高效小体积核酸合成的制作方法

本公开大体上涉及用于产生核酸分子的组合物和方法。在一些方面，本发明允许微量生成核酸分子，任选地接着将这些核酸分子组装成较大分子，如美国申请第13/627,819号中所公开，所述参考文献以引用的方式特此并入。在一些方面，本发明允许高效产生核酸分子(例如，大核酸分子，如基因组)。
背景技术：
：核酸分子的产生可相当简单或复杂，取决于如有待产生的核酸分子的类型等因素。举例来说，历史上，如引物等短的单链核酸分子已通常通过化学合成来生成(参见例如美国专利第5,837,858号，其公开内容以引用的方式并入本文中)。另外，较长核酸分子已通常通过聚合酶链反应(pcr)来生成。pcr的一个缺点是一般需要模板核酸。许多核酸合成方法具有有限的大核酸分子从头生成的能力。本发明的一个方面是为了解决这一限制。此外，用于基因合成的核酸分子通常是使用昂贵的自动化机器产生的，生产量有限。出于这个原因，正在研究替代性方法，如使用微阵列作为用于基因合成的核酸分子来源。微阵列可在小表面上具有数十万个不同的核酸分子并且可以极低的成本制造。然而，基于微阵列的核酸分子合成方法可遭受如每一点产生的核酸分子量少等缺陷。这对于杂交分析用途可能不存在问题，杂交分析是最初开发二维微阵列的应用。然而，当二维微阵列用于基因合成(即，在平面表面上制造核酸分子)时，其可能缺乏至少两个重要特征。第一，核酸分子的数量可能不是大到足以组装片段，如可用于基因组装的片段。在某些情况下，仅可获得数阿托摩尔(attomole)。出于这个原因，所生成的核酸分子通常需要通过pcr复制以达到可用于片段组装的数量。此外，核酸分子的数量可因在合成之后可用于降解核酸分子的合成试剂(如酸)而进一步减少。第二，难以从微阵列单独释放合成的核酸分子或释放于一个片段组装所需的池中。实际上，核酸分子通常被一起释放，常常产生具有数千个不同核酸分子的复杂池，在无后处理的情况下可能不适于基因合成。因此，为了利用这些池，常常需要像拨出pcr(dial-outpcr)或测序等复杂方法以鉴别和扩增所期望的核酸分子。技术实现要素：本发明部分涉及用于核酸分子合成的组合物和方法。本发明另外涉及用于获取合成的核酸分子的组合物和方法，以及用于组装核酸分子以形成如质粒、染色体和基因组等分子的组合物和方法。在一些方面，本发明涉及用于无模板引导的核酸分子合成的多孔板。在一些实施例中，所述板包含位于所述板的多个孔的每一个中的珠粒(例如，磁性珠粒)和存在于所述多个孔的一个或多个中的电化学生成酸(ega)。替代在一个或多个孔中具有ega或除了在一个或多个孔中具有ega之外，板孔可含有在别处陈述的与核酸分子的合成相关联的其它试剂。在本文所公开的某些实施例中，光生酸(pga)可替代ega或除了ega之外存在于多个孔的一个或多个中。ega或pga用于去除保护基(例如，dmt)，随后紧接着将酰胺添加到附接于固体支撑物的核酸分子。在一些实施例中，至少一种质子载体，如2-氯-6-甲基吡啶或二苯胺，可存在于具有ega或pga的溶液中。至少一种质子载体可通过接受来自ega或pga的质子，从而调节溶液的酸度来用于降低dna降解的作用。在一个方面，pga用于生成经组装的核酸的方法中，所述方法包含a)合成多个核酸分子，其中每个核酸分子是在板或微芯片的孔中制备，其中所述孔可操作地连接到用于产生pga的光源并且任选地含有质子载体，如2-氯-6-甲基吡啶或二苯胺；b)组合(a)中生成的一些或全部核酸分子以产生池；c)接合(b)中所形成的池中所存在的一些或全部核酸分子以形成多个较大核酸分子；d)从(c)中所形成的多个较大核酸分子排除含有序列错误的核酸分子以产生经纠错的核酸分子池；和e)组装所述经纠错的核酸分子池中的核酸分子以形成所述经组装的核酸分子。用于本发明实践中的珠粒大小可大幅变化，但是包括直径在0.01μm与100μm之间、在0.005μm与100μm之间、在0.005μm与10μm之间、在0.01μm与100μm之间、在0.01μm与1,000μm之间、在1.0μm与2.0μm之间、在1.0μm与100μm之间、在2.0μm与100μm之间、在3.0μm与100μm之间、在0.5μm与50μm之间、在0.5μm与20μm之间、在1.0μm与10μm之间、在1.0μm与20μm之间、在1.0μm与30μm之间、在10μm与40μm之间、在10μm与60μm之间、在10μm与80μm之间或在0.5μm与10μm之间的珠粒。在某些实施例中，珠粒的直径可在30μm与40μm之间，如31μm或32μm或33μm或34μm或35μm的直径。所属领域的技术人员应认识到，当固体粒子降至低于特定大小时，它们开始获得流体属性(例如，形成胶态悬浮体的等效物)。因此，在一些情况下(例如，在使用直径小于约100nm的珠粒的情况下)，可能需要以流体形式处理珠粒。这可能意味着例如通过搅动、洗涤或通过使用表面活性剂从表面、孔或磁尖去除珠粒。在本发明的特定实施例中，可依据孔的大小选择珠粒大小以使得仅一个单一珠粒占据孔。在其它实施例中，不止一个珠粒(或其它形状的核酸合成衬底)可在一些或全部孔中。在一些情况下，每孔的珠粒数可为一个、两个至二十个、两个至三十个、两个至十个、四个至二十个、四个至十个、四个至五十个等。在某些实施例中，用于合成核酸的多孔板的每个孔被配置成容纳直径为约35-40μm、或约35μm或约29至33μm的单分散珠粒。在某些实施例中，单分散珠粒是由合成聚合物(如聚苯乙烯)构成。孔数也可大幅变化并且受以下因素限制，如有待产生的核酸量、时间限制、经济因素、技术因素(如可制造性)和与用途相关的机械因素(例如，(磁性)珠粒提取器的大小下限)。因此，依据各种因素而定，所期望的合成规模可变化并且可调节孔数以适应所期望的合成规模。在任何情况下，孔数可为例如10至10,000,000、10至5,000,000、10至2,000,000、10至1,000,000、10至800,000、10至650,000、10至500,000、500至500,000、500至200,000、10至50,000、1,000至500,000、10,000至500,000、20,000至500,000、1,000至50,000、10至50,000、10至25,000、10至10,000、10至5,000、10至2,500、100至50,000、100至25,000、100至10,000、100至5,000、100至2,500、350至50,000、350至25,000、350至10,000、350至5,000、350至2,500、1000至50,000、1000至25,000、1000至10,000、1000至5,000、1000至2,500、1,500至50,000、1,500至25,000、1,500至10,000、1,500至5,000、1500至2,500、20,000至50,000、20,000至40,000或约35,000的数目。在某些实施例中，孔数可为例如35,440个。在某些其它示例性实施例中，孔数可为例如约196,000个，如196,160个，或例如约9,000个，如9020个。另外，已制备孔编号在1千万范围内的多孔表面。因此，在一些情况下，孔数可小于5百万、1千万、2千万等。每个孔的总体积是可变化的另一项目并且可为例如1.0×10-9μl至50μl、1.0×10-9μl至10μl、1.0×10-9μl至1.0μl、1.0×10-9μl至0.1μl、1.0×10-9μl至1.0×10-2μl、1.0×10-9μl至1.0×10-3μl、1.0×10-9μl至1.0×10-4μl、1.0×10-9μl至50μl、1.0×10-5μl至1.0×10-6μl、1.0×10-9μl至1.0×10-7μl、2.5×10-9μl至1.0×10-2μl、2.5×10-9μl至1.0×10-3μl、2.5×10-9μl至1.0×10-4μl、2.5×10-9μl至1.0×10-5μl、2.5×10-9μl至1.0×10-6μl、1.0×10-8μl至1.0×10-6μl、1.0×10-8μl至1.0×10-5μl、1.0×10-7μl至1.0×10-5μl、1.0×10-7μl至1.0×10-4μl、1.0×10-7μl至1.0×10-3μl、1.0×10-7μl至1.0×10-2μl、0.1μl至50μl、0.01μl至50μl、0.01μl至25μl、0.01μl至15μl、0.01μl至10μl、0.001μl至50μl、0.001μl至5μl、0.001μl至1μl、0.001μl至0.01μl、0.001μl至1μl、1μl至50μl、1μl至25μl、1μl至10μl、10μl至50μl、10μl至25μl或15μl至25μl。在某些示例性实施例中，每个孔的总体积可为1×10-6μl至1×10-4μl、1×10-5μl至1×10-4μl，如约6.3×10-5μl。在许多情况下，本发明的多孔板或适合与本发明一起使用的多孔板将被可操作地连接到一个电极或一组(例如一对或数对)电极。如在本文别处所论述，这些电极可用于生成与一个或多个化学反应的催化相关联的微环境(例如，用于核苷酸脱保护的ega或用于从固体支撑物裂解核酸分子的egb)。另外，这些电极，当排列在个别孔的底部或底部附近时，可用于生成孔的珠粒移出机制，例如电解，如下文所进一步论述。在某些情况下，本文所公开的多孔板可被可操作地连接到至少一个光源，如光纤装置。如本文所公开，至少一个光源可用于在多孔板的一个或多个孔中选择性生成光生酸(pga)。