本发明涉及一种高密度发酵制备γ-聚谷氨酸的培养基及其发酵方法，属于生物工程领域。
背景技术：
γ-聚谷氨酸是微生物产生的一种胞外氨基酸聚合物，具有优良的水溶性、超强的吸附性和生物可降解性，降解产物为无公害的谷氨酸，是一种优良的环保型高分子材料，可作为保水剂、重金属离子吸附剂、絮凝剂、缓释剂以及药物载体等，在化妆品、环境保护、食品、医药、农业、沙漠治理等产业均有很大的商业价值和社会价值。
高密度发酵就是要在单位时间、单位反应器体积内，在不影响胞内产物得率的基础上，尽可能多的积累细胞量。高细胞密度发酵中的培养基应充分满足微生物的营养要求，并为细胞的生长繁殖提供适宜的环境条件。
枯草芽孢杆菌Z115是由山东建筑大学生物技术研究中心分离并保存的一株菌株(张超，栾兴社，朱明晟，孙娜，杨统见，王书燕.各种氨基酸对枯草芽孢杆菌生产聚谷氨酸的促进作用.食品工业[J]，2013，1（34）：119-122.)，该菌株属于芽孢杆菌属。在上述文章中，作者通过实验研究了各种氨基酸对枯草芽孢杆菌发酵生产聚谷氨酸的影响。但是该技术在实际应用中存在着产品浓度低、生产效率低、操作繁琐、氨基酸培养基成本高等不足，限制了广泛推广与应用。
技术实现要素：
本发明的目的是克服现有技术中存在的不足，提供一种产品浓度高、效率高、易于操作、成本低的实用产业化培养基及其发酵方法。
具体技术方案如下：
（1）斜面菌种培养：将枯草芽孢杆菌Z-115接种于斜面培养基，并于37℃下保温培养48h；
（2）摇瓶菌种培养：菌种在斜面培养基上活化好后，每株菌取一满环接入到100 mL发酵培养液中（250 mL三角瓶），200r/min，37℃摇床培养24 h；
（3）种子培养基的制备：按10%的接种量转入到500 mL发酵培养液中（1000 mL三角瓶），200r/min， 37℃摇床培养48 h；
（4）发酵：5L发酵罐中按75%的装液量装入基础发酵培养基，然后按体积比5-10％接入生产菌种进行搅拌通气培养48-50h；所述发酵罐的培养条件为：搅拌转速为200r/min，温度为37℃，罐压为0.01-0.03MPa；
（5）产品提取：发酵液于10000r/min离心10min除去菌体，上清液加入2.5倍体积无水乙醇，摇匀，10000r/min、5min离心得沉淀，沉淀用蒸馏水溶解，透析过夜，透析液加2倍体积无水乙醇，得到的沉淀物在105 ℃烘箱中干燥。
上述方法中，步骤（1）中的斜面培养基配方为：蔗糖20g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，谷氨酸钠20g/L，琼脂18 g/L，pH7.0，121℃灭菌15 min待用。
上述方法中，步骤（2）中的摇瓶培养基配方为：蔗糖20g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，谷氨酸钠20g/L，pH7.0，121℃灭菌15 min待用。
上述方法中，步骤（3）中的种子培养基配方同摇瓶培养基。
上述方法中，步骤（4）中的基础发酵培养基：蔗糖30-50g/L，蛋白胨20-30g/L，氯化钠10-16g/L，谷氨酸钠30-40g/L，pH7.0，121℃灭菌15 min；补料发酵培养基A：蔗糖80-100g/L；蛋白胨30-40g/L，pH7.0，121℃灭菌15 min；补料发酵培养基B：蔗糖80-100g/L；谷氨酸钠40-60g/L；蛋白胨30-40g/L，pH7.0，121℃灭菌15 min。
上述方法中，步骤（4）中，发酵开始15 h后，开始补加补料发酵培养基A，当发酵液在600nm波长下的吸光值不再增加时，终止补加补料发酵培养基A，此时，枯草芽孢杆菌活菌数达1010cfu/ml。此后，发酵过程中维持发酵液中的还原糖浓度在40 g/L，当还原糖浓度低于设定值时，开始补加补料发酵培养基B。
本发明制备聚谷氨酸的方法具有工艺简单，降低了生产成本、提高了生产效率，可进行大规模生产。
本发明具有以下优点：
