通过cupin超家族的蛋白质催化的(R)‑选择性cupin‑硝基醛醇反应的制作方法
本发明涉及产生手性β硝基醇化合物的方法，其中醛或酮化合物在硝基烷烃化合物和cupin-硝基醛缩酶的存在下转化为相应的β硝基醇化合物。本发明特别涉及对映选择性催化亨利反应的(R)-选择性cupin-硝基醛缩酶。
背景技术：
生物催化过程对于化工行业已经变得非常重要。当生物催化剂的性质使两种对映体中的任一种能够与手性或前手性化合物的化学反应中优先反应或形成时，具有特别重要性的是酶的使用。
利用酶的这些有利性质的基本要求是如在工业加工中所需的其足量的低成本的可用性、足够高的反应性、选择性和在工业加工的实际条件下的高稳定性。
β硝基醇为β氨基醇的前体，其是用于生物活性化合物——如用作药物成分的麻黄碱、苯丁抑制素和鞘氨醇——合成的重要的手性结构单元。硝基醛醇(nitroaldol)或亨利反应是用于C-C键形成的有机合成中经典命名反应之一。由于创建达两个新的手性中心的潜力，其能够对映选择性和立体选择性地进行硝基醛醇加成对于合成应用是至关重要的。尽管该反应已经被熟知一个多世纪(Henry，1895)，但是利用非酶有机催化剂或手性金属催化剂的立体特异的方案最近才被开发。这些方法的发展是令人印象深刻，但它们仍然有许多缺点，包括长的反应时间、并在金属催化剂的情况下有时极端的反应条件、或者在有机催化剂的情况下选择性不足。
在过去十年中，第一个不对称的生物催化硝基醛醇反应被发现针对来自热带橡胶树巴西三叶胶(Hevea brasiliensis)(HbHNL)羟基腈裂解酶(hydroxynitrile lyase)(Purkarthofer et al.,Angew Chem Int Ed Engl.2006 45(21):3454-6,Gruber-Khadjawi et al.,Adv.Synth.Catal.2007,349,1445–1450,Yuryev,R.；et al.,Biocatal.Biotransform.,(2010)28,348；Yuryev,R.；et al.；Chemcatchem,(2010)2,981))。
属于α/β水解酶超家族的类似HbHNL的来自木薯(Manihot esculenta)的(S)-选择性MeHNL，也能够催化(S)-选择性硝基醛醇反应，虽然具有较低的活性和选择性。
催化(R)-选择性HNL催化的亨利反应的第一(R)-选择性HNL是来自Arabidobsis thaliana的AtHNL(Fuhshuku et al.J.Biotechnol.2011,153,153-159)，其也属于类似(S)-选择性硝基醛缩酶的α/β水解酶超家族。
相比之下，硝基醛醇反应中的活性到目前为止尚未针对来自属于不同蛋白质折叠的Prunus amygdalus(PaHNL)的(S)-选择性羟基腈裂解酶而显示。
然而，不幸的是，在报告的反应条件下在延长的反应时间(2小时至4小时)内AtHNL的反应产物的对映体过量显著减少，而产率没有增加(Fuhshuku et al.2011)。
施用每mmol苯甲醛40mg AtHNL，Asano和同事实现了具有50％乙酸正丁酯(30％产率和91％ee)的pH为7的两相系统中苯甲醛和MeNO2的最高对映体选择性。通过施用较大量的酶(100mg每mmol底物)进一步略微改善了产率和对映体过量。根据底物和反应系统，产率达60％或对映体过量达96％可以通过施用每mmol底物40mg AtHNL和2小时的反应时间实现。然而，其在相同的反应条件下不能共存。
然而，在报告的反应条件下在延长的反应时间(2小时至4小时)内AtHNL反应产物的对映体过量显著减少，而产率没有增加。没有使用硝基乙烷。
Gotor和同事报道了通过水中载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)的硝基醛醇反应的蛋白质介导的催化，其可以被归类为有机催化，因为科学家的观察导致非特异性蛋白催化的结论。(Busto,E.；Gotor-Fernandez,V.；Gotor,V.,Org.Process Res.Dev.,(2011)15,236)。生物催化的硝基醛醇反应也报道于酶(有关综述，参见Milner,S.E.；et al.,Eur.J.Org.Chem,(2012),3059)，诸如转谷氨酰胺酶(Tang,R.C.；et al.,J.Mol.Catal.B:Enzym.,(2010)63,62)、水解酶(Wang,J.L.；et al.,J.Biotechnol.,(2010)145,240)、蛋白酶(Lopez-Iglesias,M.；et al.,Adv.Synth.Catal.,(2011)353,2345)、脂肪酶(Le,Z.-G.；et al.,Green Chem.Lett.Rev.,(2013)6,277；Xia,W.-J.；et al.,Molecules,(2013)18,13910)、酰基转移酶(Xia,W.-J.；et al.,Molecules,(2013)18,13910)和葡糖淀粉酶(Gao,N.；et al.,RSC Adv.,(2013)3,16850)，但在所有情况下，反应不是对映选择性或均没有提供关于对映体选择性的数据。