pga进而用于在多孔板的一个或多个孔中选择性脱除附接到珠粒或其它合适固体支撑物的末端核苷酸的保护基。在一些实施例中，本发明的多孔板或适合与本发明一起使用的多孔板将连接到微流体通道用于引入和去除试剂。这使得可高效和自动化控制试剂。在一些实施例中，本发明提供获取由碱可裂解的连接基团连接到固体支撑物的核酸的方法，其包含：a)生成电化学生成碱；b)在水溶液或有机溶液中用电化学生成碱从固体支撑物裂解核酸；c)使所裂解的核酸与保留核酸的材料接触；和d)用从核酸去除保护基的试剂洗脱核酸，任选地其中所述洗脱可以小体积进行以浓缩和/或富集核酸。举例来说，洗脱可以约1至约10μl(如约5μl)的体积进行。或者，步骤d)可包含在不去除保护基的情况下洗脱溶剂中的核酸并且可后跟着包含从核酸去除保护基的额外步骤e)。本发明另外提供用于从无引导的核酸分子合成多孔板获取核酸分子的方法，所述方法包含：a)合成多个核酸分子的第一拷贝，其中每个核酸分子是以约50飞摩尔至约15,000飞摩尔的平均量制备于第一多孔板的孔中；b)合成同样多个核酸分子的第二拷贝，其中每个核酸分子是以约50飞摩尔至约15,000飞摩尔的平均量制备于第二多孔板的孔中；c)使第一多孔板的多个核酸分子的第一拷贝脱保护并且裂解；d)使第二多孔板的多个核酸分子的第二拷贝脱保护；e)使多个核酸分子的第一拷贝与多个核酸分子的第二拷贝在杂交条件下接触以生成杂交的核酸分子；f)通过添加变性溶液至第二多孔板使杂交的核酸分子变性；和g)从第二多孔板获取变性的核酸分子。在一些实施例中，本发明提供裂解由可光裂解连接基团连接到固体支撑物的核酸的方法，其包含由光源生成光波并且用光波从固体支撑物裂解核酸。在其它示例性实施例中，本发明提供裂解由还原性可裂解连接基团连接到固体支撑物的核酸的方法，其包含生成电化学还原的化合物并且用电化学还原的化合物从固体支撑物裂解核酸。在核酸已从固体支撑物裂解之后，其可通过本文所公开的方法获取。另外如本文所公开，在某些实施例中，可在裂解之前首先获取核酸连同固体支撑物。本发明还提供用于生成由较小的化学合成核酸分子形成的经组装的核酸分子的方法。在一些实施例中，这类方法可包含以下步骤中的一个或多个：(a)合成多个核酸分子，其中每个核酸分子是以微量制备于板孔中；(b)组合(a)中生成的核酸分子或其一部分以产生池；(c)接合(b)中所形成的池中所存在的一些或全部核酸分子以形成多个较大核酸分子；(d)从(c)中形成的多个较大核酸分子排除含有序列错误的核酸分子以产生经纠错的核酸分子池；和(e)组装所述经纠错的核酸分子池中的核酸分子以形成所述经组装的核酸分子。在一些实施例中，池中所存在的核酸分子的接合将通过聚合酶链反应(pcr)介导。在一些实施例中，步骤(b)可另外包含使(a)中生成的核酸分子与通过其它方式获得的核酸分子组合以形成池，其中所述其它方法包括pcr、限制酶消化、核酸外切酶处理或使用核苷酸转移酶的模板非依赖性合成。在一些情况下，(c)和/或(e)中生成的经组装的核酸分子可组装并且引入到载体(例如，克隆载体、目的载体等)中。通过本发明方法组装的核酸分子数可变化并且适当时，将与汇集的核酸分子数相关。在任何情况下，在本发明方法中组装的核酸分子可由至少五个其它(例如，较小)核酸分子构成(例如，约五个至约五千个、约五个至约两万个、约五个至约十万个、约五十个至约五千个、约五十个至约两万个、约五十个至约十万个、约一百个至约五千个、约一百个至约十万个、约五百个至约五千个、约五百个至约十万个等核酸分子)。通过本发明方法组装的核酸分子可变化极大并且包括具有至少20千碱基(例如，约0.5千碱基至约10兆碱基、约0.5千碱基至约5兆碱基、约0.5千碱基至约1兆碱基、约0.5千碱基至约500千碱基、约0.5千碱基至约100千碱基、约0.5千碱基至约10兆碱基、约0.5千碱基至约1千碱基、约1千碱基至约10兆碱基、约10千碱基至约5兆碱基、约1千碱基至约5兆碱基、约1千碱基至约2兆碱基、约1千碱基至约1兆碱基、约1千碱基至约500千碱基、约10千碱基至约1兆碱基、约10千碱基至约500千碱基、约10千碱基至约100千碱基等)的分子。通过本发明方法组装的核酸分子可为例如单链、部分单链或双链、封闭、环状的(例如，质粒)；带切口、环状的；或线性的(例如，质粒、染色体等)。另外，可进行本发明的方法以使得两个或更多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、十个、二十个等)经组装的核酸分子在同一反应混合物中同时形成。本发明另外提供用于产生产物核酸分子的方法。在一些情况下，这类方法包含：(a)设计10千碱基至500千碱基(例如，500碱基至500千碱基、500碱基至100千碱基、500碱基至1千碱基、500碱基至800碱基、2千碱基至100千碱基、2千碱基至50千碱基、2千碱基至5千碱基、10千碱基至500千碱基、10千碱基至300千碱基、10千碱基至200千碱基、10千碱基至100千碱基、10千碱基至50千碱基等)大小的产物核酸分子，其中所述产物核酸分子是由核苷酸序列定义的；(b)合成核苷酸序列不同的多个个别核酸分子，其中每个个别核酸分子合成以制备1,000至1.0×109个拷贝的量并且其中所述个别核酸分子能够与其它个别核酸分子中的一个或多个杂交；(c)在允许个别核酸分子杂交的条件下，在允许形成至少一个较大核酸分子的条件下，组合(b)中合成的个别核酸分子；和(d)使(c)中形成的至少一个较大核酸分子与一个或多个额外核酸分子组合以形成产物核酸分子，其中所述产物核酸分子每一千碱基含有小于一个序列错误。在许多情况下，在产物核酸分子生成期间采用纠错方法。以上工作流程中可进行纠错方法的一个位置是在步骤(b)之后。纠错方法描述在本文别处并且将通常包括一种或多种错配修复核酸内切酶的使用。作为产物核酸分子制备的一部分所合成的个别核酸分子的数目可变化极大，但是包括1,000至1.0×1013个拷贝、1,000之1.0×1012个拷贝、1,000至1.0×1011个拷贝、1,000至1.0×1010个拷贝、1,000至1.0×109个拷贝、2.0×109之1.0×1013个拷贝、5.0×109至1.0×1013个拷贝、7.0×109至1.0×1013个拷贝、2.0×109至8.0×1012个拷贝、2.0×109至5.0×1012个拷贝、5.0×106至1.0×1011个拷贝、1.0×107至1.0×1011个拷贝、1.0×109至1.0×1011个拷贝等。在许多情况下，聚合酶链反应可用于扩增上文产物核酸分子制备方法中的步骤(c)中所形成的至少一种较大核酸分子。用于核酸分子合成的板格式描述在本文别处并且其可用于上文产物核酸分子制备方法中。另外，当个别核酸分子在珠粒上合成时，其中每个珠粒可被包含在孔中。另外，在本发明的这一方面以及本发明的其它方面中所用的珠粒的大小可为例如1μm至100μm直径、5μm至50μm直径、3μm至100μm直径、5μm至100μm直径、20μm至100μm直径、5μm至60μm直径、10μm至100μm直径等。在一些实施例中，珠粒的大小可为约30μm直径(例如，在28与32μm之间)。在一些实施例中，珠粒可介于约30μm至约40μm直径范围内，如约35μm直径。本发明还包括用于以少量和高序列保真度产生核酸分子的方法。在一些方面，本发明包括一种用于生成核酸分子的方法，所述方法包含以1×1011至1×1013个分子的总量合成所述核酸分子，其中序列错误数在1/100至1/2,500之间(例如，约1/200至约1/2,500、约1/500至约1/2,500、约1/1,000至约1/2,500、约1/1,500至约1/2,500、约1/1,000至约1/2,000等)。如在本文别处所论述，纠错可用于降低序列错误数。本发明因此包括用于生成核酸分子集合的方法，包括包含以下的方法：(a)合成多个核酸分子，其中每个核酸分子是以微量制备；(b)组合(a)中生成的核酸分子以产生池；(c)接合(b)中所形成的池中所存在的一些或全部核酸分子以形成多个较大核酸分子；和(d)组装所述多个较大核酸分子以形成核酸分子集合，其中所述核酸分子集合来自生物信息学信息，其选自由以下组成的群组：(1)含有仅与信使rna(mrna)分子对应的dna的拷贝dna(cdna)文库；(2)含有与获得生物信息学信息的细胞类型中所发现的mrna分子的不完全互补序列对应的dna分子的部分cdna文库；和(3)一些或全部核酸分子是获得生物信息学信息的细胞类型中所发现的核酸分子的密码子改变的变异体的核酸分子集合。本发明还提供用于生成由较小化学合成核酸分子形成的自我复制核酸分子的方法。在一些实施例中，这类方法可包含以下步骤中的一个或多个：(a)合成多个核酸分子，其中每个核酸分子是以微量制备；(b)组合(a)中生成的核酸分子以产生池；(c)接合(b)中所形成的池中所存在的一些或全部核酸分子以形成多个较大核酸分子；和(d)组装所述多个较大核酸分子以形成所述自我复制核酸分子。本发明还包括用于合成和组装核酸分子的方法，所述核酸分子编码超过一个表达产物，所述方法包含：(a)合成多个核酸分子，其中每个核酸分子是以微量制备；(b)组合(a)中生成的核酸分子以产生池(c)接合(a)中所形成的池中所存在的一些或全部核酸分子以形成多个较大核酸分子；和(d)组装所述多个较大核酸分子以形成编码超过一个表达产物的核酸分子。在本发明的各种方面，超过一个表达产物可为参与相同生物学路径的蛋白质。在更多特定方面，超过一个表达产物可为参与相同生物学路径的蛋白质，其为催化生物学路径中的一系列化学反应的酶。