氧酶基因、以及I 一氨基环丙烷一 I 一羧酸合酶基因构成的组中选出。
在另一个实施方案中，尾随序列是位于选自下列基因的终止密码子下游的基因的 3’ 一非翻译区的一部分ΡΡ0基因、Rl基因、HOSl基因、S —腺苷高半胱氨酸水解酶基因、 II类肉桂酸一 4 一羟化酶基因、肉桂酰一辅酶A还原酶基因、肉桂酰醇脱氢酶基因、咖啡酰辅酶A O—甲基转移酶基因、肌动蛋白解聚因子基因、Nin88基因、Lol p 5基因、变应原基因、P450羟化酶基因、ADP—葡萄糖焦磷酸化酶基因、脯氨酸脱氢酶基因、内一 1，4 一 β 一葡聚糖酶基因、玉米黄质环氧酶基因、以及I 一氨基环丙烷一 I 一羧酸合酶基因。
本发明的载体可以进一步包括间隔元件，该间隔元件是Ubi内含子序列或者GBSS间隔区序列。在另一个实施方案中，载体包括终止子，该终止子是Ubi3终止子序列或内源性植物基因的3’ 一非翻译区。
在另一个实施方案中，载体包括可选择性地连接到组成型启动子上的选择性标记基因以及可操作地连接到诱导型启动子上的Cre基因，其中选择性标记基因和Cre基因的两侧是第一重组酶的识别位点和第二重组酶的识别位点。在另一个实施方案中，第一重组酶的识别位点和第二重组酶的识别位点是Iox位点。
在另一个实施方案中，诱导型启动子是温度敏感的启动子、化学诱导的启动子或时序启动子。在另一个实施方案中，诱导型启动子是Ha hspl7. 7G4启动子、小麦wcsl20启动子、Rab 16A基因启动子、α淀粉酶基因启动子、pin2基因启动子、羧化酶启动子。在另一个优选的实施方案中，进一步包括植物来源的标记基因。在另一个优选的实施方案中，植物来源的标记基因是烯醇丙酮酰一 3 —磷酸莽草酸合酶基因。
在本发明的另一个方面，提供了修饰植物细胞的方法，包括将P — DNA序列整合到植物细胞的基因组中，其中该P —DNA在5’ 一到3’ 一方向上基本上由第一 T 一 DNA边缘样序列、启动子、可操作地连接到启动子上的期望的多核苷酸序列、终止子以及第二 T -DNA边缘样序列构成，其中边缘样序列与T - DNA边缘序列有小于100%的序列同一性，其中T - DNA边缘样序列、启动子、期望的多核苷酸序列和终止子都分离自或天然属于植物细胞的基因组，其中期望的多核苷酸包括与植物基因的上游或下游非编码区相关的前导序列或尾随序列的正义和反义序列，其中期望的多核苷酸的表达产生靶向与期望的多核苷酸相关的基因的双链RNA转录本，从而修饰植物细胞。
本发明也包括修饰植物的方法，包括
(i)用本发明的载体转染植物中的至少一个细胞；
(ii)选择表达功能性的选择性标记的细胞；
(iii)分离表达功能性的选择性标记的细胞；
(iii)诱导功能性的Cre基因在分离的细胞中的表达；
(iV)培养分离的细胞；和
(ii)观察培养的细胞的表型；
其中与未转染的植物细胞不同的表型表明靶植物细胞已经被修饰。
在优选的实施方案中，这种方法和本发明的其它方法的选择步骤是通过鉴定抵抗抗生素的细胞而进行的。
在另一个方面，鉴定其基因组含有P — DNA的靶植物细胞的方法，包括用本发明的载体和来源于第二土壤杆菌的载体共转染植物靶细胞，该第二载体包含两侧是T 一 DNA左边缘和T 一 DNA右边缘的标记基因以及Ω —突变的virD2基因，其中将P — DNA整合到植物靶细胞的基因组中，其中没有将来源于第二土壤杆菌的载体的任何部分整合到植物靶细胞的基因组中，在优选的实施方案中，在来源于第二土壤杆菌的载体中的标记是新霉素磷酸转移酶基因。
在另一个方面，提供鉴定其基因组含有整合盒的至少一部分的靶植物细胞的方法，进而包括选择在含卡那霉素的培养基中暂时生长存活的细胞，其中所选择细胞的基因组仅含有整合盒。在一个实施方案中，所述的靶植物细胞在植物内。本发明也包括包含至少一个其基因组含有这样的P - DNA的细胞的植物。
