生物反应装置及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物领域，具体而言，本发明涉及生物反应装置及其制备方法和应用。

背景技术：
体外研究细胞与小分子化学药物、细胞外基质（ECM）蛋白分子以及与其他细胞的相互作用逐渐在分子细胞生物学、临床诊断与药物研发等领域体现出愈加重要的意义。传统的培养皿或多孔板的二维培养环境无法很好的模拟和重现体内细胞生长的三维环境。因此在体外构建三维微环境实现细胞与其他生化因子或细胞在三维水平上的相互作用研究对于加速生物医学和药物研发的进一步发展具有重要意义。并且随着个体化医疗概念的提出与发展，人们已经认识到个体化差异于药物研发的重要意义。单一药物种类及其剂量对于不同个体的治疗效果相差甚远。将三维细胞培养与个体化医疗相结合势必开发出一种全新的生物及药物研发模式，推动生物医药领域的大力发展。现代生物医药研究需要获取和分析大量信息，高通量（high-throughput）技术应运而生，大大提高了获取生物信息的效率并且降低了所需试剂（如抗体、药物）、材料（如细胞外基质蛋白）和细胞（如数量有限的原代细胞）等的成本。目前常用的高通量平台技术基于微孔板（如96、384孔板）或芯片（如基因、蛋白、材料和细胞芯片）形式，用自动化操作系统（机械手、排枪、芯片点样系统、个人点样仪等）执行试验过程，实现微量样本研究。但是，昂贵的自动化操作系统并没有有效降低研究的总成本，需要开发更高效、更简易的装载（loading）方法来实现药物、材料和细胞的高通量三维微尺度排列芯片。诞生于半导体工业的微米尺度加工（微加工）技术被越来越广泛的应用于生物医学研究中以实现对于分子、材料和细胞在空间上的精确控制和高通量排列，其在建造图案化高通量的三维微环境领域具有强大功能。例如：空间上精确控制的三维微环境可以被用来重建体外的仿生模型（如模拟血管的多层生理结构，以及肝小叶精细的生理结构）；高通量排列的三维微环境可以被用来构建三维的药物、材料和细胞阵列芯片。常用的实现三维图案化排列的微加工方法包括：影印石版术（photolithography）、微成型技术（micro-molding）、模版图案技术(stencilpatterning)、压印光刻技术(Imprintlithography)、流体光刻技术(flowlithography)等等。三维微环境的设计需要涉及多方面因素，例如生物材料的来源（天然的或合成的）、材料的物化性质（化学性质、硬度、降解性、结构性）、材料的生物活性（粘附位点存在与否、诱导分子存在与否）以及药物、材料和细胞封装的方式（在制作支架过程中封装、封装在已成型的支架上）。如今，微加工技术在建造三维微环境的应用大都只局限于具有工程制造背景的实验室中实现，其在传统生物学、药学和医学实验室的广泛应用尚存在技术上的瓶颈，特别在涉及活细胞和具有生物活性的材料和药物的三维微环境的构建。例如，实验室常用的细胞外基质材料基质胶（matrigel）、明胶（collagen）是商品化的凝胶蛋白，具有良好的生物活性、生物相容性、可降解性，是公认的培养细胞的优良材料，尤其基质胶是培养胚胎干细胞（embryonicstemcell）的标准基底材料。其成胶（gelation）方式一般是温度转变（4℃～37℃），用常规的方法很难实现三维的图案化排列。借助微加工技术来制备模具，依靠模具的微尺度空间限制可以实现凝胶蛋白和细胞的三维微尺度排列。但一定程度上又增加了研究成本或操作技巧难度。如上所述，为满足生物学、药学、医学等不同研究领域对于精确可控和高通量的三维微环境日益增强的需求，迫切需要一种简易、可广泛应用的平台技术以快速、无损并且高通量地实现药物、材料和细胞以及其混合物的三维图案化微尺度排列。理想的微加工三维微环境高通量筛选平台应对于熟悉传统二维药物、细胞和材料研究的人员易于操作，无需特别的专业技术和手段（如微加工技术和特殊合成材料）以及昂贵的设备（如自动化、微加工设备），以实现在传统生物学、药学和医学领域的无障碍广泛应用。