另外，相同生物学路径中的这类化学反应可为顺序反应，在这个意义上，一个化学反应直接跟随另一个(直接依序)或在一个或多个中间反应已发生之后。所属领域的技术人员应理解，本发明的许多方面非常适合自动化。自动化系统通常由软件驱动，可执行重复任务，尤其当与设计用于组件的显微操纵和试剂流动的硬件整合时。因此，根据本文所描述的各种实施例，组装和合成核酸的方法可在计算系统上实施。另外，根据本文所描述的各种实施例，公开了用于组装和合成核酸的处理器可执行指令。因此，在一些方面，本发明包括经通过处理器可执行的指令编码的用于生成经组装的核酸分子的非瞬时性计算机可读存储介质，所述指令包含用于以下的指令：(a)合成多个核酸分子，其中每个核酸分子是以微量制备于板或微芯片的孔中；(b)组合(a)中生成的核酸分子以产生池；(c)接合(b)中所形成的池中所存在的一些或全部核酸分子以形成多个较大核酸分子；(d)从(c)中形成的多个较大核酸分子排除含有序列错误的核酸分子以产生经纠错的核酸分子池；和(e)组装所述经纠错的核酸分子池中的核酸分子以形成所述经组装的核酸分子。本发明还包括用于生成经组装的核酸分子的系统，所述系统包含：处理器；和经处理器可执行指令编码的存储器，所述指令用于：(a)合成多个核酸分子，其中每个核酸分子是以微量制备于板或微芯片的孔中；(b)组合(a)中生成的核酸分子以产生池；(c)接合(b)中所形成的池中所存在的一些或全部核酸分子以形成多个较大核酸分子；(d)从(c)中形成的多个较大核酸分子排除含有序列错误的核酸分子以产生经纠错的核酸分子池；和(e)组装所述经纠错的核酸分子池中的核酸分子以形成所述经组装的核酸分子。在其它方面，公开了用于从合成核酸分子的微芯片的经流体填充的孔移出珠粒的方法，其中一个或多个核酸分子附接到所述珠粒。这些方法可包含在排列于经流体填充的孔的底部的第一电极与第二电极之间提供电压，其中所述电压足以致使经流体填充的孔中的流体进行电解，在流体中产生一个或多个气泡以连同珠粒一起上升到经流体填充的孔的顶部或将珠粒提升到经流体填充的孔的顶部。在其它实施例中，珠粒可使用其它技术从合成微芯片移出，包括(但不限于)显微操纵(如微量移液)、光力(如光镊)；气泡生成；声力、重力进料技术、磁性技术(例如，磁性珠粒)、介电泳、阀调或在微芯片上使用堰结构。第一电极可由铂构成并且在某些实施例中，电压为约0.1v至约10,000v、约1v至约1000v、约2v至约100v或约5v至约15v。第二电极可排列在第一电极上方。在某些实施例中，可使用第三(参比)电极，如下文所进一步论述。寡核苷酸合成微芯片可包含封盖，其可经操作以在微芯片的顶表面上形成并且可经操作以提供进出孔的流体流动路径。在一些实例中，第二电极可在封盖中形成。在某些实施例中，用于核酸合成的微芯片的每个孔的深度可为约45至60μm，包括约50μm、约55μm或约60μm。所属领域的技术人员应理解，孔大小可取决于微芯片的尺寸和/或密度(即，孔数)，如在本文别处所述。在一些实例中，微芯片的每个孔可由控制器个别寻址。在一些实例中，微芯片是互补金属氧化物半导体(“cmos”)芯片。珠粒可由以下构成：合成聚合物、经改性的天然存在的聚合物、玻璃、受控微孔玻璃、磁性受控微孔玻璃、磁性珠粒、陶瓷或一种或多种金属。在某些实施例中，珠粒是由合成聚合物(如聚苯乙烯)构成。在某些实施例中，在珠粒上合成的至少50％寡核苷酸的长度在2-200或50-100个碱基对之间。在某些实施例中，珠粒如本文所述是单分散的，具有例如比每个孔的直径小约5％至约20％、约8％至15％、约10至约30％或约12.5％的珠粒直径。在某些实施例中，单分散珠粒的直径变化小于10％。在某些实施例中，单分散珠粒的直径在30-40μm之间。在某些实施例中，单分散珠粒的直径为约35μm或约32μm，每个孔的直径为约40μl或约42μm或约40至约45μm，并且每个孔的深度为约50μm或约55μm或约45μm至约55μm。在某些情况下，本发明的方面中所用珠粒的直径将取决于孔的大小，而孔的大小可由微芯片的尺寸和/或密度定义。举例来说，给定大小的微芯片可具有较大数目的较小孔或较小数目的较大孔。因此，具有较高孔密度与较小孔的微芯片将需要珠粒的大小比具有较低密度与较大孔的微芯片更小，如例如图35的表中所示。在某些实施例中，单分散珠粒具有0.1至2.5ml/g聚合物的孔容。在某些实施例中，单分散珠粒具有100-500m2/g或350-400m2/g(例如，380m2/g)的表面积。在某些实施例中，单分散珠粒涂布有反应性基团，如氨基。在某些实施例中，涂层中胺基的量介于0.1％至5％(重量％氮每克珠粒)范围内。在某些实施例中，单分散珠粒的寡核苷酸合成衬底的连接基团负载能力在10至500μmol/g、30至100μmol/g或40至80μmol/g范围内。在某些实施例中，单分散珠粒携载通用连接基团，如unylinkertm。在从微芯片置换珠粒之后，所述方法可另外包含使用微流体或珠粒收集装置收集和浓缩已从微芯片置换的珠粒。珠粒收集装置可将所收集的珠粒转移到合适的容器，如第一多孔收集板的孔。在一些实例中，珠粒收集装置可与流体流动路径流体连通并且包含使得珠粒可沿第一方向移动的第一通道和使得流体可沿不同于第一方向的第二方向，例如沿相反方向或正交方向移动的第二通道。珠粒收集装置可包含可由控制器控制的声学模块以促进第一通道中的珠粒、第二通道中的流体或这两者的移动。在某些实施例中，第一多孔收集板可包含多个孔结构和在所述多个孔结构的顶表面上或所述多个孔结构内形成的流体渗透结构。流体渗透结构可为半透流体但不透珠粒的材料并且可包括(但不限于)目筛、滤纸、多孔材料或膜(例如，离子轨迹蚀刻膜)。举例来说，半透流体的材料可为具有小到足以保留在本文别处所描述的大小的珠粒的洞或微孔的薄箔(如聚丙烯箔)。这类洞或微孔可例如通过激光微铣削(例如，牛津激光(oxfordlaser)可在100μm聚丙烯箔中钻出10μm洞)或通过所属领域中已知的其它方法生成。在某些实施例中，第一多孔收集板可包含多个孔结构并且另外包含第二多孔收集板，其中所述第二多孔收集板包含多个孔结构和在所述多个孔结构的底表面上形成的流体渗透结构，其中所述第二多孔收集板置于所述第一多孔收集板的顶部上以使得所述第二多孔收集板的多个孔结构与所述第一多孔收集板的多个孔结构对准。在某些实施例中，珠粒收集装置可包含针结构，其可经操作以1)通过穿刺流体渗透结构而将来自核酸分子合成微芯片的珠粒放置于第一多孔收集板的孔中，和/或2)从放置珠粒的孔去除流体。针结构可包含第一管腔，其可经操作以通过穿刺流体渗透结构而将来自核酸分子合成微芯片的珠粒放置于多孔收集板的孔中；和第二管腔，其可经操作以从放置珠粒的孔去除流体。在其它实施例中，并非使用针穿刺流体渗透结构，而是将压力施加于多孔收集板中所选孔的顶部，所述压力足以破裂流体渗透结构并且使一个或多个珠粒沉积到多孔收集板的所选孔中。在其它实施例中，珠粒收集装置包含针结构，其可经操作以将来自核酸分子合成微芯片的珠粒放置于第一多孔收集板的孔中，和/或2)将流体递送到放置珠粒的第一多孔收集板的孔中。针结构可包含第一管腔，其可经操作以将来自核酸分子合成微芯片的珠粒放置于多孔收集板的孔中；和第二管腔，其可经操作以将流体递送到放置珠粒的孔中。在其它实施例中，在微芯片上合成的寡核苷酸可在排列于多孔收集板的顶表面上或多孔收集板内的流体渗透结构上汇集、浓缩、裂解并且脱保护。裂解的寡核苷酸可随后洗脱到多孔收集板的孔中而不必穿刺或以其它方式破裂流体渗透结构。从微芯片收集珠粒的方法可包含以一个或多个自由度移动珠粒收集装置以将珠粒递送到第一多孔收集板的多个孔中。微芯片可经编程以从微芯片所关注的特定孔提取珠粒并且经由珠粒收集装置将珠粒递送到第一多孔收集板的多个孔的可寻址的孔中。当珠粒从合成芯片冲洗出时，其随着用于将珠粒从微芯片输送出的额外流体而分散到较大体积中。珠粒收集装置能够汇集组装较大核酸片段所需的含有相同寡核苷酸的珠粒和/或含有其它寡核苷酸的珠粒并将其从第一较大体积浓缩成第二较小体积且汇入合适收集容器(如多孔收集板)中。因此，汇集和浓缩珠粒的方法，如本文所公开，包含将第一体积流体中的一个或多个珠粒从微芯片上所形成的多个孔结构转移到第一多孔收集板的孔中的第二体积流体中，其中已在所述微芯片上合成的核酸附接到所述一个或多个珠粒，其中所述一个或多个珠粒使用珠粒收集装置(例如，微流体装置或包含针结构的装置)转移，其中所述珠粒收集装置与所述微芯片和所述第一多孔收集板流体连接，其中所述第一多孔收集板包含多个孔，且其中所述第一多孔收集板的孔中的所述第二体积流体少于所述第一体积流体，从而浓缩在所述微芯片上合成的核酸分子。在某些情况下，浓缩包含使第一体积流体减少约5至约50倍、约10至约100倍、约10至约1,000倍、约100至约10,000倍。在某些实施例中，第一多孔收集板的每个孔的总体积可为1至约200μl、50至约200μl、1至50μl、1至25μl、3至12μl或约10μl。根据本发明，公开了用于核酸分子合成的系统。这些系统可包含一个或多个在上面形成有多个孔结构的微芯片，所述多个孔结构的每个孔大小设定成容纳用于核酸分子合成的珠粒，其中每个孔中已形成在孔底部可由控制器单独控制的第一电极；和排列在微芯片顶部上并且其中形成有提供珠粒流体路径的流体通道的封盖构件，其中所述封盖构件包含第二电极，其中所述控制器可经操作以在所述第一电极与所述第二电极之间提供电压，所述电压足以致使孔中的流体进行电解，在流体中产生一个或多个气泡以连同珠粒一起上升到孔顶部。