因此，到目前为止，只有具有α/β水解酶折叠的植物HNL能够催化对映选择性的硝基醛醇反应。
另一种方法是化学-酶促方法，其中立体异构体的化学合成的混合物通过酶动力学拆分，例如使用水解酶来分离。然而，动力学拆分的主要缺点一般是产率被限制为50％最大值。
因此，仍然需要新的硝基醛缩酶，其可以对映选择性催化亨利反应。
最近，具有cupin折叠的新细菌HNL的发现已经被报道(Hajnal,I.；et al.,Febs J.,(2013)280,5815；Hussain,Z.；et al.,Appl.Environ.Biotechnol.,(2012)78,2053)，但只显示非常低的特异性活性。新的酶之一，GtHNL，被详细表征，其结构被分析(Hajnal,I.；et al.,Febs J.,(2013)280,5815；A.；et al.,Acta Crystallogr.F,(2012)68,451)。它是具有约15kDa分子量的小的金属依赖性的单cupin，其形成四聚体。
发明概要
本发明的目的是提供用于产生β硝基醇化合物的改善的方法。该方法包括提供醛或酮化合物和在硝基烷烃化合物和cupin-硝基醛缩酶的存在下将化合物转化成相应的β-硝基醇化合物的步骤。本发明特别涉及(R)-选择性cupin-硝基醛缩酶，其可以对映选择性催化亨利反应。
附图说明
图1A：GtHNL(PDB-代码:4BIF)的结构的一个cupin单体的卡通表示。
1B：SEQ ID NO:1、NO:3和NO:5-10的多序列比对。
图2：AcHNL和GtHNL以及GtHNL的三重变体(GtHNL-A40H/V42T/Q110H,简短:GtHNLmut)和AcHNL(AcHNL-A40H/V42T/Q110H,简短:AcHNLmut)与苯甲醛(20μmol)和硝基甲烷(1mmol)在具有50％TBME的双相系统中的硝基醛醇反应。使用澄清的裂解物(酶/mmol BA的量是指酶本身，假设总裂解物蛋白的约50％是HNL)或者纯化的酶。转化率和ee值在6小时的反应时间后测量。
图3：三重变体GtHNL-A40H/V42T/Q110H(简短:GtHNLmut)与苯甲醛(20μmol)和硝基甲烷(1mmol)在具有50％TBME和不同的蛋白质与底物比率的双相系统中的硝基醛醇反应。AtHNL用作参考。转化率和ee值在2小时和24小时的反应时间后测量。
图4：几种cupin-硝基醛缩酶与苯甲醛(20μmol)和硝基甲烷(1mmol)在具有50％TBME的双相系统中的硝基醛醇反应。转化率和ee值在2小时、4小时和24小时的反应时间后测定。
图5：cupin-硝基醛缩酶的蛋白质序列
SEQ ID NO:1GtHNL(Granulicella tundricola MP5ACTX9,Uniprot E8WYN5)
SEQ ID NO:2GtHNL三重变体(A40H、V42T、Q110H)的蛋白质序列
SEQ ID NO:3AcHNL(荚膜乳杆菌(Acidobacterium capsulatum)ATCC 51196；Uniprot C1F951)的蛋白质序列
SEQ ID NO:4AcHNL三重变体(A40H、V42T、Q110H)的蛋白质序列
SEQ ID NO:5cupin 2保守桶结构域蛋白(conserved barrel domain protein)(Uniprot B8ENI4)的蛋白质序列
SEQ ID NO:6cupin 2保守桶结构域蛋白(Uniprot A5G162)的蛋白质序列
SEQ ID NO:7cupin 2保守桶结构域蛋白(Uniprot C6D499)的蛋白质序列
SEQ ID NO:8未表征蛋白质(Uniprot C1D3E9)的蛋白质序列
SEQ ID NO:9cupin 2保守桶结构域蛋白(Uniprot A6U7V5)的蛋白质序列
SEQ ID NO:10cupin 2保守桶结构域蛋白(Uniprot F8IF03)的蛋白质序列
实施方式的描述
在第一方面中，本发明涉及用于产生β硝基醇化合物的方法，其中醛或酮化合物在硝基烷烃化合物和cupin-硝基醛缩酶的存在下转化为相应的β硝基醇化合物。
在另一个方面中，本发明涉及如上所述的方法，其中cupin-硝基醛缩酶包含根据图1A的保守桶结构域。
在另一个方面中，本发明涉及如上所述的方法，其中cupin-硝基醛缩酶包含具有PFAM登录CL0029的cupin超家族的保守桶结构域。
在另一个方面中，本发明涉及如上所述的方法，其中cupin-硝基醛缩酶包含具有PFAM登录PF07883的cupin 2家族的保守桶结构域。
在另一个方面中，本发明涉及如上所述的方法，其中cupin-硝基醛缩酶属于具有SCOP登录51182的RmlC样cupin超家族。
在另一个方面中，本发明涉及如上所述的方法，其中cupin-硝基醛缩酶包含根据InterPro蛋白质家族数据库的RmlC样冻辊折叠(IPR014710)。
在另一个方面中，本发明涉及如上所述的方法，其中cupin-硝基醛缩酶包含根据InterPro蛋白质家族数据库的RmlC样cupin结构域(IPR011051)。