本发明也包括包含至少一个其基因组被人工操作以仅含有植物来源的核酸的细胞的植物，其中该植物的细胞不含有整合到细胞基因组中的外源核酸。所述细胞能够表达植物来源的核酸中的至少一个，该核酸的表达修饰了与植物相关的特性。
本发明也包括包含SEQ ID NO. 93的多核苷酸序列的多核苷酸,其中多核苷酸的长度为20至80个核苷酸。在一个实施方案中，多核苷酸的长度为21至70个核苷酸，22至 50个核苷酸，23至40个核苷酸，或者为24至30个核苷酸。
在另一个方面，本发明包括在SEQ ID NO. 40中所显示的块茎特异性启动子。
本发明也包括基于土壤杆菌的制备不含有稳定地整合在核DNA中的选择性标记基因的转基因植物细胞的方法，包括
a.构建由多核苷酸构成的第一双载体,该多核苷酸基本上由在期望的功能基因的 5’和3’末端可操作地连接到T - DNA边缘或T - DNA边缘样序列上的期望的功能基因构成；
b.构建由在功能性的选择标记基因的5’和3’末端可操作地连接到T - DNA边缘或T 一 DNA边缘样序列上的功能性选择标记基因构成的第二双载体；
c.用下列菌株培育植物细胞
i.带有第一和第二双载体的土壤杆菌菌株；或
ii.带有第一双载体的第一土壤杆菌菌株和带有第二双载体的第二土壤杆菌菌株;
d.选择其中将期望的功能基因整合到植物核DNA中，而没有将选择性的标记基因整合到植物的核DNA中的植物细胞，接着在含有适当选择剂的培养基上培养适当的时间。
在优选的实施方案中，选择性标记基因是除草剂抗性基因或抗生素抗性基因。在另一个优选的实施方案中，抗生素抗性基因是nNPTII基因。在另一个实施方案中，抗生素抗性基因是可操作地连接到泛素一 7基因的启动子和酵母醇脱氢酶I (ADH)基因的终止子上的nptll结构基因。根据这个方法，首先与第一土壤杆菌菌株一起培养植物细胞，接着与第二土壤杆菌菌株一起培养，或者反过来。
在优选的实施方案中，第一双载体还包括双整合标记基因，该基因可用于检测用双载体主链序列稳定转化的植物细胞。在另一个实施方案中，双载体整合标记基因从由除草剂抗性基因、抗生素抗性基因或NPTII构成的组中选出。在另一个实施方案中，第二双载体进而包括在细菌和胞嘧啶脱氨酶(codA)和尿嘧啶磷酸核糖基转移酶(upp)的基因之间的基因融合，该基因融合在T 一 DNA或T 一 DNA边缘样序列之间插入，将植物细胞暴露于 5 一氟胞嘧啶，接着与第一和第二土壤杆菌菌株一起培养以便选择抗那些用第二双载体转化的植物细胞。
在另一个实施方案中，第二双载体还包括减少主链整合的可能性的基因。在一个实施方案中，这样的基因是Ω —突变的virD2基因，其中Ω —突变的virD2基因减少选择性标记基因整合到植物的核DNA中的频率。
本发明也包括包含从马铃薯中分离的GBSS启动子的分离的核苷酸序列。在优选的实施方案中，这个分离的核苷酸序列具有SEQ ID. NO. 6或13的核苷酸序列。
附图
的简要描述
图I.在本发明中使用的一些P — DNA载体的图示说明。P — DNA区用灰盒显示。“ipt”等于ipt基因的表达盒;“npt”等于nptll基因的表达盒;“mPP0”等于修饰的PPO 基因的表达盒；“INH”等于转化酶抑制剂基因的表达盒；“⑶S”等于⑶S基因的表达盒； “LPP0”等于与PPO基因有关的前导序列的正义和反义拷贝的表达盒；“LPH”等于与磷酸化酶基因有关的前导序列的正义和反义拷贝的表达盒；“Alf”等于马铃薯Alfin同系物的表达盒。详细描述见正文。
图2.无基因的表达盒。
图3.马铃薯和烟草转化酶抑制剂蛋白的序列对比。“St”等于马铃薯；“Nt”等于烟草。
图4.与各种PPO基因相关的尾随序列的对比。
