本发明涉及d-苯基甘氨酸甲酯的半硫酸盐，制备所述盐的方法以及所述盐在抗生素的酶促合成中的用途。
背景技术：
：通过用侧链酸衍生物(例如酰胺或酯)酰化母体氨基β-内酰胺部分的半合成β-内酰胺抗生素的酶促生产已经在专利文献中广泛描述，例如de2163792，de2621618，ep339751，ep473008，us3,816,253，wo92/01061，wo93/12250，wo96/02663，wo96/05318，wo96/23796，wo97/04086，wo98/56946，wo99/20786，wo2005/00367，wo2006/069984和wo2008/110527。本领域中使用的酶大多数情况下是从大肠杆菌获得的青霉素酰基转移酶，并且固定在各种类型的水不溶性材料上(例如，wo97/04086)。由于生物催化剂的敏感性，酶方法通常对污染物的存在具有严格的要求。通常，不需要的杂质扰乱酶的正常功能。为此，在通过用侧链酸衍生物(例如酰胺或酯)酰化母体氨基β-内酰胺部分来酶促生产半合成β-内酰胺抗生素时，原料优选具有尽可能高的纯度。后者通常通过分离原料，优选通过结晶来实现。例如，对于d-4-羟基苯基甘氨酸，抗生素如阿莫西林、头孢羟氨苄和头孢丙烯的侧链，可以容易地实现活化衍生物如酰胺或酯的结晶。然而对于d-苯基甘氨酸，抗生素如氨苄青霉素、头孢克洛和头孢氨苄的侧链来说，这是一个主要问题。到目前为止，还没有关于结晶d-苯基甘氨酸甲酯的分离的任何报道，d-苯基甘氨酸甲酯是酶制备氨苄青霉素、头孢克洛和头孢氨苄的最受青睐的原料之一。然而如wo2008/110527中所述，需要高度纯化的d-苯基甘氨酸甲酯，因为痕量的d-苯基甘氨酸的存在对酶促偶联反应的产率具有强烈的负面影响。这归因于以下事实：由于在酶促偶联反应条件下游离侧链的低溶解度，在酶促偶联反应中游离侧链的浓度存在上限。该限度由游离侧链不应结晶或沉淀的要求决定，因为沉淀物负面影响酶促偶联反应的加工。此外，在半合成β-内酰胺化合物的下游加工的最后步骤中，必须除去污染的d-苯基甘氨酸，例如用半合成β-内酰胺化合物的最终结晶步骤的母液。在较高水平的d-苯基甘氨酸下，需要更多的母液以除去d-苯基甘氨酸，这又导致半合成的β-内酰胺化合物的较高损失。导致固体形式的侧链酯分离的单元操作使半合成抗生素的生产过程复杂化，并且明显造成其成本价格。因此，d-苯基甘氨酸甲酯中不想要的d-苯基甘氨酸的量应该尽可能低。为了实现这一点，可以以盐的形式分离d-苯基甘氨酸甲酯。已经报道了几种盐，例如烷基磺酸盐或芳基磺酸盐和盐酸，并且通过这种分离方法可以除去不需要的痕量的d-苯基甘氨酸。然而，这些盐带来某些缺点，例如引入新的有机杂质盐。原则上，盐酸盐是用于分离d-苯基甘氨酸甲酯的纯化衍生物的有吸引力的候选物，但不幸的是，青霉素酰基转移酶是一类受氯化物盐的存在负面影响的酶，因此使用盐酸d-苯基甘氨酸甲酯的盐酸盐在酶促合成中伴随着另外的问题，该问题比最初提出要解决的问题的量级更大。正是由于这个原因，仍然需要可以分离，具有足够纯度并且没有与d-苯基甘氨酸甲酯的盐酸盐有关的问题的d-苯基甘氨酸甲酯的衍生物。发明详述本发明的目的是提供d-苯基甘氨酸甲酯的衍生物，其可以被分离，具有足够的纯度并且可以在产生氨苄青霉素、头孢克洛和头孢氨苄的酶促过程中使用而没有抑制副作用。术语“核”在本文中定义为半合成β-内酰胺的β-内酰胺部分，并且可以是任何青霉烯或头孢烯，例如6-氨基青霉烷酸(6-apa)，7-氨基脱乙酰氧基头孢菌酸(7-adca)，7-氨基头孢烷酸(7-aca)或7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸酯(7-acca)。术语“侧链”在本文中定义为在半合成β-内酰胺化合物中连接到如本文所定义的核中的6-氨基或7-氨基位置的部分，即氨苄青霉素、头孢克洛和头孢氨苄中的d-苯基甘氨酸。术语“游离侧链”是侧链的未衍生形式，即d-苯基甘氨酸。术语“侧链酯”是游离侧链的酯形式，其中游离侧链的羧基被酯化至醇，例如d-苯基甘氨酸甲酯。侧链酯可以是游离碱形式或盐形式，例如硫酸盐形式。术语“d-苯基甘氨酸甲酯的半硫酸盐”(缩写为(pgmh)2so4)是指式(1)的化合物，其具有式c18h24n2so8。