本发明涉及微生物菌株扩培和乙醇发酵技术领域，具体地，涉及一种液化醪扩培酵母菌的方法及其应用和发酵乙醇的方法。
背景技术：
我国是农业大国，农作物秸秆产量约为7亿吨/年，居世界首位。目前农作物秸秆主要的利用方式有：还田肥料(直接还田、有机肥料)，农村能源(气化、燃烧)，牲畜饲料(直接饲喂、处理后作肥料)，工业原料(造纸原料、培养食用菌)等等。但是，仍有约占秸秆总量的20％秸秆被弃置在田间地头和河沟，或者焚烧。根据目前的水平，大约6吨秸秆可以生产出1吨燃料乙醇，如果我国把秸秆、下脚料等都利用起来，大概相当于我国1年的石油用量，而且与谷物原料生产乙醇相比，木质纤维素原料生产乙醇有许多优点：木质纤维素作物不用于生产食品，有广泛的作物可供应用，具有内在的价格优势；木质纤维素原料生长使用一个单位的能量，可得到近5.5个单位价值的乙醇，它比从谷物原料生产乙醇的效率甚至更高；木质纤维素原料生产乙醇排放主要的温室气体二氧化碳比一般的汽油要少80％，而谷物原料生产乙醇排放主要的温室气体二氧化碳比一般的汽油仅少20％。因此，利用秸秆类废弃物生产燃料乙醇具有其他原料不可比拟的优势。
从葡萄糖转化成乙醇的生化过程是简单的，通过传统的酒精酵母，使反应在30℃条件下进行，就可以将葡萄糖发酵为燃料乙醇。但半纤维素水解产物是以木糖为主的五碳糖，故木糖的发酵效率是决定过程经济性的重要因素，木糖的存在对纤维素酶水解有抑制作用，将木糖及时转化为乙醇对木质纤维素原料的高效率乙醇发酵是非常重要的。在此过程中，酵母菌株的扩培 对木糖转化为乙醇的效率有重要影响。
酵母生长一般有延滞期、对数生长期和生长停滞期三个时期，发酵接种时间应最好控制在酵母细胞对数生长期的后期、生长停滞期前期，此时酵母细胞数量可达最大，且酵母出芽率最高、死亡率最低，接种后能够迅速增殖并有利于发酵进程。
在现有方法中，进行酵母菌扩培时均采用糖化醪滤液为原料，且传统的车间中试酵母菌扩培采用间歇扩培方式或者连续扩培方式，其中，采用间歇扩培过程时需一级一级进行扩培以达到车间发酵的用量，大概需要3-4级扩培，扩培级数越多，需要的设备越多，扩培过程染菌的风险也越大。采用连续扩培过程时，由于糖化醪内糖浓度较高，营养比较丰富，酵母代谢比较快，酵母很快就达到对数生长期而后进入生长停滞期。因此，对于前述两种扩培方式，一方面，难以有效控制得到的酵母菌的数量，往往导致过培养(扩培的种子液中酵母菌数至少为3.0亿/ml)，造成发酵时相当量的糖类用于酵母菌体本身代谢，从而导致用于乙醇发酵的糖类利用率较低；另一方面，由此得到的酵母菌的活力(主要体现为发酵时的乙醇得率和木糖消耗率)较低。因此，针对现有的五碳糖发酵菌株，如何选用扩培方式、培养条件以适应大生产条件、并能高效利用五碳糖(主要为木糖)发酵乙醇是一个重要问题。
技术实现要素：
本发明的目的是为了克服现有技术中的上述缺陷，提供一种液化醪扩培酵母菌的方法及其应用和发酵乙醇的方法，本发明的液化醪扩培酵母菌的方法，不仅能够有效控制酵母菌的数量，而且得到的酵母菌的活力较高，能够明显提高发酵时的乙醇得率和木糖消耗率。
本发明的发明人在研究中意外发现，在无菌条件下，以还原糖含量较低的液化醪滤液为原料，对活化的酵母菌依次进行间歇扩培和流加扩培(扩培 时不加入糖化酶)，不仅能够有效控制酵母菌的数量，而且得到的酵母菌的活力较高，能够明显提高发酵时的乙醇得率和木糖消耗率。
因此，为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种液化醪扩培酵母菌的方法，所述方法包括：在无菌条件下，以液化醪滤液为原料，对活化的酵母菌依次进行间歇扩培和流加扩培。
第二方面，本发明提供了上述方法在乙醇发酵中的应用。