在另一个方面中，本发明涉及如上所述的方法，其中cupin-硝基醛缩酶包含根据InterPro蛋白质家族数据库的cupin 2保守桶结构域(IPR013096)。
在另一个方面中，本发明涉及如上所述的方法，其中式I的化合物与式II的化合物在cupin-硝基醛缩酶的存在下反应，得到式III的β硝基醇化合物
其中，
R1和R2彼此独立地来自H、C1-20烷基、C2-20烯基、或C2-20炔基、C3-10环烷基、C4-20环烷基烷基、C6-14芳基、C7-20芳基烷基、3-14元杂环烷基、4-20元杂环烷基烷基、5-20元杂芳基或6-20元杂芳基烷基，任选被一个或多个Ra取代；
R3和R4彼此独立地来自H或C1-20烷基，任选被一个或多个Ra取代；和
每个Ra独立地是H、卤素、-CF3、-ORb、-NRbRb、-(CH2)nCOORb、-(CH2)nC(＝O)Rb、-(CH2)nCONRbRb、C1-20烷基、C2-20烯基、或C2-20炔基；和
每个Rb独立地为H或任选地取代的C1-20烷基、C2-20烯基、或C2-20炔基；和
n为0、1、2或3。
烷基，如果没有另外说明，指的是线性的或分支的C1-20烷基，优选为一至二十个碳原子的直链或支链，任选被取代。烷基可以被一个或多个Ra取代。
烯基，如果没有另外说明，指的是部分不饱和的线性的或分支的C2-20烯基，优选为含有至少一个双键的二至二十个碳原子的直链或支链，任选被取代。烯基可以被一个或多个Ra取代。
炔基，如果没有另外说明，指的是部分不饱和的线性的或分支的C2-20炔基，优选为含有至少一个三键的二至二十个碳原子的直链或支链，任选被取代。炔基可以被一个或多个Ra取代。
环烷基指的是含有三至十个碳原子、优选四至六个碳原子的单环的非芳香烃环，或含有七至十个碳原子、优选七个碳原子的双环的非芳香烃环系统，其中环烷基任选地包含一个或多个双键或三键，任选被取代。环烷基可以被一个或多个Ra取代。
杂环烷基指的是含有三至十四个碳原子、优选四至八个碳原子的单环的非芳香烃环，或含有七至十四个碳原子、优选八至十个碳原子的双环的非芳香烃环系统，其中在杂环烷基中，烃环或环系统中的一个或多个碳原子被选自–N–、–O–、–S–、–S(O)–、–S(O)2–、–Si–和–P–的基团取代；其中杂环烷基任选包含一个或多个双键，任选被取代。杂环烷基可以被一个或多个Ra取代。
芳基优选指的是单、双、三或四环的芳香族烃基团，优选具有六至十四个碳原子的单环芳香族烃基团；芳基优选地为苯基，任选被取代，任选被取代。芳基可以被一个或多个Ra取代。
杂芳基指的是芳香族5或6元单环的烃基团，其中至少一个碳原子由杂原子如O、N、和/或S替换，并且其中芳香族单环的5或6元环烃基团任选稠合到另外的单环的5至7元、优选5或6元芳香族或非芳香族烃环，其中在另外的单环的芳香族或非芳香族烃环中，一个或多个、优选一个或两个碳原子可以被杂原子如O、N、和/或S替换，任选被取代。杂芳基可以被一个或多个Ra取代。
卤素基团为氯、溴、氟或碘。
本文所用的任选被取代，是指选自紧挨着取代的和未取代的C6-14芳基或C5-14杂芳基残基的卤素、-OH、-OCH3、-CN、羰基和羧基、C1-20烷基、C2-20烯基、和C2-20炔基的取代基。
该方法可以在单或双相系统或乳液中进行。
单相反应溶液包含水或有机溶剂。
合适的水溶液是例如水、含cupin-硝基醛缩酶溶液、或缓冲溶液。缓冲溶液的实例是磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、MES、HEPES、Tris缓冲液、或它们的混合物。这些溶液的pH可以在pH 2和9之间，优选为4至7。
合适的有机溶液可以是稍微水混溶的或水不混溶的脂肪族或芳香族烃，其是任选卤代的醇、醚或酯或它们的混合物或底物本身。合适的是，例如，但不限于乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲基叔丁基醚、二异丙醚、二丁醚、四氯化碳、苯、甲苯、环己烷、十六烷、己烷、庚烷、氯仿、二甲苯、戊醇、己醇、辛醇和十二烷醇、DMF、DMSO、乙腈、硝基甲烷、硝基乙烷、或它们的混合物。新的溶剂也是适用的，其指的是离子液体和超临界流体。
水-有机溶剂两液相系统中的导电生物转化的优点在本领域中是公知的。双相系统由互不混溶的两相组成，例如水相和有机。
在进一步的方面，本发明涉及如上所述的方法，其中反应在单或双相系统或在乳液中进行。
在进一步的方面，本发明涉及如上所述的方法，其中双相系统包含如本文所述的水溶液和有机溶液。
本发明的cupin-硝基醛缩酶可以作为纯化的酶或作为整个细胞悬浮液或包含于无细胞裂解物内或以固定化的形式，例如在诸如Avicel等载体上，或作为交联酶聚合体(CLEA)而存在。
此外转化发生在-10℃至+50℃，优选在0℃至35℃的温度下。
适用的亲电体选择在芳香族至杂芳香族和脂族醛范围内。根据底物和反应系统，产率达97.3％或对映体过量>99％可以通过本发明的方法得到。
在进一步的方面，本发明涉及如上所述的方法，其中β硝基醇化合物在至少55％，优选至少60％，更优选至少75％对映体过量(e.e.)下获得。