在第一方面，本发明提供了分离形式的d-苯基甘氨酸甲酯的半硫酸盐((pgmh)2so4)。优选地，所述(pgmh)2so4是结晶的。在一个实施方案中，结晶(pgmh)2so4具有如图1中给出的xrd粉末衍射图。优选地，所述xrd粉末衍射图显示在6.1±0.2度2-θ，12.1±0.2度2θ，18.8±0.2度2-θ和24.1±0.2度2-θ处的峰。更优选地，所述xrd粉末衍射图显示在7.9±0.2度2-θ，14.4±0.2度2-θ，15.6±0.2度2-θ，16.7±0.2度2-θ，19.5±0.2度2-θ和25.6±0.2度2-θ处的额外峰。本发明的(pgmh)2so4有利地是稳定的固体。唯一的其它已知的d-苯基甘氨酸甲酯的稳定无机酸盐是盐酸盐。然而，后一种盐具有一些缺点，例如对酶性能的负面影响和作为副产物的腐蚀性氯化物的释放。已知氯化物的形成对工业反应器具有不利影响，并且使用本发明的(pgmh)2so4形成的硫酸盐不会发生这种现象。令人惊奇的是，本发明的(pgmh)2so4在半合成的含d-苯基甘氨酸的β-内酰胺化合物如氨苄青霉素、头孢克洛或头孢氨苄的酶促合成中的应用产生了与使用如在us8,541,199中提倡的d-苯基甘氨酸甲酯的硫酸盐的溶液相比优异的结果。在一个实施方案中，抗生素头孢氨苄可以使用本发明的(pgmh)2so4以更高的产率从7-adca酶促制备，具有更高的转化率并且不想要的d-苯基甘氨酸的形成更低。在第二方面，本发明提供了制备(pgmh)2so4的方法，其包括以下步骤：(a)使有机溶剂中的d-苯基甘氨酸甲酯的溶液与硫酸接触；(b)从步骤(a)中获得的混合物中分离d-苯基甘氨酸甲酯的半硫酸盐。优选地，选择硫酸的量，使得相对于(pgmh)2so4的摩尔量，硫酸的摩尔量为0.4至0.6。在优选的实施方案中，通过分离步骤(a)中的水相和从其结晶(pgmh)2so4来分离(pgmh)2so4。结晶可以根据本领域技术人员已知的方法进行，例如通过降低温度。发现优选的结晶温度为-5至15℃，更优选0至10℃。在一个实施方案中，发现总产率可以通过再循环在上述方法的步骤(b)中分离后剩余的水相来改进。因此，在如上所述的方法的下一循环中将水性母液加入步骤(a)的混合物中。优选进行循环，使得在加入步骤(a)的混合物之前，弃去部分水性母液。合适的小部分为1至50体积％，优选2至25体积％，更优选3至15体积％。作为相分离的结果，发现该再循环可以进行而不累积杂质。第二方面的方法可以用各种有机溶剂进行。已经发现，优选的溶剂是在水中的溶解度为0％(w/w)至25％(w/w)并且极性指数为1至5的那些。优选地，所述极性指数为2至3，因为这通常导致最佳结果。优选的溶剂是乙酸丁酯、二乙醚、乙酸乙酯、甲基异丁基酮和甲基叔丁基醚。在第三方面，本发明提供了(pgmh)2so4在制备氨苄青霉素、头孢克洛或头孢氨苄中的用途，包括在青霉素酰基转移酶，优选固定化的青霉素酰基转移酶存在下使所述(pgmh)2so4与6-氨基青霉烷酸(6-apa)，7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸酯(7-acca)或7-氨基脱乙酰氧头孢烷酸(7-adca)分别接触。该酶促反应可以根据本领域已知的任何方法进行，并且在上文中已经引用。例如，氨苄青霉素的合成可以如ep339751或wo98/56946中所述进行。同样，头孢氨苄的合成可以如wo96/23796中所述进行。头孢克洛的合成可以如wo2006/069984中所述进行。在酶促偶联后，可以使用已知方法回收半合成β-内酰胺抗生素。例如，可以使用向上搅拌通过底部筛子排出酶反应器。然后可以通过玻璃过滤器过滤所得的半合成β-内酰胺抗生素悬浮液。由于在酶促偶联反应之后存在低量的游离侧链，最终半合成β-内酰胺抗生素的结晶可以在高浓度的β-内酰胺抗生素下进行，这导致了高产率。在另一个实施方案中，本发明的第三方面提供了d-苯基甘氨酸甲酯的半硫酸盐在制备d-苯基甘氨酸甲酯游离碱中的用途。这样的用途可以根据wo2008/110527中概述的用于d-苯基甘氨酸甲酯的甲基硫酸盐的程序成功地实现。