第三方面，本发明提供了一种发酵乙醇的方法，所述方法包括：利用扩培的酵母菌进行发酵，其中，在发酵前，采用本发明的上述方法进行酵母菌的扩培。
本发明的发明人首次尝试采用还原糖含量较低的液化醪滤液为原料进行酵母菌扩培，不仅能够有效控制酵母菌的数量(经本发明的液化醪扩培酵母菌的方法得到的种子液中酵母数为1.8-2.4亿/ml，酵母出芽率为25-40％，死亡率为0-5％)，而且得到的酵母菌的活力较高，能够明显提高发酵时的乙醇得率和木糖消耗率。
本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
第一方面，本发明提供了一种液化醪扩培酵母菌的方法，该方法包括：在无菌条件下，以液化醪滤液为原料，对活化的酵母菌依次进行间歇扩培和流加扩培。
本发明中，对于液化醪滤液没有特别的限定，可以为本领域常用的各种液化醪滤液，为了能够更加有效地控制酵母菌的数量，并进一步提高得到的酵母菌的活力，优选情况下，液化醪滤液中还原糖的含量为6-15体积％，进 一步优选为8-10体积％。另外，液化醪滤液可以为玉米液化醪滤液和/或木薯液化醪滤液。
本发明中，对于制备上述液化醪滤液的方法没有特别的限定，可以为本领域常用的各种方法，例如可以为：以淀粉为原料，进行粉碎，然后在75-85℃、pH值为4.5-5的条件下水热处理3-4h，水热处理能够使淀粉糊化-液化，并破坏细胞，形成均一的液化醪液，最后经过滤即得。
本发明中，对于活化酵母菌的方法没有特别的限定，可以为本领域常用的各种方法，例如可以为：先将实验室在YPDA平板上保存的酵母菌接种至装有YPDA液体培养基的摇瓶中，28-32℃、100-200rpm下培养至酵母数为1.6-1.8亿/ml，然后以5-10体积％的接种量将培养液接种至装有新鲜的YPDA液体培养基的摇瓶中，28-32℃、200-300rpm下培养至酵母数为1.8-2.2亿/ml，得到活化的酵母菌液。
本发明中，本发明的发明人发现在间歇扩培时无需进行3-4级扩培，仅进行1-2级扩培即可达到发酵用量和菌株质量，因此，优选情况下，间歇扩培的级数为1-2级。
本发明中，优选情况下，间歇扩培的实施方式包括：以3-6体积％的接种量将活化的酵母菌液接种至含有液化醪滤液的种子罐中进行培养，所述活化的酵母菌液中酵母数为1.5-2.4亿/ml。进一步优选地，间歇扩培的培养条件包括：温度为28-32℃，更进一步优选为28-30℃；通气量为0.08-0.2VVM，更进一步优选为0.1-0.15VVM；培养至种子液中酵母数为1.0亿/ml以上时停止间歇扩培，更进一步优选地，培养至种子液中酵母数为1.0-1.5亿/ml时停止间歇扩培。本领域技术人员应该理解的是，通气量的单位VVM是指以每分钟内通过单位体积培养液的空气体积(V/V·min)。
本发明中，优选情况下，流加扩培的实施方式包括：在间歇扩培结束后的种子罐中以相同体积流量同时流入液化醪滤液和流出种子液。进一步优选 地，所述流加扩培的培养条件包括：温度为28-32℃，更进一步优选为28-30℃；pH值为4.5-5.0；通气量为0.08-0.2VVM，更进一步优选为0.1-0.15VVM；体积流量为1/15-1/6V/h，更进一步优选为1/10-1/8V/h，所述V/h中的V为间歇扩培结束时种子罐中种子液的体积。
本发明中，本领域技术人员应该理解的是，在整个扩培过程中并不加入糖化酶，以使扩培过程在一个较低的还原糖浓度环境下进行，从而有效地控制酵母数、出芽率和死亡率。而且，以前述特定的方式进行流加扩培，不仅可以为发酵提供大量的菌株，而且能够有效地控制酵母的生长时期，使酵母保持酵母数最多，出芽率最高。