这些系统可另外包含珠粒收集装置，其可经操作以收集和浓缩从合成芯片移出的珠粒。这些系统可另外包含第一多孔收集板，其可经操作以接收使用珠粒收集装置收集的一个或多个珠粒。珠粒收集装置可与珠粒流体路径流体连通并且包含使得珠粒可沿第一方向移动到第一多孔收集装置的第一通道和使得流体可沿不同于第一方向的第二方向，例如沿相反方向、正交或任何合适方向移动的第二通道。珠粒收集装置可包含可由控制器控制的声学模块以促进第一通道中的珠粒、第二通道中的流体或这两者的移动。在这些系统中，第一电极可由铂构成并且在某些实施例中，电压为约0.1v至约10,000v、约1v至约1000v、约2v至约100v或约5至约15伏。第二电极可排列在第一电极上方。在某些实施例中，可使用第三(参比)电极，如下文所进一步论述。可通过控制器使得珠粒收集装置以一个或多个自由度移动，从而将珠粒收集装置中所收集的珠粒递送到第一多孔收集板的多个孔中。微芯片或其它计算机系统可经编程以从微芯片上所关注的特定孔提取珠粒并且经由珠粒收集装置将珠粒递送到第一多孔收集板的多个孔的可寻址的孔中。根据本发明，公开了经通过处理器可执行的指令编码的用于从合成核酸分子的微芯片的经流体填充的孔移出一个或多个珠粒的非瞬时性计算机可读存储介质，其中核酸分子附接到所述珠粒。还公开了用于从合成核酸分子的微芯片的经流体填充的孔移出一个或多个珠粒的包含处理器和经处理器可执行指令编码的存储器的系统，其中核酸分子附接到所述珠粒。用于计算机可读存储介质或系统的指令可包含用于在排列于经流体填充的孔的底部的第一电极与第二电极之间提供电压的指令，其中所述电压足以致使经流体填充的孔中的流体进行电解，在流体中产生一个或多个气泡以连同珠粒一起上升到经流体填充的孔的顶部。根据本发明，公开了用于从具有多个经流体填充的孔的用于合成核酸分子的微芯片选择性移出一个或多个珠粒的方法，其中所述多个孔中的每一个包含在孔底部形成的电极并且所述一个或多个珠粒中的每个珠粒占据所述微芯片上的单个孔。这些方法可包含：鉴别含有有待移出的一个或多个珠粒的一个或多个孔；在已鉴别的一个或多个孔中的第一电极与第二电极之间提供电压，其中所述电压足以致使所述一个或多个孔中的流体进行电解，产生一个或多个气泡以连同所述一个或多个孔内含有的一个或多个珠粒一起上升到所述一个或多个孔的顶部；用珠粒收集装置收集已上升到经流体填充的孔的顶部的一个或多个珠粒；以及将所收集的一个或多个珠粒转移到第一多孔收集板或其它合适收集容器的一个或多个孔中，其中珠粒可被浓缩并且在组装成较长核酸片段之前进一步处理(例如，裂解和脱保护)。附图说明图1是本发明的工作流程方面的一般描述。所述工作流程分成四个部分，为易于描述称为“模块”。图右侧的工作流程示出了本发明方法的一些方面中所包括的一些特定步骤。图2a和2b是根据本发明的实施例的一行孔的示意图。孔1中较暗的区域指示存在在给定时间不存在于其它孔中的试剂(例如，ega)。图3示出了核酸组装流程。在图底部示出的经组装的核酸分子上的粗端表示添加了外部引物(也称为末端引物)的区。图4示出了第二核酸组装流程。具有箭头的点线示出了基于pcr的合成方向和区域。图5示出了使用拼接核酸分子将不共有任何同源性的两个dna片段组装到载体中。在图下部以粗体示出的69个碱基对双链拼接核酸分子与每个相邻片段(片段1和2)共有30-bp同源性。使用这些拼接核酸分子在相邻片段的结合处插入9bp。插入碱基加下划线示出。图6是用于合成错误最少的核酸分子的示例性方法的流程图。图7是用于合成错误最少的核酸分子的示例性方法的工作流程图。双链核酸分子的不同链是由较粗线和较细线表示。“mme”是指错配核酸内切酶。小环表示序列错误。图8大体上说明用于在酵母中组装和克隆核酸区段的方法。在本发明的一些实施例中，多个核酸区段(其中之一为载体)被共转化到酵母宿主细胞中，在酵母宿主细胞中其通过同源重组而组装形成例如封闭的环状核酸分子。图9是可用于本发明实践中的电线圈的绘图。图10是适合与本发明一起使用的流体试剂递送系统的一个实施例的截面视图。图11示出了通过本发明方法生成的线性核酸分子文库(顶部)和经设计以接纳文库成员的载体(底部)。图的上部部分示出了一系列线表示文库的四个成员。下部开环线表示载体。在核酸分子每个末端的方块表示有助于接合的核酸区段(例如，位点、同源区等)。核酸分子的号码和端部指示相容的末端。图12a和12b示出了可通过本发明方法制备的一系列变异体核酸分子和其编码的氨基酸序列。图12a示出了编码不同氨基酸序列的变异体核酸分子。图12b示出了使用不同密码子但编码相同氨基酸序列的变异体核酸分子。图13示出了合成平台的微孔板实施例的两种不同流体去除选择方案。图14a和14b示出了经设计以在每一行1401中生成相同核酸分子的核酸分子合成平台的两种不同视图。图14a是俯视图并且图14b是侧视图。图中所示的是流体通道1401、与每个通道/每一行孔相关联的两个电极1402以及含有位于孔中的核酸合成衬底(例如，个别珠粒)的一系列孔1400。在一些实施例中，孔将隔开300μm并且将是直径40μm和深度35μm的圆柱形。图15是说明计算系统的框图，本发明教示的实施例可在所述系统上实施。图16是用于进行本发明方法的自动化系统的示意图。图17是通道“芯片”的俯视示意图。图18示出了根据本发明的方法使用电解从合成芯片选择性珠粒移出方法的简化实例。图19示出了根据本发明方法的包括微流体或珠粒收集装置和多孔收集板的实例珠粒收集方法。图20更详细地示出了图19的微流体或珠粒收集装置。图21示出了根据本发明的另一个实例多孔收集板。图21还示出了一种珠粒收集方法，其涉及使用针结构穿刺流体渗透结构(例如，微目筛)以将来自合成芯片的一个或多个珠粒放置到多孔收集板的孔中或从多孔收集板的一个或多个孔去除流体。图22示出了如下实例方法：从合成芯片移出珠粒，在包含由流体渗透结构分隔开的两个分层的多孔收集板中浓缩珠粒，使用例如氨气气氛使多孔收集板中的核酸裂解和脱保护，以及使用根据本发明的系统将经裂解和脱保护的核酸洗脱到多孔收集板的底部孔中。图23a和23b示出了根据本发明的寡核苷酸合成微芯片的另一个实例。图24a、24b、24c和24d示出了根据本发明的微芯片的流体封盖的实例侧视图和俯视图。图25说明珠粒结合的核酸分子与电化学生成碱的实例裂解反应。图26说明一种示例性微流体芯片，其用于将核酸分子变性溶液和任选地缓冲液投与到经合成的核酸分子的微阵列。图27示出了核酸合成(模块1)和汇集、裂解以及脱保护步骤(模块2)的实例工作流程图。图28a、28b和28c示出了合成准备的实例工作流程图。图29a和29b示出了合成计划的实例工作流程图。图30示出了微芯片合成的实例工作流程图。图31示出了将固体支撑珠粒连接到寡核苷酸的示例性邻硝基苯甲基可光裂解连接基团。图32示出了一种示例性电化学反应，其中2，2′-二硫烷二基双(乙-1-醇)还原成一硫化物，导致寡核苷酸与二硫化物还原性可裂解连接基团的裂解。图33a、33b和33c示出了实例时间序列影像，描绘根据本发明使用电生成气体从多孔合成芯片选择性移出珠粒。图34示出了根据本发明合成的40聚体测试寡核苷酸的色谱图。图35示出了孔数和各种物理参数的变化。图36示出了寡核苷酸组装和双重纠错的工作流程示意图。在工作流程中标注九个行号以便在说明书中提及。图37示出了错误类型表和在纠错之前以及在使用t7核酸内切酶i的两轮纠错之后在化学合成的寡核苷酸中所发现的比率。这些数据如实例9中所陈述而生成。图38示出了在使用t7核酸内切酶i的两轮纠错之后在化学合成的寡核苷酸中所发现的剩余错误(按类型)。这些数据如实例9中所陈述而生成。图39示出了采用珠粒结合错配修复结合蛋白使含有错配的核酸分子与不含错配的那些分离的工作流程示意图。nmm是指未错配的核酸分子并且mm是指错配的核酸分子。图40a和40b示出了多孔胺官能化粒子经连接基团分子的改性。图41a和41b示出了用于lacz基因组装的寡核苷酸。图41a是在微流体芯片上同时测序的十种不同寡核苷酸的rphplc色谱图。图41b示出了用于lacz基因组装的寡核苷酸的次序和排列。图42示出了用于寡核苷酸组装的替代性工作流程示意图，其包含核酸外切酶i处理。在第一变化形式中，使用一种类型的核酸内切酶进行双重纠错(左侧的工作流程)。在第二变化形式中，在第一轮使用一种或多种核酸内切酶并且在第二轮使用错配结合蛋白进行双重纠错(右侧的工作流程)。在工作流程中标注九个行号以便在说明书中提及。图43a、43b和43c示出了电极的金属层可如何连接到微流体芯片cmos部分的顶部金属的示例性实施例。图44(画面a、b、c和d)示出了如实例6中所述使用电解从微流体合成芯片选择性移出珠粒。图45a、45b和45c示出了用于珠粒收集装置的同轴针组装件和包含流体渗透微目筛的过滤板。图46示出了用于寡核苷酸合成仪器的替代性流体学配置的代表性实施例。图47(画面a、b、c、d、e和f)示出了使用固体支撑质子清除剂防止质子污染相邻反应位点的原理。图48a和48b示出了经碱涂布的清除剂珠粒可如何在酸性条件下用于保护反应侧附近的合成位置的实例。将32-μm多孔合成支撑物装载到每个孔中。图48a的实验是在不存在清除剂珠粒的情况下进行，而图48b的实验是在存在填充到每个孔中的较小清除剂珠粒的情况下进行。图49示出了用于微处理生物样品的改进型无缝工作流程，其包含液体操作和热循环的替代性步骤。具体实施方式定义：微芯片、芯片、合成芯片、合成微芯片、阵列、微阵列：如本文所用，术语微芯片、芯片、合成芯片、合成微芯片、阵列、微阵列或其类似变化形式将指代上面可进行寡核苷酸合成的电子计算机芯片。