技术实现要素：
本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。为此，本发明的一个目的在于提出一种生物反应装置及其制备方法和应用。在本发明的一个方面，本发明提出了一种生物反应装置，根据本发明的实施例，该生物反应装置包括：第一板，所述第一板具有第一通孔；第二板，所述第二板具有第二通孔；第一板和第二板通过双面胶连接，所述第一通孔与所述第二通孔一一对应。该细胞器培养器结构简单，功能全面，能够高通量并行自动装载细胞、培养液和药物等。另外，根据本发明上述实施例的生物反应装置还可以具有如下附加的技术特征：根据本发明的实施例，所述第一通孔包括多个通孔，所述第二通孔包括多个通孔。根据本发明的实施例，所述第一通孔的直径小于第二通孔的直径。根据本发明的实施例，所述第一板和第二板由聚甲基丙烯酸甲酯形成，所述第一板和第二板通过生物相容性胶连接为一体。在本发明的第二方面，本发明提出了一种制备上述生物反应装置的方法，该方法包括：提供第一板，在所述第一板上制备第一通孔；提供第二板，在所述第二板上制备第二通孔；将所述第一板和所述第二板连接为一体，其中，所述第一通孔与所述第二通孔一一对应。在本发明的第三个方面，本发明提出了一种利用上述的生物反应装置培养细胞的方法，该方法包括：将所述第一通孔和第二通孔进行亲水处理；在所述第一通孔内并行装载明胶；在所述装载有明胶的所述第一通孔内继续并行种植细胞；在所述第二通孔内并行装载培养液。在本发明的第四个方面，本发明提出了上述的生物反应装置在培养细胞中的用途。在本发明的第五个方面，本发明提出了上述的生物反应装置在筛选药物中的用途。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。附图说明本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：图1是根据本发明的一个实施例的生物反应装置的纵向截面图。图2是根据本发明的一个实施例的生物反应装置的俯视图。图3是根据本发明的一个实施例的载药芯片的结构示意图。图4是利用生物反应装置筛选药物中药物扩散前后药物浓度分布图像。图5是采用本发明的生物反应装置与常规二维多孔板在培养人纤维肉瘤细胞系的检测结果。具体实施方式下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。下面参考图1对本发明实施例的生物反应装置进行详细描述，具体地，该生物反应装置包括：第一板10，第一板10具有第一通孔11；第二板20，第二板20具有第二通孔21；第一板10和第二板20连接为一体，第一通孔11与第二通孔21一一对应。根据本发明的具体实施例，一一对应指的是第一通孔的圆心线与第二通孔的圆心线重合。根据本发明的具体实施例，第一通孔适于装载固体细胞培养支架，例如可以是明胶等，并进一步将装有明胶的通孔内种植细胞。第二通孔21适于装载营养液，第一通孔与第二通孔一一对应，以便每个第二通孔21内的营养液能够供给与其对应的第一通孔11内种植的细胞。根据本发明的具体实施例，上述第一板10上的第一通孔11包括多个通孔，第二板20上的第二通孔21同样也包括多个通孔。根据本发明的具体实施例，第一通孔11的直径小于第二通孔21的直径。由此当第一通孔内种植细胞、第二通孔内装载营养液时，能够保证足够的营养液支持。