（1） 本发明提供了适于γ-聚谷氨酸高密度发酵的培养基，提高了菌体密度。
（2） 本发明建立了适于γ-聚谷氨酸高密度发酵的培养方法，降低了生产成本、提高了生产效率。
（3） 在发酵过程中，不是简单的进行补料，而是创新性的采用两种不同的补料培养基，一种补料发酵培养基A适用于菌体的生长，一种补料发酵培养基B适用于产物的积累。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行进一步的阐述，应该明白的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其进行限定。如无特别说明，下述实施例中出现的百分数均为重量百分数。
实施例1
1、斜面菌种培养：将枯草芽孢杆菌Z-115接种于斜面培养基，并于37℃下保温培养48h；斜面培养基配方为：蔗糖20g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，谷氨酸钠20g/L，琼脂18 g/L，pH7.0。
2、摇瓶菌种培养：菌种在斜面培养基上活化好后，每株菌取一满环接入到100 mL发酵培养液中（250 mL三角瓶），200r/min，37℃摇床培养24 h；摇瓶培养基配方为：蔗糖20g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，谷氨酸钠20g/L，pH7.0。
3、种子培养基的制备：按10%的接种量转入到500 mL发酵培养液中（1000 mL三角瓶），200r/min， 37℃摇床培养48 h；种子培养基配方同摇瓶培养基。
4、发酵：5L发酵罐中按75%的装液量装入基础发酵培养基，然后按体积比5-10％接入生产菌种进行搅拌通气培养48-50h。所述基础发酵培养基：蔗糖50g/L，蛋白胨30g/L，氯化钠16g/L，谷氨酸钠40g/L，pH7.0；补料发酵培养基A：蔗糖100g/L；蛋白胨40g/L，pH7.0；补料发酵培养基B：蔗糖100g/L；谷氨酸钠60g/L；蛋白胨40g/L，pH7.0。所述发酵罐的培养条件为：搅拌转速为200r/min，温度为37℃，罐压为0.01-0.03MPa。培养方式为：发酵开始15 h后，开始补加补料发酵培养基A，当发酵液在600nm波长下的吸光值不再增加时，终止补加补料发酵培养基A，此时，枯草芽孢杆菌活菌数达1010cfu/ml。此后，发酵过程中维持发酵液中的还原糖浓度在40 g/L，当还原糖浓度低于设定值时，开始补加补料发酵培养基B。
5、产品提取：发酵液于10000r/min离心10min除去菌体，上清液加入2.5倍体积无水乙醇，摇匀，10000r/min、5min离心得沉淀，沉淀用蒸馏水溶解，透析过夜，透析液加2倍体积无水乙醇，得到的沉淀物在105 ℃烘箱中干燥，得到γ-聚谷氨酸粗品，产量为37.6g/L。
实施例2
采用实施例1的方法制备γ-聚谷氨酸，不同的是，步骤4采用的过程是：5L发酵罐中按75%的装液量装入基础发酵培养基，然后按体积比5％接入生产菌种进行搅拌通气培养48-50h。所述基础发酵培养基：蔗糖30g/L，蛋白胨20g/L，氯化钠10g/L，谷氨酸钠30g/L，pH7.0；补料发酵培养基A：蔗糖80g/L；蛋白胨30g/L，pH7.0；补料发酵培养基B：蔗糖80g/L；谷氨酸钠40g/L；蛋白胨30g/L，pH7.0。γ-聚谷氨酸的最终产量为33.5g/L。
实施例3
采用实施例1的方法制备γ-聚谷氨酸，不同的是，步骤4采用的过程是：5L发酵罐中按75%的装液量装入基础发酵培养基，然后按体积比7％接入生产菌种进行搅拌通气培养48-50h。所述基础发酵培养基：蔗糖40g/L，蛋白胨25g/L，氯化钠14g/L，谷氨酸钠35g/L，pH7.0；补料发酵培养基A：蔗糖90g/L；蛋白胨35g/L，pH7.0；补料发酵培养基B：蔗糖90g/L；谷氨酸钠50g/L；蛋白胨35g/L，pH7.0。γ-聚谷氨酸的最终产量为36.5g/L。