图5.在本发明中使用的一些LifeSupport载体的图示说明。“codA”是codA基因的表达盒；“codA :upp”是融合至Ij upp上的codA基因的表达盒；“ QvirD2”是Ω virD2基因的表达盒。
优选实施方案的详细描述
本发明的“精确育种”策略改善植物和农作物的农艺性状、营养价值以及健康特性，不将未知的核酸、或外源物种的核酸引入植物种基因组中，并且不产生不想要的表型或有害的副作用。
因此，本发明提供转基因植物以及制备这样植物的方法，该方法不将非植物种的核酸整合到该植物的基因组中。核酸、启动子、调节元件、其它非编码的基因序列、标记、多核苷酸、以及整合到所选植物的基因组中的基因优选地都是从将被转化的植物、将被转化的相同种的植物或者与被转化植物性互交可孕的植物中分离出来。根据这里描述的方法， 这样的“天然”核酸可被诱变、修饰或与其它天然核酸共同加入表达盒中，并重新整合到所选植物的基因组中。相应地，仅使用所选植物自己的核酸，或使用与所选植物性亲和植物的核酸来改变转基因植物的基因型和表型。
为了便于这种转基因植物的生产，本发明利用不是在土壤杆菌介导的转化中使用的所有T 一 DNA载体实际上都被整合到植物基因组中的事实，即，尽管载体可能被植物细胞摄入，但是可能不发生实际的整合事件。根据本发明，可以使用这样的载体将选择性标记基因带到植物细胞中。然后通过测定标记基因表达了多长时间来筛选植物细胞，以确定标记是否已经被稳定地整合到植物基因组中。相应地，期望仅短暂地表达选择性标记基因的植物细胞，因为它们代表摄入了选择性标记基因，但没有将其整合到它们的基因组中的细胞。
因此，通过使用这样的“标记载体”以及也用另一个含有期望的天然基因或多核苷酸的载体共转化的植物，可以选择两个载体都摄入的植物细胞，从这些细胞中确定哪些细胞具有仅含有期望的基因或多核苷酸的基因组。可以修饰“标记载体”进而减少标记物将被整合到植物基因组中的可能性。本发明提供以“LifeSupport”载体形式存在的这类“标记载体”。
除非另有定义，这里使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。一般地，这里使用的名称、细胞培养的实验室方法、分子遗传学，以及这里描述的核酸化学和杂交，都是现有技术中那些公知的和通常使用的方法。使用重组核酸方法、多核苷酸合成、微生物培养、细胞培养、组织培养、转化、转染、转导、分析化学、有机合成化学、化学合成、化学分析，以及药物配制和输送的标准技术。一般地，根据生产商的说明进行酶促反应以及纯化和/或分离步骤。一般根据公开的常规方法学来实施技术和方法，例如在 Molecular cloning a laboratory manual, 2d ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989),和 Current protocols in molecular biology, John ffiley&Sons, Baltimore, MD (1989)公开的方法。
氨基酸序列这里使用的氨基酸序列包括寡肽、肽、多肽、或蛋白及其片段，其分离自、属于、或是在植物中天然存在的，或者是合成制备的，但包括内源对应物的核酸序列。
人工操纵的这里使用的“人工操纵的”意思是通过手工或通过机械方法或重组的方法，如通过遗传工程技术，移动、排列、操作或控制植物或植物细胞，以便产生与未被操作的天然存在的对应物相比具有不同的生物学、生物化学、形态学、或生理表型和/或基因型的植物或植物细胞。
无性繁殖通过从叶插、茎插、根插、块茎芽眼、匍匐丝、单个植物细胞原生质体、胼胝体等中产生整个植物的方法来生产子代，不包括配子的融合。
主链除去用于转移的T 一 DNA或P — DNA序列之外的双载体的核酸序列。