在微米尺度的系统中，由于液体量稀少易造成液体的快速蒸发，使得细胞得到的营养很快流失，因此将第二通孔11的直径设计为大于第一通孔21，可以使得培养液在短时间内足够支持第一通孔中细胞的生长。根据本发明的具体实施例，第一板和第二板由聚甲基丙烯酸甲酯形成，第一板10和第二板20通过生物相容性胶连接为一体，其中，第一板10为冰胶载板。由此可以提高利用该生物反应装置培养细胞时的细胞存活率。本发明中涉及的生物相容性胶为无基材透明双面胶，常用于光学研究，生化研究中，无味无毒。通过生物相容性胶使第一板与第二板粘合连接为一体，使得每一对对应的通孔均可视为单独的反映单元，互不影响，由此可实现在同一个装置中同时设置不同的实验条件。在本发明的另一方面，本发明提出了一种制备上述的生物反应装置的方法，该方法包括：提供第一板，在第一板上制备第一通孔；提供第二板，在第二板上制备第二通孔；将第一板和第二板连接为一体，其中，第一通孔与第二通孔一一对应。根据本发明的具体实施例，采用本发明制备生物反应装置的方法可以制备得到如图1、2所述生物反应装置。根据本发明的一个实施例，第一通孔包括多个通孔，第二通孔包括多个通孔。根据本发明的具体实施例，其中的每个通孔均可以作为一个单独生物反应装置，由此可以该生物反应装置可以同时多个生物反应空间，利用该生物反应装置可以实现高通量地并行自动装载细胞和药物，实验三维细胞的培养，以及药物筛选。根据本发明的具体实施例，制备的第一通孔以及第二通孔的方法并不受特备限制，根据本发明的具体实施例，可以采用激光雕刻技术、快速成型机械加工等技术的方法制备通孔，只需用电脑设计软件设计好图案，免去了复杂的模具制作流程，实现装置的快速加工，并进一步提高通孔的合格率。根据本发明的一个实施例，第一通孔的直径小于第二通孔的直径。根据本发明的具体实施例，具体的第一通孔和第二通孔的半径可以分别为0.5mm和0.8mm，通过尺寸设计，装置上孔与孔之间的圆心距以及单孔的尺寸可达到与传统商业化的384多孔板的尺寸相契合，由此大大增加了该装置的广泛适用性，可实现与现有多孔板检测设备的无缝对接，更加方便广大实验室的使用与检测。根据本发明的一个实施例，第一板和第二板由聚甲基丙烯酸甲酯形成，所述第一板和第二板通过生物相容性胶连接为一体，其中，第一板为冰胶载板。根据本发明的具体实施例，第一板和第二板的尺寸规格可以根据具体需要设计，例如可以为76×26cm2（与市售玻片规格保持一致），由此可以便于后续对其进行检测。根据本发明的具体实施例，第一板和第二板的厚度并不受特别限制，根据本发明的具体实施例，第一板的厚度可以与第二板的厚度相同，具体厚度可以为0.5～1mm，由此可以更加方便对装置内的细胞样品进行显微观察。根据本发明的具体实施例，每个板上的通孔的数量也并不受特别限制，根据本发明的具体示例，可以为3×8或者6×16个，由此可以提高其用于培养细胞的效率或者提高利用其筛选药物效率。在本发明的再一方面，本发明提出了一种利用上述的生物反应装置培养细胞的方法，根据本发明的具体实施例，该方法可以包括：将第一通孔和第二通孔进行亲水处理；在第一通孔内并行装载明胶；在装载有明胶的第一通孔内继续并行种植细胞；在第二通孔内并行装载培养液。由此利用该方法可以有效实现细胞的单元化三维培养，并借助两板的粘合实现每个单元的独立处理。在本发明的又一方面，本发明提出了上述的生物反应装置在培养细胞中的用途。由此利用该生物反应装置可以显著提高培养细胞的效率，实现高通量并行自动装载细胞并对其有效培养。利用该生物反应装置培养细胞相对传统单样本复杂操作会更加省时省力、简洁方便、快速。同时利用该生物反应装置培养细胞还可以实现快速、高效、精准的加样，实现三维细胞的培养。同时能够减少对细胞、细胞培养液、培养耗材的使用，对于节省成本具有重要意义。