本发明中，经本发明的液化醪扩培酵母菌的方法得到的种子液中酵母数为1.8-2.4亿/ml，酵母出芽率为25-40％，死亡率为0-5％。
第二方面，本发明提供了上述方法在乙醇发酵中的应用。
第三方面，本发明提供了一种发酵乙醇的方法，所述方法包括：利用扩培的酵母菌进行发酵，其中，在发酵前，采用本发明的上述方法进行酵母菌的扩培。本发明的方法尤其适用于以木质纤维素的酶解液为原料进行的乙醇发酵过程，因此，优选情况下，以木质纤维素的酶解液为原料进行发酵。
本发明中，对于发酵的条件没有特别的限定，可以为本领域常用的各种条件，优选情况下，发酵的条件包括：温度为28-32℃，进一步优选为28-30℃；pH为3.8-6.0，进一步优选为4.0-5.5；时间为36-72小时，进一步优选为36-60小时。
实施例
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，如为特别说明，使用的试剂或材料均可商购获得，使用的方法均为本领域常用的方法。
玉米液化醪滤液的制备方法为：以玉米为原料，进行粉碎，然后在80 ℃、pH值为4.8的条件下水热处理3h，再进行过滤，得到玉米液化醪滤液，其中得到的玉米液化醪滤液中还原糖的含量为10体积％。
酵母为普渡大学的改造后酿酒酵母，具有同时代谢五碳糖和六碳糖的能力，酵母具体改造的方法详见参考文献Ho NW,Chen Z,Brainard AP(1998)Genetically engineered Saccharomyces yeast capable of effective cofermentation of glucose and xylose.Appl Environ Microbiol 64:1852–1859。
活化酵母菌的方法为：先将酵母菌接种至装有100ml YPDA液体培养基的500ml摇瓶中，30℃、200rpm下培养至酵母数为1.6亿/ml，然后以5体积％的接种量将培养液接种至装有100ml新鲜的YPDA液体培养基的500ml摇瓶中，30℃、200rpm下培养至酵母数为2.0亿/ml，得到活化的酵母菌液。
木质纤维素原料的酶解方法为：木质纤维素经预处理后进行酶解，酶解条件包括：温度为50℃，pH为5.0，时间为72h，以预处理得到的产物中含有的纤维素的重量为基准，每克纤维素对应加入的纤维素酶的量为10酶活力单位，得到木质纤维素的酶解液，其中，纤维素酶购自诺维信公司。
乙醇得率的计算公式为：乙醇得率＝[(C乙-C乙0时刻)/0.511/(C葡+C木)]*100％，其中，C乙为发酵液中的乙醇含量，C乙0时刻为发酵原料木质纤维素的酶解液中的乙醇含量，C葡为发酵原料木质纤维素的酶解液中的葡萄糖含量，C木为发酵原料木质纤维素的酶解液中的木糖含量。
木糖消耗率的计算公式为：木糖消耗率＝[(C木0时刻-C木)/C木0时刻]*100％，其中，C木0时刻为发酵原料木质纤维素的酶解液中的木糖含量，C木为发酵液中的木糖含量。
实施例1
无菌条件下，以5体积％的接种量将活化的酵母菌液接种至装有6L玉米液化醪滤液的10L种子罐中进行间歇扩培，培养级数为一级，培养条件包 括：温度为30℃，通气量为0.1VVM，培养至种子液中酵母数为1.2亿/ml时停止间歇扩培，此时种子罐中种子液的体积为6L。
在间歇培养结束进行流加扩培，包括：在间歇培养结束后的种子罐中以0.6L/h的体积流量同时流入新鲜的液化醪滤液和流出种子液至30L发酵罐中，其中，流加扩培的培养条件包括：温度为30℃，pH值为5.0，通气量为0.1VVM。经检测，在整个流加过程中，流加至发酵罐中的种子液中酵母数为1.9±0.1亿/ml，酵母出芽率为35-38％，死亡率为0。