边缘和边缘样序列“边缘序列”是来源于土壤杆菌的特异性序列。典型地，左边缘序列和右边缘序列位于T - DNA的两侧，它们两者都作为virD2催化的切割反应的识别位点。这样的活性释放位于这样的边缘序列之间的核酸。见下表2中的边缘序列的实例。 将释放的核酸与virD2和virE2构成复合体靶向经常将核酸整合到植物细胞基因组中的植物细胞核。通常，使用两个边缘序列，左边缘和右边缘，将位于它们之间的核苷酸序列整合到另一个核苷酸序列中。也可能仅用一个边缘序列，或者多于两个边缘序列，以这样的方式完成期望核酸的整合。
根据本发明，“边缘样”序列是从将要修饰的所选植物种，或者与将要修饰的植物种性亲和的植物中分离的，其功能象土壤杆菌(Agrobacterium)的边缘序列。即,本发明的边缘样序列促进和便于与其相连的多核苷酸的整合。本发明的植物DNA，即P — DNA优选地含有边缘样序列。
P — DNA 的边缘样序列长度为 5 — IOObp, 10 — 80bp, 15 — 75bp, 15 — 60bp, 15 — 50bp, 15 - 40bp, 15 — 30bp, 16 — 30bp, 20 — 30bp, 21 — 30bp, 22 — 30bp, 23 — 30bp, 24 — 30bp, 25 一 30bp,或 26 — 30bp。
本发明的边缘样序列可从任何植物中分离，如从马铃薯和小麦中分离。见SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 34，这些序列在任一末端含有分别从马铃薯和小麦中分离的边缘样序列。因此，本发明使用的P - DNA左侧和右侧边缘序列是分离自和/或天然属于将要修饰的植物的基因组。P - DNA边缘样序列在核苷酸序列上不同于任何已知的来源于土壤杆菌的T — DNA边缘序列。因此，P — DNA边缘样序列可能具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、或更多个不同于土壤杆菌种，如根癌农杆菌或发根植物单胞菌的T 一 DNA边缘序列的核苷酸。即，本发明的P — DNA边缘序列或边缘样序列与土壤杆菌种，如根癌农杆菌或发根植物单胞菌的T - DNA边缘序列具有至少95%，至少90 %，至少 80 %，至少75 %，至少70 %，至少60 %或至少50 %的序列同一性，但不是100 %序列同一性。 这里使用的描述性术语“P - DNA边缘”和“P - DNA边缘样”可以互换。
天然的P — DNA边缘序列在核苷酸序列上与土壤杆菌的T 一 DNA边缘序列具有高于或等于 99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%,85%,84%,83%,82%,81 %,80%,79%,78%,77%,76%,75%,74%,73%,72%, 71 70%,69%,68%,67%,66%,65%,64%,63%,62%,61 60%,59%,58%,57%, 56%、55%、54%、53%、52%、52%、51%或50%的相似性。因而边缘样序列可从植物基因组中分离，并被修饰或突变以改变通过其能够将核苷酸序列整合到另一个核酸序列中的效率。可在本发明的边缘样序列内加入或掺入其它的多核苷酸序列。因此，可以修饰P —DNA 的左侧边缘序列或P — DNA的右侧边缘序列以使其具有5’ 一和3’ 一多克隆位点或者另外的限制性酶切位点。可以修饰P — DNA的边缘序列以提高不将伴随载体的主链DNA整合到植物基因组中的可能性。