在进一步的方面，本发明涉及如上所述的方法，其中β-硝基醇化合物在至少10％，优选至少20％，更优选至少50％的转化率下获得。
蛋白质cupin超家族的蛋白质(PFAM：CL0029)含有由10至12个反平行β链构成的保守β桶结构域(图1A)。Cupa是桶的拉丁术语。在蛋白质数据库的结构分类(SCOP)中，它们被分类为双链β螺旋折叠内的RmlC样cupins超家族[51182]。cupin折叠在多种酶，但也在非酶蛋白中被发现。Cupin结构域可以单独地或与其它结构域组合地在蛋白质结构中被一次、两次或更多次发现。虽然cupin超家族中的蛋白质显示出非常低的总序列相似性，但是它们都包含由在长度和氨基酸序列两者中有变化的较不保守的基序间(intermotif)区域分开的两个短的但部分保守的cupin序列基序(图1)。cupin超家族的蛋白质在古细菌、细菌和真核生物中具有广泛的生物学功能。
Cupin在结构上是保守的，并且通常含有两个保守基序，G-(X)5-H-X-H-(X)3,4-E-(X)6-G(基序1)和G-(X)5-P-X-G-(X)2-H-(X)3-N(基序2)，总体序列同一性是在该超家族的成员中是低的。这两个基序还包括用于金属结合的残基。大多数cupin是金属结合蛋白，其结合二价阳离子，如铁、锌、锰、铜、镍或镉。该金属通常直接在反应机理中或至少经由与底物的相互作用来参与酶促反应。
在进一步的方面中，本发明涉及cupin-硝基醛缩酶，其能够催化非对称β硝基醇反应，其中转化率为至少10％，优选至少20％，更优选至少50％。
在进一步的方面中，本发明涉及cupin-硝基醛缩酶，其中cupin-硝基醛缩酶包含根据图1A的保守桶结构域。
在进一步的方面中，本发明涉及cupin-硝基醛缩酶，其中cupin-硝基醛缩酶包含具有PFAM登录CL0029的cupin超家族的保守桶结构域。
在进一步的方面中，本发明涉及cupin-硝基醛缩酶，其中cupin-硝基醛缩酶包含具有PFAM登录PF07883的cupin 2家族的保守桶结构域。
在进一步的方面中，本发明涉及cupin-硝基醛缩酶，其中cupin-硝基醛缩酶属于具有SCOP登录51182的RmlC样cupin超家族。
在另一个方面中，本发明涉及cupin-硝基醛缩酶，其中cupin-硝基醛缩酶包含根据InterPro蛋白质家族数据库的RmlC样冻辊折叠(IPR014710)。
在另一个方面中，本发明涉及cupin-硝基醛缩酶，其中cupin-硝基醛缩酶包含根据InterPro蛋白质家族数据库的RmlC样cupin结构域(IPR011051)。
在另一个方面中，本发明涉及cupin-硝基醛缩酶，其中cupin-硝基醛缩酶包含根据InterPro蛋白质家族数据库的cupin 2保守桶结构域(IPR013096)。
本发明的进一步的方面是如上所述的cupin-硝基醛缩酶，其是重组cupin-硝基醛缩酶。
本发明的进一步的方面是如上所述的cupin-硝基醛缩酶，其包含至少一个、具体地至少两个、具体地至少三个、具体地至少四个、具体地至少五个或更多个氨基酸修饰。
根据本发明，术语“修饰”指的是至少一个氨基酸的缺失或取代或插入。具体地，修饰是一个氨基酸的取代。
在本发明的具体实施方式中，cupin-硝基醛缩酶包含一个、两个或三个氨基酸取代。
根据本发明的实施方式，任何氨基酸可以被选择用以取代野生型序列的氨基酸。
被取代的氨基酸选自精氨酸、赖氨酸、组氨酸和苏氨酸。具体地，所述被取代的氨基酸是精氨酸、组氨酸或苏氨酸。
在进一步的方面中，本发明涉及如上所述的cupin-硝基醛缩酶，其中cupin-硝基醛缩酶的氨基酸序列与各自的野生型酶至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、或至少98％相同。
在进一步的方面中，本发明涉及如上所述的cupin-硝基醛缩酶，其在根据SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3的编号的位置40、42和/或110中的任一处进行修饰(图1B)。
在进一步的方面中，本发明涉及如上所述的cupin-硝基醛缩酶，其在根据SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的编号的位置40、42和/或110中的任一处进行修饰(图1B)。
根据本发明的实施方式，位置40、42和/或110中的任一处的修饰是氨基酸取代。
根据进一步的实施方式，本发明的cupin-硝基醛缩酶变体含有保守桶结构域的位置40、42和110中的任一处的一个、两个或三个取代。
在进一步的方面中，本发明涉及如上所述的cupin-硝基醛缩酶，其具有SEQ ID NO:2(GtHNLmut)或(SEQ ID NO:4(AcHNLmut)。
根据进一步的实施方式，cupin-硝基醛缩酶变体是根据SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5至10的编号的A40H或A40R。
根据进一步的实施方式，cupin-硝基醛缩酶变体是根据SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5至10的编号的V42T或Q110H。