在装有18L木质纤维素的酶解液的30L发酵罐中，利用流入的扩培的酵母菌进行发酵，其中，发酵的条件包括：温度为30℃，pH为5.0，搅拌桨的转速为200rpm，发酵60小时结束，发酵结束时发酵液的体积为19.8L。
通过液相色谱仪对发酵原料木质纤维素的酶解液、发酵液中的产物和副产物进行分析。其中，液相色谱仪(型号为Aglient1260，购自安捷伦科技有限公司)，色谱柱为伯乐HPX-87H(300mm×7.8mm×9μm)，流动相为0.005mol/L H2SO4，流速为0.6ml/min，柱温箱为65℃。检测结果为：发酵原料木质纤维素的酶解液中木糖含量为1.86g/100ml，葡萄糖含量为8.99g/100ml，乙醇含量为0.37g/100ml；发酵液中乙醇含量为4.85g/100mL，木糖含量为0.64g/100mL。经计算可知，乙醇得率为80.80％，木糖消耗率为65.60％。
实施例2
无菌条件下，以3体积％的接种量将活化的酵母菌液接种至装有6L玉米液化醪滤液的10L一级种子罐中进行一级间歇扩培，再将一级培养得到的种子液以3体积％的接种量接种至装有6L玉米液化醪滤液的10L二级种子罐中进行二级间歇扩培，其中，两级间歇培养的培养条件包括：温度均为29℃，通气量均为0.12VVM，培养至种子液中酵母数均为1.5亿/ml时停止培 养，二级间歇扩培结束后，二级种子罐中种子液的体积为6L。
在二级间歇培养结束进行流加扩培，包括：在二级间歇培养结束后的二级种子罐中以0.67L/h的体积流量同时流入新鲜的液化醪滤液和流出种子液至30L发酵罐中，其中，流加扩培的培养条件包括：温度为29℃，pH值为4.7，通气量为0.12VVM。经检测，在整个流加过程中，流加至发酵罐中的种子液中酵母数为2.0±0.1亿/ml，酵母出芽率为30-32％，死亡率为0.05-0.1％。
在装有18L木质纤维素的酶解液的30L发酵罐中，利用流入的扩培的酵母菌进行发酵，其中，发酵的条件包括：温度为29℃，pH为5.5，搅拌桨的转速为250rpm，发酵48小时结束，发酵结束时发酵液的体积为19.9L。
通过实施例1中所述的液相色谱仪对发酵原料木质纤维素的酶解液、发酵液中的产物和副产物进行分析。检测结果为：发酵原料木质纤维素的酶解液中木糖含量为1.86g/100ml，葡萄糖含量为8.99g/100ml，乙醇含量为0.37g/100ml；发酵液中乙醇含量为4.80g/100mL，木糖含量为0.63g/100mL。经计算可知，乙醇得率为79.90％，木糖消耗率为66.13％。
实施例3
无菌条件下，以6体积％的接种量将活化的酵母菌液接种至装有6L玉米液化醪滤液的10L种子罐中进行间歇扩培，培养级数为一级，其中，培养条件包括：温度为28℃，通气量为0.15VVM，培养至种子液中酵母数为1.0亿/ml时停止培养，间歇扩培结束后，种子罐中种子液的体积为6L。
在间歇培养结束进行流加扩培，包括：在间歇培养结束后的种子罐中以0.75L/h的体积流量同时流入新鲜的液化醪滤液和流出种子液至30L发酵罐中，其中，流加扩培的培养条件包括：温度为28℃，pH值为4.5，通气量为0.15VVM。经检测，在整个流加过程中，流加至发酵罐中的种子液中酵母数 为2.05±0.15亿/ml，酵母出芽率为29-31％，死亡率为0.08-0.15％。
在装有18L木质纤维素的酶解液的30L发酵罐中，利用流入的扩培的酵母菌进行发酵，其中，发酵的条件包括：温度为28℃，pH为4.0，搅拌桨的转速为250rpm，发酵36小时结束，发酵结束时发酵液的体积为20.0L。