多孔板、微板、微孔板、板：如本文所用，术语多孔板、微板、微孔板、板或其类似变化形式将指代位于基本上平坦表面上的多个孔的二维阵列。多孔板可包含任何数目的任何宽度或深度的孔。在某些情况下，多孔板可被配置成微芯片。举例来说，当具有孔状结构的材料覆盖在微芯片上时。固体支撑物：如本文所用，术语固体支撑物是指可在上面合成和/或固定如核酸分子等聚合物的多孔或无孔材料。如本文所用，“多孔”意味着材料含有可能具有非均一或均一直径(例如在nm范围内)的微孔。多孔材料包括纸、合成滤膜等。在这类多孔材料中，可在微孔内进行反应。固体支撑物可具有以下多种形状中的任一个：如销、带、板、盘、杆、纤维、弯管、圆柱形结构、平坦表面、凹面或凸面或毛细管或柱。固体支撑物可为粒子，包括珠粒、微米粒子、纳米粒子等等。固体支撑物可为类似大小的非珠粒型粒子(例如，丝状体)。支撑物可具有可变的宽度和大小。举例来说，可用于本发明实践的珠粒(例如，磁性珠粒)的大小描述在本文别处。支撑物可为亲水性的或能够呈现亲水性并且包括无机粉末，如二氧化硅、硫酸镁和氧化铝；天然聚合材料，特别是纤维素材料和来源于纤维素的材料，如含有纤维的纸，如滤纸、色谱纸等。支撑物可固定在载体的可寻址位置。支撑物可为松散的(如孔中的树脂材料或珠粒)或可以可逆地固定或连接到载体(例如通过可裂解的化学键或磁力等)。在一些实施例中，固体支撑物可为可碎裂的。固体支撑物可为合成或经改性的天然存在的聚合物，如硝化纤维素、碳、乙酸纤维素、聚氯乙烯、聚丙烯酰胺、交联葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚(对苯二甲酸乙二酯)、尼龙(nylon)、聚(丁酸乙烯酯)、聚偏二氟乙烯(pvdf)膜、玻璃、受控微孔玻璃、磁性受控微孔玻璃、磁性或非磁性珠粒、陶瓷、金属等等；单独或与其它材料结合使用。在一些实施例中，支撑物可呈芯片、阵列、微阵列或微孔板格式。在许多情况下，通过本发明方法生成的支撑物将是在单独或离散的区域上合成个别核酸分子以在支撑物上生成特征(即，含有个别核酸分子的位置)的支撑物。在一些实施例中，选择所定义特征的大小以使得在特征上可形成微量液滴或反应体积，每个液滴或反应体积保持彼此分隔。如本文所述，特征通常(但不必)通过特征间的间隔分隔开以确保液滴或反应体积或在两个相邻特征之间不合并。特征间将通常不在其表面上携载任何核酸分子并且将相当于惰性空间。在一些实施例中，特征和特征间可在其亲水性或疏水性特性方面有差异。在一些实施例中，特征和特征间可包含改性剂。在本发明的一个实施例中，特征是孔或微孔或槽口。核酸分子可共价或非共价附接到表面或沉积或合成或组装在表面上。在本发明的一个实施例中，模块1可涉及使用超过一个固体支撑物。在一些实施例中，可在板上排列两个或更多个固体支撑物。可采用固体支撑物的任何排列，如行或列或其组合。举例来说，可行对准和/或可列对准。在其它实施例中，行和/或列是等间隔并且交错的。行间和/或列间的间距可为变量。例如板中所包含的固体支撑物的数目可为变量。在一些实施例中，板可含有多达1,536(或更多)个固体支撑物。核酸分子：如本文所用，术语“核酸分子”是指共价连接的核苷酸或碱基序列(例如，用于rna的核糖核苷酸和用于dna的脱氧核糖核苷酸，并且还包括dna/rna杂交，其中dna处于单独的链中或处于相同链中)，其中一个核苷酸的戊糖的3′位置是通过磷酸二酯键接合到下一个核苷酸的戊糖的5′位置。核酸分子可为单链或双链或部分双链的。核酸分子可在超螺旋或松弛形成时以具有钝端或粘性末端的线性或环化形式出现并且可含有“切口”。核酸分子可由完全互补的单链构成或由部分互补的单链构成以形成至少一个碱基错配。核酸分子可另外包含两个自身互补序列，其可形成双链茎区，任选地在一端由环序列分隔开。包含双链茎区的核酸分子的两个区基本上彼此互补，从而产生自身杂交。然而，茎可包括一个或多个错配、插入或缺失。核酸分子可包含经化学、酶促或代谢修饰形式的核酸分子或其组合。化学合成的核酸分子可指代通常小于或等于150个核苷酸长(例如，5至150、10至100、15至50个核苷酸长)的核酸，而酶促合成的核酸分子可涵盖较小以及较大的核酸分子，如本申请别处所述。核酸分子的酶促合成可包括使用酶(如聚合酶、连接酶、核酸外切酶、核酸内切酶等或其组合)的逐步方法。因此，本发明在某种程度上提供与化学合成的核酸分子的酶促组装相关的组合物和组合方法。核酸分子还指代短核酸分子，其通常称为例如引物或探针。引物通常称为用于酶促组装反应的单链起始核酸分子，而探针可通常用于检测至少部分互补的核酸分子。核酸分子具有“5′端”和“3′端”，因为核酸分子磷酸二酯键存在于取代基单核苷酸的戊糖环的5′碳与3′碳之间。新键将连接到5′碳的核酸分子的末端是其5′端核苷酸。新键将连接到3′碳的核酸分子的末端是其3′端核苷酸。如本文所用，末端核苷酸或碱基是处于3′端或5′端的末端位置的核苷酸。核酸分子序列即使处于较大核酸分子内部(例如，核酸分子内的序列区)也可称为具有5′端和3′端。转换：如本文所用，术语“转换”当关于核酸分子的核苷酸序列使用时，是指嘌呤核苷酸变成另一嘌呤(ag)或嘧啶核苷酸变成另一嘧啶(ct)的点突变。颠换：如本文所用，术语“颠换”当关于核酸分子的核苷酸序列使用时，是指涉及(二环)嘌呤取代(一环)嘧啶或(一环)嘧啶取代(二环)嘌呤的点突变。插入缺失：如本文所用，术语“插入缺失”是指核酸分子中一个或多个碱基的插入或缺失。综述：本发明部分涉及用于制备核酸分子的组合物和方法。虽然本发明具有与其相关联的许多方面和变化形式，但是这些方面和变化形式中的一些以大纲形式陈述在图1中。本发明的一个优势是对于许多应用，少量合成的核酸适合于达成预期目的(例如，制备微阵列、构建含有可选标记的质粒等)。在一些情况下，由于如酶促(例如，pcr)和细胞内扩增等因素，少量核酸适合于操作。图1左侧示出了四个通用“模块”表示本发明的一些实施例的不同部分。因此，在一些方面，本发明涉及以下中的一个或多个：(1)核酸分子合成，(2)核酸分子的汇集，(3)多个核酸分子的组装和/或(4)经组装的核酸的转移(例如，转移到细胞)。关于本发明的更多特定实施例，图1右侧示出了与图左侧上显示的模块相关的一些额外细节。在多个文本框上方的是加粗术语，如“酶促”和“细胞”。这些术语指示可进行所提及方法的示例性通用方式。如所属领域的技术人员应理解，一些方法可例如以化学、酶促方式或在细胞中进行。模块1，如图1中所示，是指称为“微量平行核酸分子合成”的单个方法。如本文别处所陈述，此方法将通常涉及数个步骤，所述步骤将随着如何进行所述方法而变化。在许多实施例中，模块1的通用功能将是生成多个核酸分子。这些核酸分子可被设计为有待接合以形成一个或多个较大核酸分子的基团或当与额外核酸分子(例如，“拼接”核酸分子)接触时接合以形成一个或多个较大核酸分子的基团。模块2，如图1中所示，是指称为“固体支撑物的汇集”、“核酸分子裂解”和“脱保护”的方法。模块2的通用功能将是制备核酸分子以参与模块3中所提及的一个或多个方法。这将通常意味着组合序列不同的核酸分子并且去除对于模块3中所提及的一个或多个方法的进行来说不是必需或不是所期望的任何化学基团。使用模块2作为一个实例，如所属领域的技术人员应认识到，图1示出了本发明的通用实施例。更确切地说，模块2是指固体支撑物的汇集。这些支撑物将通常含有核酸分子。在一些实施例中，可获得不含固体支撑物形式的核酸分子，随后汇集。模块3，如图1中所示，是指称为“片段扩增和组装”、“纠错”和“最终组装”的方法。模块3方法的通用功能是生成经组装的核酸分子，其与试图产生的核酸分子的序列相比具有高序列保真度。模块4，如图1中所示，是指称为“受体细胞插入”的方法。如所属领域的技术人员应理解，将通过本发明方法生成的核酸分子引入到细胞中仅是一个应用。在大多数情况下，将针对特定应用设计根据本发明方法组装的核酸分子。应用变化广泛并且包括生物燃料生产、生物修复和化学前体生产。在一些实施例中，通过如美国专利第6,335,438号(其公开内容以引用的方式并入本文中)中所述的方法获得的单分散粒子可用于本发明的实践中。举例来说，在本文所公开的某些实施例中并且如美国专利第6,335,438号中所公开，可使用包含聚乙烯主链并且具有任选地经酰化的氨基的支撑基质。支撑基质可通过使至少一种单乙烯基单体与至少一种二、三或聚乙烯单体聚合获得。至少一种单体是乙烯基芳香族单体，并且聚合反应可在存在至少一种氨基乙烯基芳香族单体(如氨基苯乙烯)的情况下进行。举例来说，在本文所公开的某些实施例中，固体支撑物可为由至少一种单乙烯基单体和至少一种二、三或聚乙烯单体在存在氨基乙烯基芳香族单体的情况下聚合制成的氨基苯乙烯珠粒。在替代实施例中，可使用氨基乙烯基脂肪族单体代替乙烯基芳香族单体以调节或调整珠粒的反应性和/或胺含量，如本文别处所公开。举例来说，可使用乙烯基苯甲基氯代替氨基苯乙烯。在本文所公开的某些其它实施例中，固体支撑物珠粒可通过lewandowski，k.等人，“大孔、单分散、官能化苯乙烯-二乙烯基苯共聚物珠粒的制备：单体性质和总致孔剂体积对于多孔特性的作用(preparationofmacroporous，monodisperse，functionalizedstyrene-divinylbenzenecopolymerbeads：effectofthenatureofthemonomersandtotalporogenvolumeontheporousproperties)”，《应用聚合物科学杂志(j.app.polymerscience)》，67：597-607(1998)中所列举的方法制备，其以引用的方式并入本文中。