例如运用该装置进行96通量的药物筛选操作时，由于细胞等材料皆通过并行加载方式进行装载，耗时只有半分钟，而运用96孔板进行手动操作时，至少要花费5～10分钟。根据本发明的具体实施例，基于生物反应器形成的明胶微冰胶的三维细胞培养阵列芯片可以促进细胞聚集形成一个模拟体内的三维微尺度组织（简称微组织）。三维细胞的这种微组织不仅可以避免三维组织常见的氧气和营养物质传递不均匀问题，而且能更好的模拟体内细胞所处的三维环境，保证培养的细胞有类似于体内组织器官中细胞的骨架形态、细胞之间相互功能以及信号转导机制等。由于三维支架的微尺度特性，该装置可以节省大量的细胞、药物以及细胞培养液。例如以5×106/ml的细胞种植密度接种细胞于装置，只需100μl，即5×105个细胞，即可实现96个支架的细胞接种，相较于传统三维细胞接种，该用量仅为一个支架的接种量。另外为满足96个孔的细胞培养，仅需200μl培养液，相较于96孔板每孔100μl的最少用量，节省了48倍。而药物装载于每个微尺度培养单元中最多仅需1μl的液体量，由此可显著节省珍贵的药物化合物。在本发明的第五方面，本发明提出了上述的生物反应装置在筛选药物中的用途。利用该生物反应装置可以有效用于筛选药物，由于利用上述生物反应器能够很好的模拟体内细胞所处的三维环境，因此保证了培养的细胞有类似于体内组织器官中细胞的骨架形态、细胞之间相互功能以及信号转导机制等，使得利用该细胞用于药物筛选有更准确的反应，使得利用该生物反应器培养细胞用于筛选药物具有更好的预测性。例如癌症细胞在三维多孔支架中生长时，会发生部分分化（partialdifferentiation），即上皮-间质转化（epithelial-mesenchymaltransition），癌细胞会逐步分化为恶性状态，如细胞形态的改变，细胞膜表面E-钙粘着蛋白表达减少，N-钙粘着蛋白表达增加，以及细胞核内其他基因表达的激活，从而造成癌细胞对化疗药物敏感性降低，抗药性增加。下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。实施例1生物反应装置的制备方法：选择0.5mm厚PMMA板（两面均带有保护膜）作为冰胶载板，按照实施方式中提到的尺寸在绘图软件中设计装置草图（装置大小为76×26mm，冰胶载板上共有孔96个，阵列排布为6×16，孔直径设计为1mm）。然后将图形文件传输到激光雕刻机控制程序中，进行模具切割，切割出来的PMMA冰胶载板用去离子水冲洗干净，并于60℃烘箱中烘干。该过程中PMMA两面保护膜不揭掉以防止后续装载生物材料支架的预聚溶液时污染疏水的PMMA表面。制备好的模具可放入干净封口袋中室温保存备用。制备三维培养用生物材料支架时，预先将上述模具用等离子清洗机进行亲水处理，时间1min即可。生物材料的选择很广泛，常用的聚乙二醇和明胶等都可用来制备该装置中的支架。以明胶支架为例，配制4%的明胶水溶液，置于冰上预冷，然后加入戊二醛溶液，使戊二醛的终浓度达到0.1%，然后取200μl滴到模具一端，用薄板（如薄玻片）将液滴均匀涂刮于模具表面，溶液可自然填充于模具上的阵列孔中。待所需数量的模具均装载有材料溶液后，将其尽快置于低温冰箱中（-12～-20℃），放置12h以使反应完全。之后取出已载有预成型支架的模具，浸没入0.1M的硼氢化钠溶液中浸泡10分钟，以中和未反应完全的醛基，减少支架的自发荧光，再用去离子水冲洗模具两至三次。清洗过程结束后，将模具浸入水中冻成冰，放置到冻干机中处理12h，支架中的冰晶发生升华，在支架中产生几十至100微米的相互连通的孔道，此时可将模具取出，置于干燥环境储存，至此，生物反应装置制备完成。通过上述方法制备得到的生物反应装置的具体结构如下：该装置分上下两层，均采用标准化尺寸设计，外观与标准显微镜玻片一致，长76mm，宽26mm。