发现与如wo2008/110527中所述的d-苯基甘氨酸甲酯游离碱的制备相比，使用本发明的d-苯基甘氨酸甲酯的半硫酸盐产生了优异的结果，这是由于d-苯基甘氨酸甲酯游离碱的母液损失减少。附图说明图1是d-苯基甘氨酸甲酯的半硫酸盐的xrd光谱。x轴：2θ值(度)。y轴：强度(cps)。可以识别以下不同的峰：峰值号2-θ(度)挠曲宽度d值强度i/io16.1020.107144.7442416410027.8660.128112.3077393312.0810.10473.19914456414.4280.12261.34012515515.6230.13656.6777623616.6830.13453.0989724718.7720.15847.23413676819.4590.13145.5809674924.1380.13836.8412997121025.5770.16334.79112195实施例概述x-射线粉末衍射分析将样品加载到具有内刀(以使背景散射最小化)和空腔(直径2cm)的封闭的样品保持器上。装载在通风橱中进行而不研磨，以便使样品制备期间的粉尘形成最小化。在来自bruker的x射线粉末衍射仪d2phaser上分析样品。它使用具有1°开角的lynxeye检测器，0.1mm接收狭缝和镍过滤器。衍射角2θ在2°至60°的范围内，步长(2θ)约0.008°和计数时间4秒/步。在测量期间样品以15rpm旋转(为了良好的统计)并且数据近似地减去背景。hplc分析柱：hplc柱crownpakcr(-)(daicel)，长度150mm，直径4mm，颗粒直径5μm。洗脱剂：hclo4溶液，ph＝2.0。称量1.43ghclo4(70％，1.43g)用色谱用水稀释至1000ml，并检查溶液的ph。色谱条件：洗脱剂：hclo4，ph＝2·等度条件·流速：1.0ml.分钟-1·注射体积20μl·波长：220nm·柱温：室温，20-25℃·色谱图时间：30分钟·保留时间(大约)：l-苯基甘氨酸:2.7分钟d-苯基甘氨酸:8.7分钟l-苯基甘氨酸甲酯:9.3分钟d-苯基甘氨酸甲酯:21.0分钟制备d-苯基甘氨酸甲酯的水溶液(也参见wo2008/110527，us8,541,199的实施例8的类似程序，不同量也产生相同的产物，并用于实施例4)将d-苯基甘氨酸(pg；135g)悬浮于甲醇(252ml)中，并加入浓硫酸(98％，107g)。将混合物在约73℃下保持回流2小时，并使用真空泵在减压下浓缩。压力从大气压降至20毫巴，同时反应混合物的温度从40℃升至80℃。加入甲醇(126ml，100g)，将混合物在约81℃下保持回流1小时，并如前所述浓缩。将该过程重复另外四次(加入甲醇，回流并浓缩)。最后，加入甲醇(126ml)，将溶液再回流1小时，冷却至环境温度。氨(15ml)以恒定速率在35分钟内加料至ph2.3-2.4。加入水(75ml)，在低于50℃的温度下减压蒸馏除去甲醇。最终的d-苯基甘氨酸甲酯(pgm)溶液的ph为2.0，转化率为99.0％。实施例1制备(pgmh)2so4晶种将如概述部分中所述获得的d-苯基甘氨酸甲酯水溶液(1800g)在5-10℃下加入甲基叔丁基醚(900ml)和水(25ml)的混合物中，同时通过加入8mnaoh将ph保持在9.2。分离各相。水相用甲基叔丁基醚(600ml)萃取。将两个有机相合并并加入到水(5ml)中，同时通过加入48％(w/w)h2so4保持ph在4.2。分离各相。得到粘稠的油状水相(浑浊)。在真空(2毫巴)下在20℃下蒸发部分混合物，直到重量不再减少。得到粘稠油。在20°下储存时，在几天的过程中，在油中形成晶体。这些晶体中的一些用于接种剩余的水相(同时在3℃下储存)。观察到在3℃下非常缓慢的结晶。过滤晶体悬浮液。用hplc分析晶体。结果表明，该晶体被d-苯基甘氨酸污染。在滤液中，在室温下放置过夜后再次形成晶体。分离这些晶体，并在随后的实验中用作晶种。实施例2制备(pgmh)2so4将如概述部分中所述获得的d-苯基甘氨酸甲酯水溶液(1800g)在5-10℃下加入甲基叔丁基醚(900ml)和水(25ml)的混合物中，同时通过加入8mnaoh将ph保持在9.2。分离各相。水相用甲基叔丁基醚(600ml)萃取。