举例来说，在某些实施例中，可使用已由苯乙烯和经取代的苯乙烯单体(如4-甲基苯乙烯、4-氨基苯乙烯、3-氨基苯乙烯、4-乙酰氧基苯乙烯和4-叔丁氧基羰基氧基苯乙烯)的混合物与二乙烯基苯聚合制备的单分散珠粒。单分散珠粒可在存在各种致孔剂的情况下制备。模块1在本发明中，核酸分子可附接到固体支撑物，如粒子或珠粒(例如，受控微孔玻璃珠粒或聚苯乙烯珠粒)。在一个实施例中，使用磁性或非磁性微珠作为固体支撑物。在许多情况下，具有大表面比体积比率的多孔微米大小的微珠可用于本发明中。这类单分散粒子的均一性质一般提供特别适合于在自动化化学合成仪(例如，核酸分子合成仪)中合成的均一反应速率。可获得具有适用于不同应用的各种化学活化基团的这些珠粒。在一些方面，本发明涉及一种用于无模板引导的核酸分子合成(例如，化学合成)的多孔板。在一优选实施例中，多孔板包含多个孔，其中每个孔被配置成容纳一个或多个单分散珠粒。在一些情况下，多孔板的每个孔可被配置成容纳一个单分散珠粒。根据本发明的孔可由其深度定义。孔的最小深度应至少略微超过珠粒的直径以确保珠粒可用试剂/ega覆盖(例如，均匀覆盖)。孔的深度可为例如珠粒直径的110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或小于200％。然而，孔的最大深度将通常被配置成使得仅所定义数目的珠粒(例如，仅单个珠粒)可置于孔中。举例来说，孔的深度将通常不超过珠粒直径的约150％以确保第二珠粒无法置于已被第一珠粒所占据的孔中。在某些情况下，珠粒可具有紧密配合在孔中的大小或直径。举例来说，直径为约35至40μm的珠粒可置于内径为40μm并且深度为55μm的孔中。这将使得珠粒以狭窄公差配合到孔中。如本文别处所解释，由于可用于本发明实践中的珠粒的结构不均一性的某些方面，所以相当紧密的珠粒/孔公差属于本发明的范围内。举例来说，依据与孔直径相比的珠粒直径，珠粒可比孔小20％或更小(例如，约1％至约10％、约2％至约10％、约4％至约10％、约5％至约10％、约2％至约8％、约5％至约10％、约4％至约8％、约1％至约15％、约5％至约15％、约8％至约15％、约5％至约20％、约10％至约20％、约15％至约20％等)。出于说明的目的，如果直径为约35μm的珠粒置于直径为约40μm的孔中，那么珠粒比孔小12.5％。在孔被配置成容纳单个珠粒的情况下，珠粒直径可为孔内径的约80-90％，以确保珠粒表面将与试剂和/或ega均匀接触和/或被试剂和/或ega覆盖，并且整个珠粒表面积将同等高效地用于核酸分子合成。通过使用直径小于100％内孔直径的珠粒，还可确保孔中产生的热量可自由离开孔/可从孔排出。举例来说，珠粒表面与孔内壁之间的距离可为珠粒直径的约2至10％，如珠粒直径的约5％。在许多情况下，珠粒应是球形并且孔应具有圆形或圆柱形形状。然而，其它形式和形状也是可能的。在某些情况下，孔可例如具有矩形、方形、八边形或丝状形状。举例来说，在珠粒大小设定成基本上精确配合到方形孔中的情况下，热量可从孔的“角落”排出。孔大小和形状优选地经选择以允许在切换试剂时的高效流体交换。在本发明的一优选方面，珠粒是单分散/单一大小的多孔珠粒。在一些实施例中，珠粒可为磁性珠粒或非磁性珠粒。如上所述，在所定义大小的孔中使用单分散珠粒有助于确保所有珠粒(1)在孔中被试剂/ega同等并且均匀地接触和(2)提供相等负载能力以及(3)每孔等量的反应性合成位置，因此有助于准备用于平行反应的相同起始条件。术语单分散在本文中用于表征具有低不均一性和均匀大小分布的粒子或珠粒群体。珠粒的大小分布可由百分比cv(变化系数)定义。多个珠粒的cv可例如在50至100％范围内。本发明的方面中所用的单分散珠粒的特征在于低cv，其可在1至10％、1至20％、1至30％、1至30％、3至20％、5至15％、2至10％、10至25％、小于10％、优选地小于5％或小于3％的范围内。举例来说，单分散珠粒群体可具有大于90％、优选地大于95％的大小在其平均直径±5％内的珠粒。可根据如例如专利公开第wo2000/061647号中所述的方法获得用于本发明实施例的单分散珠粒。在许多寡核苷酸合成系统的情况下，一旦核酸分子达到某些长度，合成效率就降低。另外，合成效率降低的长度可随着合成参数而变化。合成效率被认为降低的一个原因是由于位阻效应。具体来说，寡核苷酸是占用空间的三维化合物。因此，一旦寡核苷酸链周围的局部空间变得有限，位阻效应就干扰新的碱基添加到分子。本发明包括用于提供合成参数以减轻寡核苷酸相关的长度合成效率降低的组合物和方法。可调节多个参数以减轻寡核苷酸相关的长度合成效率降低。另外，不同参数可相对于彼此进行调节。如上所述的孔大小与珠粒大小的关系可与珠粒特定参数(珠粒表面积、孔容、胺含量、连接基团负载能力等)组合加以调节。为了增加正确合成的较长寡核苷酸的产率，具有(1)较大孔容比表面比率和(2)较低连接基团负载量的珠粒可为有利的。这些参数呈现如下情况：其中依据所产生的“正确”寡核苷酸的百分比，具有所期望序列的较长寡核苷酸的产率增加部分是因为每单位面积珠粒合成较少寡核苷酸。具体来说，减轻位阻效应通常需要为正在合成的寡核苷酸提供足够的空间以防止其在合成方法期间彼此“相撞”。这需要珠粒上的负载能力低于技术上可行的。最终结果是每单位面积珠粒表面产生与技术上可能的相比较少的寡核苷酸。视所期望的长度、品质和产率而定，调节这些参数可用于获得最优结果，如下文进一步描述。因此，在一些方面，本发明包括采用具有低于技术上可行的连接基团负载能力的珠粒的组合物和方法。与连接基团负载能力和寡核苷酸合成效率相关的数据陈述在本文别处。如本文所用，术语“长寡核苷酸”是指具有大部分标准商业上使用并且可获得的寡核苷酸合成平台开始展现合成错误率增加的长度的寡核苷酸。在许多情况下，这些错误由展现“缺失”碱基的寡核苷酸分子的百分比增加所造成。换句话说，碱基未添加到正在合成的寡核苷酸分子中的比率显著升高。举例来说，在一些情况下，每个碱基的添加(也称为“偶合”)为约99％有效的。在这类情况下，当欲合成具有特定长度n的寡核苷酸时，基于无效偶合事件的累积，仅0.99n-1的寡核苷酸将是正确的。另外，如副反应或反应性化合物的浓度或比率等其它因素可造成较低效率的偶合，从而随着寡核苷酸长度增加而叠加到总体错误率。出于说明的目的，假定对于每个正在合成的寡核苷酸来说，寡核苷酸是在每个碱基添加存在1.5％碱基添加失败的错误率的情况下合成的。另外，这个“添加失败”错误率从碱基2至碱基35保持恒定，随后升高到碱基36的2％、碱基37的3％和碱基38的5％以及碱基39的8％。在此情况下，长度超过35个碱基的寡核苷酸将被认为是“长寡核苷酸”。在大多数情况下，长寡核苷酸是长度超过35个、超过40个、超过45个、超过50个、超过55个、超过60个、超过80个、超过100个、超过120个、超过150个、至多约200个等碱基的寡核苷酸。出于各种原因可存在如缺失、插入或突变等错误。在一些情况下，错误可由无效或不完全的解封闭事件(例如，不完全去除5′-dmt保护基)所造成。如果解封闭并未定量地达成，那么所添加的碱基无法偶合到珠粒上所合成的全部寡核苷酸。然而，在给定合成循环中尚未去除的一个或多个寡核苷酸的保护基可在后续合成循环中去除，随后偶合另外的碱基。在此情况下，一个或多个寡核苷酸可携载一个或多个缺失。虽然在合成期间的某些条件可产生具有缺失的寡核苷酸，但是其它条件可导致一个或多个错误碱基的掺入，从而产生插入或突变。在后一种情况下，寡核苷酸可具有预期长度，但是具有不正确的全序列。可通过多种方式测定特定寡核苷酸(例如，预期具有相同序列的寡核苷酸群体)的错误率。可基于包含所期望长度(例如，经hplc纯化)的寡核苷酸子集测定错误率，并且可不考虑以副产物形式生成的任何较小片段或截短的寡核苷酸。测定具有特定长度的寡核苷酸的错误率(插入、缺失和突变总量)的一种方式是通过直接测序。测定寡核苷酸的错误率或“质量”的另一种方式可基于将一个或多个集合的寡核苷酸组装成具有正确序列的较大核酸分子的效率。不论通过直接或间接方式测定，具有相当低质量的寡核苷酸群体可展现2至3％的错误率，如2.5％，其将表示40个碱基中约一个错误。具有较高质量的寡核苷酸可展现小于1％、小于0.5％、小于0.25％或小于0.1％(1000个碱基中1个错误)的错误率。因此，本发明的一个方面是提供合成具有高品质(即，具有低错误率)的长寡核苷酸的方式和方法。如上文所指出，可截短在支撑物上合成的一部分寡核苷酸(即，长度小于所期望的长度)。可例如生成如下截短的寡核苷酸，其中5′-dmt保护基已去除但尚未发生碱基偶合，从而产生未反应的5′-羟基，其可在后续合成步骤中进行额外偶合。为了避免在每个连续循环累积缺失，使用“封端步骤”封闭任何未反应的5′-羟基。然而，这将产生较短寡核苷酸，因为无另外的碱基可在后续反应中添加到封端的寡核苷酸。这类截短随着正在合成的寡核苷酸的长度增加而累积。因此，期望生成大部分或高产率的具有所期望的全长的寡核苷酸。产率可定义为每孔/珠粒生成的具有所期望的长度的寡核苷酸百分比或每孔/珠粒生成的全长寡核苷酸的量。举例来说，具有300飞摩尔连接基团负载能力的35μm珠粒可携载30至50％全长寡核苷酸，从而产生90至150飞摩尔的量的具有所期望的长度的寡核苷酸。本发明的一个方面因此是提供以高产率(如孔中/珠粒上合成的寡核苷酸总量的30％至50％、40％至60％、50％至70％或大于50％)合成长寡核苷酸的方式和方法。