根据进一步的实施方式，cupin-硝基醛缩酶变体是根据SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5至10的编号的A40H V42T。
根据具体的实施方式，cupin-硝基醛缩酶变体是根据SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5至10的编号的A40H V42T Q110H。
在进一步的方面中，本发明涉及如上所述的cupin-硝基醛缩酶，其特征在于其包括通式：(X1)(X2)(X3)(X4)F(X5)PGAR(X6)(X7)WH(X8)HP(X9)G的氨基酸序列，其中，
X1为A、V、L、F、Y、M、S、T、G、H、N、K或R残基，优选地其是A、或N；
X2是任意氨基酸，优选地其是S、H、A、或T；
X3为V、A、I、C、M、H、或T残基，优选地其是V；
X4是任意氨基酸，优选地其是T或R；
X5是任意氨基酸，优选地其是E；
X6是T、S或N残基，优选地其是T；
X7是任意氨基酸，优选地其是A；
X8是T、S、或者I残基，优选地其是T；
X9是任意氨基酸，优选地其是L；
并且其中位置X1或X3中的至少一个被H、K、R或T残基取代。
在进一步的方面中，本发明涉及如上所述的cupin-硝基醛缩酶，其特征在于其包括通式：(X1)(X2)(X3)(X4)F(X5)PGAR(X6)(X7)WH(X8)HP(X9)G的氨基酸序列，其中，
X1为A、V、L、F、Y、M、S、H、G、N、K或R残基，优选地其是A、或N；
X2是任意氨基酸，优选地其是S、H、A、或T；
X3为V、A、I、C、M、或T残基，优选地其是V；
X4是任意氨基酸，优选地其是T或R；
X5是任意氨基酸，优选地其是E；
X6是T、S或N残基，优选地其是T；
X7是任意氨基酸，优选地其是A；
X8是T、S、或者I残基，优选地其是T；
X9是任意氨基酸，优选地其是L；
并且其中位置X1或X3中的至少一个被H、K、R或T残基取代。
在进一步的方面中，本发明涉及如上所述的cupin-硝基醛缩酶，其特征在于其包括通式：(X1)(X2)(X3)(X4)F(X5)PGAR(X6)(X7)WH(X8)HP(X9)G的氨基酸序列，其中，
X1为A、V、L、F、Y、M、S、T、G、N、K或R残基，优选地其是A、或N；
X2是任意氨基酸，优选地其是S、H、A、或T；
X3为V、A、I、C、M、或H残基，优选地其是V；
X4是任意氨基酸，优选地其是T或R；
X5是任意氨基酸，优选地其是E；
X6是T、S或N残基，优选地其是T；
X7是任意氨基酸，优选地其是A；
X8是T、S、或者I残基，优选地其是T；
X9是任意氨基酸，优选地其是L；
并且其中位置X1或X3中的至少一个被H、K、R或T残基取代。
在进一步的方面，本发明涉及如上所述的cupin-硝基醛缩酶，其特征在于其包括通式：(X1)(X2)(X3)(X4)F(X5)PGAR(X6)(X7)WH(X8)HP(X9)G的氨基酸序列，其中
X1为A、V、L、F、Y、M、S、G、N、K或R残基，优选地其是A、或N；
X2是任意氨基酸，优选地其是S、H、A、或T；
X3为V、A、I、C、或M残基，优选地其是V；
X4是任意氨基酸，优选地其是T或R；
X5是任意氨基酸，优选地其是E；
X6是T、S或N残基，优选地其是T；
X7是任意氨基酸，优选地其是A；
X8是T、S、或I残基，优选地其是T；
X9是任意氨基酸，优选地其是L；
并且其中位置X1或X3中的至少一个被H、K、R或T残基取代。
在进一步的方面中，本发明涉及如上所述的cupin-硝基醛缩酶，其特征在于其包括通式：(X1)(X2)(X3)(X4)FEPGARTAWHTHPLG的氨基酸序列，其中
X1为A、V、L、F、Y、M、S、T、G、H、K、N或R残基，优选地其是A、或N；
X2是任意氨基酸，优选地其是S、H、A、或T；
X3为V、A、I、C、M、H、或T残基，优选地其是V；
X4是任意氨基酸，优选地其是T或R；
并且其中位置X1或X3中的至少一个被H、K、R或T残基取代。
在进一步的方面中，本发明涉及如上所述的cupin-硝基醛缩酶，其特征在于其包括通式：(X1)(X2)(X3)(X4)FEPGARTAWHTHPLG的氨基酸序列，其中
X1为A、V、L、F、Y、M、S、T、G、H、或N残基，优选地其是A、或N；
X2是任意氨基酸，优选地其是S、H、A、或T；
X3为V、A、I、C、M、H、或T残基，优选地其是V；
X4是任意氨基酸，优选地其是T或R；
并且其中位置X1或X3中的至少一个被H、K、R或T残基取代。
在进一步的方面中，本发明涉及如上所述的cupin-硝基醛缩酶，其特征在于其包括通式：(X1)(X2)(X3)(X4)FEPGARTAWHTHPLG的氨基酸序列，其中
X1为A、V、L、F、Y、M、S、T、G、H、K、N或R残基，优选地其是A、或N；
X2是任意氨基酸，优选地其是S、H、A、或T；
X3为V；
X4是任意氨基酸，优选地其是T或R；
并且其中位置X1或X3中的至少一个被H、K、R或T残基取代。