阵列孔设计与市售384孔板保持一致，为6×16阵列。上层为培养液储存板，孔直径为1.6mm，下层板为冰胶载板，孔直径为1mm，两板上孔的圆心距均为4.5mm，通过生物相容性双面胶牢固粘合。实施例2利用生物反应装置培养细胞的操作方法首先将装置进行紫外线消毒灭菌处理，防止实验中细胞样品被污染。将预用来实验的细胞制备成所需浓度的细胞悬液，每毫升1～5×106个细胞。吸取100～120μl的细胞悬液滴加到冰胶载板的一端，用干净无菌的薄玻片均匀涂刮细胞悬液于板的表面，板上的冰胶可将细胞自动吸附其中，至此，细胞装载完成。然后取200μl细胞培养液，滴加到装置另一面的一端即培养液储存板的一端，同样用干净无菌的薄玻片均与涂刮于板表面，完成培养液的装载。最后将装载好的反应装置置于湿度充裕的容器中，37℃常规培养即可。实施例3生物反应装置在筛选药物中的用途若进行细胞药物毒性的筛选实验，由于装置中每个培养体系相互独立，可方便进行不同浓度、不同种类药物分子的添加。若实验配备有高通量操作平台，可直接向装置中的各个反应单元添加相应种类以及相应浓度的药物。若一般实验室检测用，可将药物溶液先滴加到本发明制备的简易药物装载芯片上，然后将装载有药物的芯片（图3）扣在装置的培养液储存板一面，药物即会缓慢扩散入细胞培养体系。药物装载芯片的制备方法：此实施例中的载药芯片采用传统光蚀刻法制作，材料采用可光交联的聚乙二醇材料，分子量4000，浓度10%w/t，同时配以0.5%w/t的光引发剂I2959，在光掩模的覆盖下紫外光照射35秒。之后用清水清洗照射后的聚乙二醇凝胶芯片，-20℃冷冻6～7小时，真空冷冻干燥12小时左右即可。载药芯片结构简述：该芯片上的聚乙二醇支架同样采用圆柱形阵列图案，直径设计为1mm，圆柱之间间距4.5mm，与该发明中的细胞装载芯片尺寸保持一致，方便实验。检测结果：图4左右两图所示分别为药物扩散过程前后药物浓度分布图像。仿真模拟结果药物在4.8小时左右即可达到平衡，而从图4右图中也可以看出药物在经历扩散后依然保持浓度梯度。表1列举了药物扩散前的装载浓度、扩散后的理论计算浓度与实际测量浓度。经对比可以明显看出药物的实际扩散过程与理论预测有非常良好的对应关系。表1药物装载浓度（μg/ml）97.66195.3390.6781.31562.531256250理论预测扩散后浓度（μg/ml）16.7633.5267.03134.1268.1534.61069实际测得扩散后浓度（μg/ml）16.8033.4866.90133.83267.6535.81071待药物作用一段时间（一般为24h或以上）后，将装置直接放于50ml离心管中（若使用药物装载芯片，移除即可），1000rpm离心2分钟，去除装置中的液体，然后按照添加细胞培养液同样的方法将检测细胞活性的试剂（如阿尔马兰溶液）均匀涂刮在装置上，37℃反应1～2小时，将装置取出，置于检测架上，酶标仪检测装置中每个单元的检测值，计算不同药物条件下细胞的相对活性。图5显示了本发明装置与常规二维多孔板在培养人纤维肉瘤细胞系中检测结果的对比结果。由图5可明显看出，在本发明装置中，细胞的抗药性明显提高，在三维培养状态下，广谱抗肿瘤药物阿霉素对人纤维肉瘤细胞的半数抑制浓度为130.02μM，而在传统二维的多孔板培养模式下，该药物的半数抑制浓度只有9.55μM，在二维培养模式测得的较低的半数抑制浓度不能真实反映细胞在原有三维生长环境中的抗药物反应，这与近年来三维培养模式提高肿瘤细胞抗药性的文献报道基本一致，因此也证明了该装置的准确可靠性。在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。