合并两个有机相。通过hplc测定有机相含有350.4gd-苯基甘氨酸甲酯。将有机相加入到水(5ml)中，同时通过加入48％(w/w)h2so4保持ph在4.2。48％(w/w)h2so4的消耗量为201.7g。d-苯基甘氨酸甲酯(350.4g，2.1mol)和加入的h2so4(201.7*48＝96.8g，1.0mol)的摩尔比为2:1。分离各相。得到粘稠的油状水相(浑浊)。将如实施例1中所述获得的晶种加入到水相中。开始大量结晶，在小于1分钟的过程中，混合物是白色晶体的固体饼。将结晶的湿滤饼在20℃下真空干燥。d-苯基甘氨酸甲酯在晶体中的测定为73％(w/w)，d-苯基甘氨酸甲酯的半硫酸盐中d-苯基甘氨酸甲酯的理论测定为100*2*165.2/(2*165.2+98)＝77％。实施例3(pgmh)2so4在水中的溶解度与温度的函数关系在实施例2所述的(pgmh)2so4的制备中，在ph＝4.2下分离有机相，同时(pgmh)2so4过饱和。在某一时间点，结晶可在有机层与水相分离之前开始。为了设计在有机溶剂的存在下避免(pgmh)2so4的结晶并在分离有机相之后控制结晶的方法，研究了作为温度的函数的(pgmh)2so4的溶解度。将如实施例2中所述获得的d-苯基甘氨酸甲酯的半硫酸盐(1g)与水(2g)在20℃下混合，并将固体物质溶解。加入另外的d-苯基甘氨酸甲酯的半硫酸盐(1g)，并将混合物在20℃下搅拌25分钟。不是所有的固体都溶解。过滤约0.5ml上清液的等分试样，在滤液中通过hplc测定d-苯基甘氨酸甲酯的半硫酸盐的浓度。将剩余的混合物在3℃下搅拌。加入水(2ml)以允许混合。加入另外的d-苯基甘氨酸甲酯的半硫酸盐(0.5g)，并将混合物搅拌30分钟。不是所有的固体都溶解。过滤约0.5ml上清液的等分试样，在滤液中通过hplc测定d-苯基甘氨酸甲酯的半硫酸盐的浓度。hplc分析结果示于表1。表1：d-苯基甘氨酸甲酯的半硫酸盐在水中的溶解度作为温度的函数t(℃)d-苯基甘氨酸甲酯的半硫酸盐(g)/kg溶液204783268在将d-苯基甘氨酸甲酯在20℃、ph＝4.2下于有机溶剂加h2so4水溶液中混合后，在20℃下的溶解度应该允许相分离。随后冷却至3℃的水相将导致约478-268＝210g的d-苯基甘氨酸甲酯的半硫酸盐/kg混合物的结晶。在3℃下从晶体悬浮液中分离出d-苯基甘氨酸甲酯的半硫酸盐后，可以将母液重新用于在水/h2so4/母液中萃取有机溶剂中的d-苯基甘氨酸甲酯。实施例4使用(pgmh)2so4相对于溶液中的pgm制备头孢氨苄将7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸(7-adca，55.4g)悬浮于水(237ml)中，并将温度控制在20℃。将混合物搅拌5分钟，同时通过加入氨水溶液(25％)将ph保持在7.0。将固定化酶(包含如us8,541,199中所述的突变体1；18.7g)与水(25ml)一起加入。接下来，在200分钟内以恒定速率加入固体(pgmh)2so4(61.5g)。一旦加入所有(pgmh)2so4，同时通过加入氨水溶液(25％)或加入硫酸水溶液(30％)将ph维持在7.0。230分钟后，通过加入硫酸水溶液(30％)将ph调节至5.8。在反应过程中，取样并通过hplc分析，结果如表2所示。表2：使用固体(pgmh)2so4从7-adca形成头孢氨苄组分以重量％计转化率：100*头孢氨苄摩尔数/(头孢氨苄+7-adca的摩尔数)比率:(头孢氨苄+pgm+pg的摩尔数)/(头孢氨苄+7-adca的摩尔数)s/h:合成/水解比，或头孢氨苄摩尔数/pg摩尔数为了比较，使用pgm溶液(由us8,541,199的实施例8获得；100.7g；测定pgm：44％)代替固体(pgmh)2so4，重复上述头孢氨苄方案。此外，7-adca的初始悬浮液在187ml水中而不是237ml。在反应过程中，取样并通过hplc分析，结果如表3所示。表3：使用溶液中的pgm从7-adca形成头孢氨苄图例：如表2所示表2和表3的检查显示，就最大头孢氨苄形成、最大转化率和总s/h比而言，使用固体(pgmh)2so4比使用溶液中的pgm产生明显更好的结果。当前第1页12