或者，孔中/珠粒上合成的全长寡核苷酸的量可为90至150飞摩尔、100至200飞摩尔、150至300飞摩尔、大于300飞摩尔等。可能需要在合成和/或组装期间的各个点定量核酸分子(例如，寡核苷酸)的量。在一些情况下，可在支撑物(例如，珠粒)的表面上检测寡核苷酸。这一检测可为相对非定量或定量的。举例来说，当需要检测珠粒(例如，孔中所存在的珠粒)上的合成失败时，可关注非定量检测。在这类情况下，将通常对存在最少量核酸的珠粒进行计分。举例来说，当需要估计所存在的核酸分子数时，可关注定量检测。大部分定量方法不提供所测量的核酸的“精确”定量。由于如核苷酸序列等变量，所以常常发生变异。定量意思指测得值在所存在的核酸的实际量的85％内。在许多情况下，将期望能够以“非破坏性”方式检测和/或定量核酸分子。这意味着检测/定量方法和/或试剂不会损伤所鉴别的dna分子并且不会干扰经检测/定量的核酸分子的“下游”使用。荧光团是可用于检测/定量方法中的一种类型的分子。在许多情况下，荧光团以及其它可检测标记可非共价结合到核酸分子。可用于本发明实践中的荧光团以及其它可检测标记可相比rna优先结合到dna、相比dna优先结合到rna、和/或相比双链(ds)核酸优先结合到单链(ss)核酸。因此，可用于本发明实践中的荧光团可相比dsrna优先结合到ssdna。可用于本发明实践中的荧光团以及其它可检测标记的一个所期望的特征是其在与用于核酸合成的固体支撑物(例如，珠粒)和/或化学基团(例如，连接基团)缔合时不展现实质性标记活性。换句话说，标记将通常经选择以使得用于核酸合成的固体支撑物在核酸合成之前生成极小信号或无信号。可用于检测和/或定量核酸分子的荧光团的一个实例是quant-itssdna试剂(赛默飞世尔科技公司(thermofisherscientificinc.))。这一试剂非共价结合到核酸分子并且可用于定量，其中给定核酸分子的数量和/或长度可随荧光强度的变化而测定。另外，这一荧光团优先结合到单链dna并且当结合到核酸时展现增加的荧光。另外，quant-itssdna试剂是非破坏性的并且因此，经检测和/或定量的核酸分子可用于后续方法(例如，纠错反应、核酸组装反应等)中。可用于本发明实践中的额外荧光团包括包含花青染料、菲啶染料、双苯甲亚胺染料、二苯并咪唑染料、吖啶染料或色霉素染料的荧光团。在一些情况下，荧光团是quant-itsybrsybrsybrsybrdna凝胶染色剂或cyquant染料，其全部可从赛默飞世尔科技购得。可使用的其它荧光团包括(biotium，inc.)、dapi(4′，6-二甲脒基-2-苯基吲哚)、溴化乙锭、碘化丙锭、二氢乙锭、碘化己锭、ssdna染料(promegacorp.)或dsdna染料(promegacorp.)。本发明因此包括如下方法，其包含生成包含所结合(例如，共价结合)的核酸分子的珠粒和检测和/或定量所结合的核酸分子。相关方法包括用于测定已在多孔板的一个或多个孔中发生的核酸合成是否失败的那些方法。合成失败可出于多种原因而存在。一个这类原因是当使用基于ega的脱保护时，电流未在必需的时间供应到一个或多个孔。本发明因此包括用于评定如图24d中所示类型的电子合成芯片的官能度的方法。本发明因此还包括如下方法，其中将芯片用于核酸合成并且在添加多个合成循环用于碱基添加(例如，约6至约15个循环)之后，芯片的孔中的珠粒与染料(例如，荧光团)接触以测定每个孔中是否已发生核酸合成。另外，可鉴别尚未发生合成的孔(如果存在的话)。可鉴别未发生合成的孔的数目和其在芯片中的位置。操作员(或具有预设参数的计算机)可随后选择采取行动，如仅在功能性孔中引导合成或由于非功能性孔的数目而丢弃芯片。本发明还提供用于测定与固体支撑物缔合的核酸分子的长度的方法。这是基于以下原理：可选择可检测标记(例如，quant-it)以使得其以可检测标记活性与所检测的核酸分子的长度成比例的方式标记核酸分子。在本发明的一个优选实施例中，使用单分散珠粒，它们是多孔珠粒并且以比孔容表征，其中例如每1克聚合物1ml孔容等于50％孔隙率。举例来说，具有2.2ml/g聚合物孔容的珠粒具有70％的孔隙率。珠粒孔隙率取决于所用聚合物并且可为实现具有特定长度的核酸分子的合成的重要因素。在某些情况下，适合于本发明的方面的珠粒的孔容可在0.1至2.5ml/g聚合物范围内。密度为1.1g/ml的交联聚苯乙烯的示例性百分比孔隙率在下表1中指出。然而，还可基于体积定义孔隙率。可用于本发明的某些方面的珠粒孔隙率可在约50％至约70％、约60％至约80％、约65％至约75％的范围内，例如约70％。单分散珠粒可另外包含如本文别处所定义的连接基团并且可以其连接基团负载能力表征。适合于本发明的方面的珠粒的连接基团负载能力可在10至500μmol/g、50至350μmol/g、70至200μmol/g、30至100μmol/g、10至40μmol/g、20至50μmol/g、50至70μmol/g或40至80μmol/g范围内，例如约60μmol/g。如本文别处所述可在珠粒上定量合成的核酸分子的长度可取决于连接基团负载能力。支撑物的连接基团负载量越高，所合成的寡核苷酸的总产率将越高。历史上，已寻求较高连接基团负载能力，从而增加每单位面积支撑物可产生的寡核苷酸数。然而，对于长寡核苷酸，极高产率可能不是所期望的，因为其可能损害寡核苷酸的质量，如上文所论述。因此，鉴于欲合成的寡核苷酸的长度调适珠粒的连接基团负载能力是通过本发明的方法和化合物生成具有足够产率和所期望长度的高质量寡核苷酸所解决的一个方面。可被优化以实现特定长度核酸分子的合成的连接基团负载能力在表2中指出。单分散珠粒可进一步由其表面积定义。举例来说，珠粒的表面积可在10至1000m2/g、100至500m2/g、200至400m2/g范围内，例如约380m2/g。多孔单分散珠粒的表面积可例如根据由brunauer、emmett和teller研发出的称为bet方法的方法来测定，所述方法是基于蒸汽或气体在固体表面上的物理吸附(brunauer，s.，emmett，p.andteller，《美国化学学会杂志(j.amer.chem.soc.)》60(1938)，第309页)。此方法使用干燥珠粒进行如此测试，为了精确测量，微孔在暴露于溶剂时与在干燥时相比应具有稳定容积。在某些实施例中，可测定在60℃下从四氢呋喃或甲醇干燥2小时的珠粒的表面积。单分散珠粒可另外用反应性基团官能化或涂布，所述反应性基团可影响连接基团负载能力。经官能化以用于寡核苷酸合成的珠粒可例如携载氨基并且可由其胺含量定义。固体支撑物的胺含量可由每克珠粒的重量％氮表示并且可在0.01至5％、0.1％至3％、0.15％至0.5％、2％至5％、0.5％至1.5％、1.5％至2％范围内。用于元素分析测定重量％氮和计算固体支撑物胺含量(摩尔胺/克支撑物)的方法是所属领域中已知的并且可例如根据由dumasa.(1826)：《化学年鉴(annalesdechimie)》，33，342所描述或如由美国环境保护署(usenviromentalprotectionagency)在方法440.0：《使用元素分析测定河口/海岸水的沉积物和微粒中的碳和氮(determinationofcarbonandnitrogeninsedimentsandparticulatesofestuarine/coastalwatersusingelementalanalysis)》中所进一步阐述的方法计算出。在某些情况下，胺含量可为约1.8％、约1.5％、约1.2％、约1.0％、约0.8％、约0.5％、约0.25％、约3％、约3.5％、约4％或约5％。举例来说，在使用氨基苯乙烯作为单体的情况下，可在理论上测定胺含量，如下表3中所指出。表3：含有氨基苯乙烯的珠粒的胺含量的示例性分析.重量％氮/gmol胺/g珠粒重量％氨基苯乙烯/g珠粒0.017.14e-060.0850.053.57e-050.4260.17.14e-050.8510.20.000141.7020.50.000364.2560.750.000546.3841.00.000718.5111.50.0010712.7671.80.0012915.3212.00.0014317.0232.50.0017921.2793.00.0021425.5343.50.0025029.7904.00.0028734.0465.00.0035742.557所属领域的技术人员应理解，固体支撑物的胺含量取决于用于聚合的含胺化合物或单体。固体支撑物的胺含量可因此通过使用不同量的含胺单体来调整。举例来说，较低量的氨基苯乙烯，如每克聚合混合物中所用的单体总量小于10重量％或小于5重量％，可用于生成具有较低胺含量的珠粒。在本发明的某些方面，可能需要降低胺含量以将连接基团负载能力限制于实现特定长度寡核苷酸合成的最优量。因此，本发明还涉及具有低胺含量的单分散珠粒，所述胺含量为0.15％至0.5％、0.5％至1.5％、1.5％至2％、或小于3％、小于2％、小于1.5％、小于1％、小于0.5％或小于0.25％的胺含量。或者，可基于不同含胺单体或含有可官能化基团的单体的选择来修改胺含量。举例来说，如乙烯基苯甲基氯等单体可用于适合于本发明的方面的珠粒的聚合。因此，在本发明的一个实施例中，单一大小的珠粒的胺含量是通过聚合中所用乙烯基苯甲基氯的量来测定。为了实现长寡核苷酸的高效合成，如上文所述的孔大小与珠粒大小的关系以及珠粒特定参数(珠粒表面积、孔容、胺含量、连接基团负载能力)可为重要的参数。