在进一步的方面中，本发明涉及如上所述的cupin-硝基醛缩酶，其特征在于其包括通式：(X1)(X2)(X3)(X4)FEPGARTAWHTHPLG的氨基酸序列，其中
X1为A、V、L、F、Y、M、S、G、N、K或R残基，优选地其是A、或N；
X2是任意氨基酸，优选地其是S、H、A、或T；
X3为V、A、I、C、或M残基，优选地其是V；
X4是任意氨基酸，优选地其是T或R；
并且其中位置X1或X3中的至少一个被H、K、R或T残基取代。
在进一步的方面中，本发明涉及如上所述的cupin-硝基醛缩酶，其特征在于其包括通式：(X1)(X2)(X3)(X4)FEPGARTAWHTHPLG的氨基酸序列，其中
X1为A、或N残基，优选地其是A；
X2是任意氨基酸，优选地其是S、H、A、或T；
X3为V、A、I、C、或M残基，优选地其是V；
X4是任意氨基酸，优选地其是T或R；
并且其中位置X1或X3中的至少一个被H、K、R或T残基取代。
在进一步的方面中，本发明涉及如上所述的cupin-硝基醛缩酶，其特征在于其包括通式：(X1)(X2)(X3)(X4)FEPGARTAWHTHPLG的氨基酸序列，其中
X1为A、或N残基，优选地其是A；
X2是任意氨基酸，优选地其是S、H、A、或T；
X3为V；
X4是任意氨基酸，优选地其是T或R；
并且其中位置X1或X3中的至少一个被H、K、R或T残基取代。
在进一步的方面中，本发明涉及cupin-硝基醛缩酶，其具有根据SEQ ID NO：1或3或SEQ ID NO：5至10的编号的以下突变A40H、A40R、V42T和/或Q110H中的一个或多个。
在进一步的方面中，本发明涉及编码如上所述的cupin-硝基醛缩酶的分离的多核酸分子。
在本发明的进一步的方面中，提供编码如上所述的cupin-硝基醛缩酶的分离的多核酸分子。该多核酸可以是DNA或RNA。由此而导致编码如上所述的本发明的cupin-硝基醛缩酶的修饰在DNA或RNA水平上进行。该分离的多核酸分子适用于如上所述的本发明的cupin-硝基醛缩酶的大规模生产。
在进一步的方面中，本发明涉及包含如上所述的分离的DNA分子的载体。
载体包含有效转染以及蛋白质有效表达必需的所有调控元件。这样的载体是本领域公知的，并且任何合适的载体可以被选择用于此目的。
本发明的另一方面涉及用如上所述的本发明的载体转染的重组非人类细胞。在本领域中公知的，可以进行细胞的转染和重组细胞的培养。这样的重组细胞以及任何来自其的后代细胞包含载体。从而提供连续地或依赖于载体活化后表达本发明cupin-硝基醛缩酶蛋白的细胞系。
在进一步的方面中，本发明涉及通过培养如上所述的重组细胞而获得的培养物。
重组细胞可以在金属离子的存在下，优选在铁或锰的存在下进行培养。
在进一步的方面中，本发明涉及从如上所述的培养物中回收的cupin-硝基醛缩酶。具体而言，该蛋白质可以通过破坏细胞并从上清液中回收蛋白质来进行分离。
在进一步的方面中，本发明涉及用于产生cupin-硝基醛缩酶的方法，其包括从如上所述的培养物中回收cupin-硝基醛缩酶。从细胞培养物进行的所述分离或纯化可以通过本领域中已知的方法进行。具体地，亲和层析、阴离子交换层析和大小排阻层析可以用于分离所述蛋白质。
在进一步的方面中，本发明涉及如上所述产生的cupin-硝基醛缩酶，其用缓冲液中金属盐——例如FeCl2、MnCl2、CoCl2、NiCl2、CuCl2或ZnCl2——的溶液通过本领域中已知的方法进行温育。
在进一步的方面中，本发明涉及如上所述产生的cupin-硝基醛缩酶，其中金属通过本领域已知的方法在体外交换成锰、铁、镍、钴、铜或锌。
实施例
以下实施例被阐述以用于帮助理解本发明，但并不意图并且不应当被解释为以任何方式限制本发明的范围。该实施例不包括常规方法，例如克隆、转染、和用于过度表达微生物宿主细胞中蛋白质的方法的基本方面的详细说明。这样的方法是本领域技术人员公知的。
实施例1.蛋白质产生
编码来自荚膜乳杆菌ATCC 51196(Uniprot C1F951,Ward et al.,Appl.Environ.Microbiol(2009)75,2046)的假定蛋白的基因(基因ID:NC_012483)针对大肠杆菌进行密码子优化(GeneArt,Life Technologies,Carlsbad,CA,USA)(以下称为AcHNL)。编码区两侧具有NdeI和HindIII限制位点，所述限制位点用于将基因克隆进表达载体pET26b(+)(Novagen,Merck KGaA,Darmstadt,Germany)。
对大肠杆菌进行密码子优化的编码对应于来自Granulicella tundricula的GtHNL的AciX9_0562(基因ID:322434201)的序列之前被克隆进表达载体pET26b(+)(Hajnal et al.,FEBS J.2013 280(22):5815-28)。GtHNL用作模板以用于半理性蛋白质设计(semi-rational protein design)，更详细地为位点饱和突变。突变A40H、V42T和Q110H导致改善的变体。在位置A40、V42和Q110处的最好的氨基酸交换通过定点突变进行组合。在位置A40、V42和Q110处的相同的氨基酸交换随后也通过定点突变引入到AcHNL序列中。