通过实施例1中所述的液相色谱仪对发酵原料木质纤维素的酶解液、发酵液中的产物和副产物进行分析。检测结果为：发酵原料木质纤维素的酶解液中木糖含量为1.86g/100ml，葡萄糖含量为8.99g/100ml，乙醇含量为0.37g/100ml；发酵液中乙醇含量为4.73g/100ml，木糖含量为0.66g/100ml。经计算可知，乙醇得率为78.64％，木糖消耗率为64.52％。
实施例4
按照实施例1的方法，不同的是，流加扩培时控制pH值为3.2。
通过实施例1中所述的液相色谱仪对发酵原料木质纤维素的酶解液、发酵液中的产物和副产物进行分析。检测结果为：发酵原料木质纤维素的酶解液中木糖含量为1.86g/100ml，葡萄糖含量为8.99g/100ml，乙醇含量为0.37g/100ml；发酵液中乙醇含量为4.16g/100mL，木糖含量为0.84g/100mL。经计算可知，乙醇得率为68.36％，木糖消耗率为54.84％。
实施例5
按照实施例1的方法，不同的是，流加扩培时，在间歇培养结束后的种子罐中以1L/h的体积流量同时流入新鲜的液化醪滤液和流出种子液。
通过实施例1中所述的液相色谱仪对发酵原料木质纤维素的酶解液、发酵液中的产物和副产物进行分析。检测结果为：发酵原料木质纤维素的酶解液中木糖含量为1.86g/100ml，葡萄糖含量为8.99g/100ml，乙醇含量为0.37g/100ml；发酵液中乙醇含量为3.93g/100ml，木糖含量为0.95g/100ml。经 计算可知，乙醇得率为64.21％，木糖消耗率为48.92％。
实施例6
按照实施例1的方法，不同的是，流加扩培时，在间歇培养结束后的种子罐中以0.4L/h的体积流量同时流入新鲜的液化醪滤液和流出种子液。
通过实施例1中所述的液相色谱仪对发酵原料木质纤维素的酶解液、发酵液中的产物和副产物进行分析。检测结果为：发酵原料木质纤维素的酶解液中木糖含量为1.86g/100ml，葡萄糖含量为8.99g/100ml，乙醇含量为0.37g/100ml；发酵液中乙醇含量为4.30g/100ml，木糖含量为0.77g/100ml。经计算可知，乙醇得率为70.88％，木糖消耗率为58.60％。
对比例1
按照实施例1的方法，不同的是，用玉米糖化醪滤液代替玉米液化醪滤液。其中，玉米糖化醪滤液的制备方法为：以玉米为原料，进行粉碎，然后在80℃、pH值为4.8的条件下水热处理3h，再进行过滤，得到玉米液化醪滤液，然后以0.3体积‰的比例向所得玉米液化醪滤液中加入糖化酶，80℃下处理2h，再进行过滤，得到玉米糖化醪滤液，得到的玉米糖化醪滤液中还原糖的含量为22.25体积％。
通过实施例1中所述的液相色谱仪对发酵原料木质纤维素的酶解液、发酵液中的产物和副产物进行分析。检测结果为：发酵原料木质纤维素的酶解液中木糖含量为1.86g/100ml，葡萄糖含量为8.99g/100ml，乙醇含量为0.37g/100ml；发酵液中乙醇含量为3.63g/100mL，木糖含量为0.99g/100mL。经计算可知，乙醇得率为58.80％，木糖消耗率为46.77％。
将实施例1与对比例1的结果比较可知，本发明的采用以还原糖含量较低的液化醪滤液为原料进行酵母菌扩培的方法，能够明显提高发酵时的乙醇 得率和木糖消耗率。
将实施例1与实施例4的结果比较可知，流加扩培时控制pH值为4.5-5.0，利用由此得到的扩培酵母菌进行发酵，能够进一步提高发酵时的乙醇得率和木糖消耗率。
将实施例1与实施例5-6的结果比较可知，流加扩培时，体积流量为1/10-1/8V/h(V/h中的V为间歇扩培结束时种子罐中种子液的体积)时，能够进一步提高发酵时的乙醇得率和木糖消耗率。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。