下列表2描绘了已知的T - DNA边缘序列和在这里被鉴定为边缘样序列的序列。 在表2中没有一个被鉴定为“边缘样”的序列以前被鉴定为具有T - DNA边缘样结构。通过本发明的方法在聚合酶链反应中使用简并引物从马铃薯基因组DNA中分离马铃薯的边缘样序列。本发明包括使用任何P — DNA边缘样序列将共连接的多核苷酸转移到植物细胞的基因组中。
实际上，本发明包括具有SEQ ID NO. 93 ANGATNTATN6GT (SEQ ID NO. 93)的核酸序列结构的任何边缘样序列，其中“N”是任何核苷酸，如“A”、“G”、“C”、“T”代表的那些核苷酸。这个序列代表通过本发明鉴定的边缘样核酸的共有序列。
表2. “边缘”和“边缘样”序列
权利要求
1.修饰所选植物特性的方法，包括 a.用期望的多核苷酸稳定地转化所选植物的细胞，其中所述的期望的多核苷酸基本上由所选植物、相同种植物或与所选植物性互交可孕的植物的天然核酸序列构成， b.从所述转化的植物细胞中获得稳定转化的植物，其中所述的转化植物含有稳定地整合到基因组中的所述的期望的多核苷酸，其中所述的期望的多核苷酸修饰所述的特性。
2.根据权利要求I的方法，进一步包括用在所述的植物细胞中短暂表达的选择性标记基因共转染所述的植物细胞，鉴定转化的植物细胞，从所述的转化的植物细胞中获得转化植物，其中不稳定地整合所述的选择性标记基因，并且将所述的期望的多核苷酸稳定地整合到基因组中。
3.权利要求I的方法，其中所述的植物是单子叶植物。
4.权利要求3的方法，其中所述的单子叶植物从由小麦、草皮、草坪草、谷类植物、玉米、水稻、燕麦、小麦、大麦、高梁、兰花、蝴蝶花、百合、洋葱、香蕉、甘蔗、高梁、以及棕榈构成的组中选择。
5.权利要求I的方法，其中所述的植物是双子叶植物。
6.权利要求5的方法，其中所述的双子叶植物从由马铃薯、烟草、番茄、甜菜、花茎甘蓝、木薯、甘薯、胡椒、棉花、一品红、豆科植物、苜蓿、大豆、胡萝卜、草莓、莴苣、橡树、枫树、胡桃、玫瑰、薄荷、南瓜、雏菊、以及仙人掌构成的组中选择。
7.权利要求I的方法，其中所述的特性从由提高的健康和营养特性、改善的贮藏性、提高的产量、增强的耐盐性、增强的对重金属的耐受性、提高的对干旱的耐受性、提高的对疾病的耐受性、提高的对昆虫的耐受性、提高的对水应力的耐受性、增强的对冷和霜冻的耐受性、增加的颜色、增加的甜味、提高的活力、改善的口味、改善的结构、降低的磷酸盐含量、提高的发芽率、提高的微营养摄入、改善的淀粉组成、提高的花的寿命构成的组中选择。
8.根据权利要求I的方法，其中所述的期望的多核苷酸包括P— DNA、GBSS启动子、Ubi7启动子、Ubi3启动子、PIP启动子、修饰的PPO基因、转化酶抑制剂基因、耐盐性基因、与Rl相关的前导序列、与磷酸化酶相关的前导序列、与Rl相关的尾随序列、与SBE相关的尾随序列、Ubi内含子、GBSS间隔区、UbiT。
9.权利要求I的方法，其中通过土壤杆菌介导的转化来转化所述的植物细胞。
10.权利要求9的方法，其中土壤杆菌介导的转化依赖于使用至少一个双载体。
全文摘要
本发明涉及一种新的植物育种方法。该方法通过使用也在传统育种中使用的遗传材料来改善作物的农艺性状。不像在传统育种中进行的随机有性重组整个基因组，而是在体外重排特定的遗传元件并插回到单个的植物细胞中。通过这种新的植物育种方法获得的植株不含有异源核酸，但是仅含有来自选作转化的植物种或与所选植物种性亲和植物的核酸。提供了通过这种新的植物育种方法开发的植物。特别地，提供显示改善的块茎贮藏和健康特性的马铃薯植株。
文档编号C07K14/415GK102978236SQ20121043212
公开日2013年3月20日 申请日期2003年2月20日 优先权日2002年2月20日
发明者C·M·T·罗门斯, J·叶, H·颜, K·M·M·斯沃尔兹, J·梅嫩德斯－胡马拉, L·W·布林克霍夫, C·里切尔 申请人:J·R·西姆普罗特公司