大肠杆菌BL21-Gold(DE3)用作表达宿主(Stratagene,La Jolla,CA,USA)。细胞生长在补充硫酸卡那霉素(40mg/L的最终浓度)的LB(溶菌肉汤，Lennox)培养基(Carl Roth GmbH,Karlsruhe,Germany)中。通过向OD600～0.8培养物加入0.5mM的IPTG(异丙β-D-1-半乳糖硫吡喃糖苷)启动重组蛋白的表达，并在25℃下继续培养20小时。所有的酶通过表达培养基中存在的锰来产生。常规地，100μΜ的MnCl2伴随诱导加入。收获细胞，将其重新悬浮于冷缓冲液(50mM磷酸钾缓冲液pH 6.0)并通过超声处理(Branson Sonifier S-250，设定为80％工作循环，和输出控制7)两次持续3分钟而破坏，将其在冰上冷却。将细胞裂解物以50,000g离心一小时，以除去未破坏的细胞和不溶物质。无细胞裂解物通过0.45μm注射过滤器进行过滤，并且如果有需要，使用Vivaspin 20离心过滤装置(10,000道尔顿截留分子量；Sartorius)将其浓缩至所需的浓度。将裂解物等分并冷冻直至进一步使用。蛋白质表达通过标准SDS-PAGE监测。AcHNL和GtHNL以及含有氨基酸取代A40H、A40R、V42T和Q110H的GtHNL和AcHNL变体在大肠杆菌BL21-Gold(DE3)中作为可溶性蛋白高产率表达，达到>总可溶性蛋白的50％的产率。
纯化步骤改编自针对施用阴离子交换层析法和大小排阻层析法的GtHNL发表的方案(Hajnal et al.,2013)。简言之，在缓冲液A(50mM Bis-Tris/HCl,pH 6.8或6.9,50mM NaCl)中将细胞通过超声处理裂解，并将澄清的裂解物装载在QSepharose阴离子交换柱(HiTrapTM Q FF 5mL,GE Healthcare,Uppsala,Sweden)上。蛋白质用10％缓冲液B(50mM Bis-Tris/HCl,pH 6.6,1M NaCl)洗脱。在利用50mM NAPi，pH7.0，100mM NaCl预平衡的Superdex 75HiLoad 16/600柱(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)上进行大小排阻层析。含有目的蛋白的组分被汇集，且缓冲液交换至PD-10柱(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)上的50mM KPi，pH 6.0。常规地使用Bradford测定法(Biorad,Hercules,CA,USA)测定无细胞裂解物的蛋白质浓度。施用基于使用Protparam的氨基酸序列计算的消光系数利用NanoDrop分光光度计(型号2000c,Peqlab,Erlangen,Germany)在280nm测定纯化的蛋白质的浓度。将蛋白质保存在-80℃或-20℃直到进一步使用。成功掺入通过电感耦合等离子体/发射光谱(ICP-OES)证实。
实施例2.两相系统中硝基醛醇反应
使用由溶解在MTBE中的苯甲醛和硝基甲烷作为有机相和包含pH 6的磷酸盐缓冲液中的无细胞裂解物或纯化的酶的水相组成的两相系统检测这些酶催化β硝基醇合成的能力。
含有内标(0.2％1,3,5-三异丙苯，IS)、苯甲醛(20μmol，BA)和硝基甲烷(1mmol，NM)的有机溶剂(500μL MTBE)与500μL含有无细胞裂解物(约0.5-3mg含约50％cupin硝基醛缩酶的总蛋白)或纯化的酶(约0.3-1.5mg)的pH为6的50mM磷酸钾缓冲液进行混合。不含酶、在MnCl2不存在下表达的AcHNL的无细胞裂解物、或者只是具有和没有MnCl2的缓冲液被用作阴性对照。使用如Asano的组描述的被作为合成基因并克隆到质粒pET28a(+)-载体、表达和纯化的阳性对照AtHNL(2-3mg)(Fuhshuku et al.,2011)。需要注意的是由于在较低的pH值下AtHNL的稳定性问题，将其在pH 6.5下施用。将混合物在Eppendorf Thermomixer装置中在30℃和1200rpm下温育2-24小时。在13,000rpm下离心5分钟停止反应。五十μL有机相用450μL HPLC溶剂混合物进行稀释并通过手性HPLC分析。
利用苯甲醛和硝基甲烷进行的第一cupin-硝基醛缩酶催化的亨利反应的结果显示在图2和表1中。
表1.与图2相关的转化率和ee值。
n.d.:由于过低的转化率而没有测定
在温育6小时后，AcHNL显示出19％的转化率和88％的ee。GtHNL-A40H/V42T/Q110H实现了近70％的转化率和97％ee。如果施用澄清的裂解物或纯化的酶，没有观察到区别。因此，纯化的酶在所施加的反应条件下是稳定的，但在另一方面不需要进行纯化以获得良好至优异的ee值。所有的阴性对照、在MnCl2不存在下表达的AcHNL、以及在缓冲液或不含酶的大肠杆菌裂解物中施加的MnCl2无活性。因此，cupin蛋白质和锰二者组合对于硝基醛醇酶活性是必要的。
为了进一步探讨较低量的酶是否也可以达到良好的转化率，该ee是否可通过施用较短的反应时间来进一步提高，和该ee在较长的温育时间是否稳定，重复GtHNL-A40H/V42T/Q110H的反应(图3和表2)。
表2.与图3相关的转化率和ee值。
n.d.:由于过低的转化率而没有测定
相比有关AtHNL文献(Fuhshuku et al.,2011)中报道的值和还由我们测定的值，以上提到的新发现的GtHNL三重变体比AtHNL更具活性，并且其显示更高的对映选择性。
重要的是，相比AtHNL，通过较长的温育时间可实现GtHNL-A40H/V42T/Q110H的更高产率，几乎没有失去对映选择性。
测试单变体AcHNL和GtHNL催化硝基醛醇反应的能力。
表3.转化率和ee值
实施例3.硝基乙烷添加至苯甲醛
测试纯化的AcHNL、AcHNL-A40H、AcHNL-A40R、AcHNL-A40H/V42T/Q110H、GtHNL-A40R和GtHNL-A40H/V42T/Q110H在硝基醛醇反应中使用硝基乙烷代替硝基甲烷的能力。如实施例2中所述进行反应，区别在于使用1mmol硝基乙烷代替硝基甲烷。
使用纯化的酶，利用苯甲醛和硝基乙烷进行的第一cupin-硝基醛缩酶催化的亨利反应的结果显示在图4和表4中。
表4.与图4相关的转化率和ee值
硝基乙烷添加至苯甲醛同时产生了两个新的立体中心并且得到2-硝基-1-苯基丙醇的非对映混合物。在2小时反应时间后，AcHNL的反/顺比为2:1和反式异构体的对映体过量是85％。因此，该产物混合物包含约60％的预期的主要产物(1R,2S)-2-硝基-1-苯基丙醇。用单变体AcHNL-A40H，(1R,2S)-2-硝基-1-苯基丙醇的比例进一步提高到70％。
实施例4.硝基甲烷添加至各种醛
如实施例2中所述，用2-Cl-苯甲醛、己醛或环己烷甲醛代替苯甲醛的修饰进行反应。
表5.转化率和ee值。
反应条件：由1:1的TBME和pH 6.0的50mM KPi组成的两相系统中的醛(20mM)和硝基甲烷(1M)，反应体积1mL，30℃，1200rpm，24小时。使用纯化的酶(2.5mg)。
实施例5.硝基醛醇反应的金属-依赖性
为了从GtHNL-A40H/V42T/Q110H除去金属离子，纯化的蛋白质(如实施例1中所述)针对在100mM醋酸钠和150mM NaCl中的20mM 2,4-吡啶二羧酸一水合物(PDCA)在pH 5.5下进行透析50小时，并随后针对20mM Tris/HCl在pH7.5下透析20小时。所得脱辅基蛋白用10倍摩尔过量的FeCl2、MnCl2、CoCl2、NiCl2或ZnCl2在室温下温育2.5小时。除去未结合的金属且用PD-10柱将缓冲液交换至pH 6.0的50mM KPi。用ICP-OES进行金属分析。
如实施例2中所述进行反应。
表6.转化率和ee值。
a在表达培养基中在MnCl2的存在下表达GtHNL-A40H/V42T/Q110H。
b通过螯合剂2,4-吡啶二羧酸除去结合的金属。由ICP-OES检测痕量的锰。
c用各自的金属盐温育脱辅基蛋白。
实施例6.具有硝基醛醇活性的其它Cupin-HNL
具有与SEQ ID NO：1和3的58％和84％之间的序列同一性的几个其他cupin(Wiedner,R.；et al.,Comp.Struct.Biotechnol.J.,(2014),10,58)被用于测试其催化硝基醛醇反应的能力。如实施例1中所述进行蛋白的表达和无细胞裂解物的制备。
表7.具有与SEQ ID NO：1和3的高至适中的序列同一性(Seq id)的Cupin-HNL。
1.Chen Y,Crombie A,Rahman MT,Dedysh SN,Liesack W et al.(2010)J Bacteriol 192:3840-3841.
2.de Groot A,Dulermo R,Ortet P,Blanchard L,Guerin P et al.(2009)JPLoS Genet 5.Available:http://dx.plos.org/10.1371/journal.pgen.1000434.
3.Reeve W,Chain P,O'Hara G,Ardley J,Nandesena K et al.(2010)Genomic Sci 2:77-86.
4.Chen Y,He Y,Zhang B,Yang J,Li W et al.(2011)J Bacteriol 193:5602-5603.
如实施例2中所述进行反应。
表8.转化率和ee值。
实施例7.水系统中的硝基醛醇反应
采用由5μmol苯甲醛、0.3mmol硝基甲烷、和在pH 6，500μL的50mM磷酸钾缓冲液中的0.375mg总裂解物蛋白(含约50％cupin-硝基醛缩酶)或0.5mg纯化蛋白组成的单相系统检测cupin-硝基醛缩酶催化合成β-硝基醇的能力。在30℃下和1200rpm下温育1小时后，通过利用含有0.2％内标(1,3,5-三异丙基苯，IS)的500μL MTBE萃取来使反应停止。五十μL的有机相用450μL的HPLC溶剂混合物稀释并通过手性HPLC分析。
用苯甲醛和硝基甲烷进行的第一cupin-硝基醛缩酶催化的亨利反应的结果显示在表9中。
表9.转化率和ee值。
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