因此，本发明还涉及用于无模板引导的核酸分子合成的多孔板，其中所述多孔板包含多个孔，其中每个孔被配置成容纳单分散珠粒，其中珠粒的直径变化小于10％并且其中所述珠粒的特征还在于寡核苷酸合成衬底的连接基团负载能力在30至100μmol/g范围内。本发明包括包含用于寡核苷酸合成的支撑物的组合物，所述组合物包含具有适用于以低错误率合成长寡核苷酸的负载能力的固体支撑物。本发明因此包括用于以低错误率合成长寡核苷酸的方法，所述方法包含合成所述长寡核苷酸，其中所述长寡核苷酸是在具有经调节以允许以低错误率产生长寡核苷酸的连接基团负载能力的衬底上合成。本发明另外包含其中所合成的长寡核苷酸长度超过35个核苷酸的组合物和方法。本发明另外包含其中所合成的长寡核苷酸长度为35个核苷酸至60个核苷酸的组合物和方法。本发明另外包含如下组合物和方法，其中所合成的长寡核苷酸的长度为50个核苷酸至100个核苷酸并且合成前35个核苷酸的平均错误率在核苷酸36至40的合成错误率的一个标准差内。本发明另外包含其中长寡核苷酸以小于0.5％的错误率合成的组合物和方法。本发明另外包含其中长寡核苷酸以碱基3至50中的每一个小于0.5％的错误率合成的组合物和方法。本发明另外包含如下组合物和方法，其中在孔中/珠粒上合成的特定长度(例如大于35个、大于40个、大于45个、大于50个、大于55个、大于60个、大于80个、大于100个、大于120个、大于150个、至多约200个碱基的长度)的寡核苷酸的量是在珠粒上合成的寡核苷酸总量的30％至50％、40％至60％、50％至70％或大于50％。本发明另外包括用于在直径为25至40μm(如约35μm)的单分散珠粒上合成寡核苷酸的组合物和方法，其中在所述珠粒上合成的特定长度的寡核苷酸的量选自由以下组成的群组：1飞摩尔至1皮摩尔，10飞摩尔至500飞摩尔，以及50飞摩尔至250飞摩尔。在一些方面，本发明涉及使用所选低连接基团负载能力(例如，35-50μmol/g)的支撑物(如单分散珠粒)，从而产生与技术上可行的相比较少量的寡核苷酸。其优势在于使用低连接基团负载能力允许以低错误率产生较长寡核苷酸(即较高百分比的正确全长寡核苷酸)，尤其在合成方法后期合成的寡核苷酸的末端区。本发明包括用于在支撑物上合成寡核苷酸的组合物和方法，其中所述支撑物的连接基团负载能力在选自由以下组成的群组的范围内：70μmol/g至100μmol/g，50μmol/g至70μmol/g，35μmol/g至50μmol/g，以及15μmol/g至35μmol/g。本发明包括用于在支撑物(例如，单分散珠粒)上合成寡核苷酸的组合物和方法，其中所述支撑物的连接基团负载能力经调节以使得可以小于0.5％的错误率和/或在所述支撑物上合成的寡核苷酸总量的30％至50％、40％至60％、50％至70％或大于50％的产率产生50至200个核苷酸长的寡核苷酸。本发明另外包括其中寡核苷酸为35至80个核苷酸长的组合物和方法。本发明另外包括其中寡核苷酸为50至80个核苷酸长的组合物和方法。本发明另外包括其中寡核苷酸为50至100个核苷酸长的组合物和方法。本发明另外包括其中寡核苷酸为50至200个核苷酸长的组合物和方法。本发明另外包括用于长度在35与200个碱基之间的寡核苷酸的固相合成的单分散多孔珠粒，其中所述珠粒是用如胺基或羟基等反应性基团涂布的聚苯乙烯珠粒，并且其中所述珠粒包含：10至100μm或20至40μm的直径，其中变异系数小于10％或小于5％，在100至500m2/g范围内或在150至300m2/g范围内的表面积，在60％至80％范围内的孔隙率，任选地，约2％至约8％或约3％至约5％、或小于3％的胺含量，约15μmol/g至约100μmol/g或约35μmol/g至约70μmol/g的连接基团负载能力，任选地，其中所述珠粒携载连接基团，并且其中所述连接基团是通用连接基团。如上文所论述的具有低胺含量的珠粒将包含较低表面反应性并且将用有限量的连接基团分子占据。然而，负载有连接基团的珠粒可仍在其表面上包含反应性胺基，其可干扰寡核苷酸合成。为了去除这类反应性基团，可在寡核苷酸合成之前对携载连接基团的珠粒进行封端方法。举例来说，如酸酐或异氰酸酯等试剂可用于使珠粒表面上的反应性胺不活化。封端可在室温下进行约48小时或替代地在较高温度下并且缩短保温时间(如在50℃下24小时)。磁性珠粒技术描述于美国专利第5,512,439号中，其以引用的方式并入本文中。除了由cpg或磁性材料构成的那些以外的合成衬底也可用于本发明并且包括由聚苯乙烯(例如，聚苯乙烯-1％二乙烯基苯、大孔聚苯乙烯和聚(乙二醇)-聚苯乙烯(peg-ps))、聚酰胺(例如，聚酰胺键合的硅胶)、硅胶和纤维素构成的那些。这些衬底中的一些可以树脂形式获得。在许多情况下，树脂衬底可代替或结合珠粒置于孔中并且可用于核酸合成。其它核酸连接方法和采用所述方法的阵列是所属领域中已知的。举例来说，使用经胺或过氧化物(其打开醚桥键)活化的表面的方法是已知的。如本文别处所指出，对于所属领域中的ega方法，羟基已描述并且用于将核酸连接到二氧化硅珠粒表面。本发明包括这类连接方法和含有其的组合物。在一些情况下，还可能需要使用可具有凝胶状或粘滞结持或基质的半固体支撑物代替固体支撑物。本发明涵盖这种情况并且在本文提及固体支撑物的合适情况下，可使用非固体支撑物。决定可合成的核酸量的因素包括在上面进行合成的粒子的表面积和大小。因此，在一定程度上，可调节支撑物(例如，珠粒)参数以改变合成的核酸量。可用于本发明实践中的珠粒可在大小方面大幅变化，包括以下大小范围：约0.01μm至约1,000μm、约0.1μm至约1,000μm、约1.0μm至约1,000μm、约0.01μm至约400μm、约0.01μm至约200μm、约0.01μm至约100μm、约0.1μm至约100μm、约0.1μm至约50μm、约1.0μm至约600μm、约1.0μm至约400μm、约1.0μm至约200μm、约1.0μm至约100μm、约2.0μm至约400μm、约2.0μm至约200μm、约5.0μm至约500μm等的平均直径。在某些实施例中，珠粒的直径可在30μm与40μm之间，如31μm或32μm或33μm或34μm或35μm的直径。另外，可使用如下量的珠粒，使得可产生平均量的核酸：约0.00001纳摩尔至约0.0001纳摩尔、约0.00001纳摩尔至约0.001纳摩尔、约0.00001纳摩尔至约0.01纳摩尔、约0.0001纳摩尔至约0.001纳摩尔、约0.0001纳摩尔至约0.01纳摩尔、约0.0001纳摩尔至约0.1纳摩尔、约、约0.0001纳摩尔至约1,000纳摩尔、约0.001纳摩尔至约1,000纳摩尔、约0.01纳摩尔至约1,000纳摩尔、约10纳摩尔至约1,000纳摩尔、约30纳摩尔至约1,000纳摩尔、约50纳摩尔至约1,000纳摩尔、约200纳摩尔至约1,000纳摩尔、约1.0纳摩尔至约500纳摩尔、约1.0纳摩尔至约250纳摩尔、约10纳摩尔至约500纳摩尔等。在某些示例性实施例中，可使用约90飞摩尔至约150飞摩尔的量的珠粒，使得可产生平均量的核酸。在某些实施例中，可使用珠粒以使得每一珠粒可产生约1×109至约1×1013范围内的核酸分子数，例如1×1011个核酸分子。在许多情况下，一旦已达到特定大小，化学合成的核酸分子的产率就降低。在本发明的许多实施例中，化学合成的核酸分子将在约8至约100个核苷酸、约8至约35个核苷酸、约8至约40个核苷酸、约8至约50个核苷酸、约8至约100个核苷酸、约15至约100个核苷酸、约15至约75个核苷酸、约15至约50个核苷酸、约20至约60个核苷酸、约40至约400个核苷酸、约40至约300个核苷酸、约40至约200个核苷酸、约40至约100个核苷酸、约40至约90个核苷酸、约50至约400个核苷酸、约50至约300个核苷酸、约50至约200个核苷酸、约50至约100个核苷酸、约50至约90个核苷酸、约50至约80个核苷酸、约75至约400个核苷酸、约75至约300个核苷酸或约75至约200个核苷酸范围内。如所属领域的技术人员应认识到，所需产生的核酸的量将随着例如所用组装方法的应用和效率而变化。当生成可复制的分子(例如，经由pcr、插入到细胞中等)时，理论上仅需要生成一个经组装的核酸分子。如果所生成的核酸分子的数目减少到理论上仅生成一个完整组装的核酸分子的点，那么一半时间将生成不完整组装的核酸分子。因此，使用本发明方法产生的核酸量的一个下限基于可生成的完整组装的核酸分子的数目。这个数目将通常随着必须组合形成最终构建体的合成核酸分子的数目而变化。本发明的方法将通常被设计成在非组装扩增(例如，第一pcr组装产生一个或多个可复制的分子或其它最终产物核酸分子)之前生成约1至约500,000个、约10至约500,000个、约100至约500,000个、约500至约500,000个、约1至约1,000个、约1至约500个、约10至约1,000个、约10至约500个、约100至约1,000个、约100至约500个、约100至约5,000个、约100至约50,000个、约100至约250,000个、约1,000至约50,000个等经组装的核酸分子。如此段落中所用，“经组装的核酸分子”是指与使用例如末端引物扩增相比，通过由重叠寡核苷酸杂交引发的寡核苷酸直接组装所产生的所需产物核酸分子的数目。在直接组装之后扩增将随后产生由经组装的核酸分子制成的拷贝。本发明的这一特征的一个商业方面是所合成的寡核苷酸的数目可减到最少以节约成本。如所属领域的技术人员应理解，核酸合成衬底面积直接反映了可在所述衬底上合成的核酸分子的数目。下表5示出了珠粒大小、表面积计算值和可在规定珠粒上生成的核酸分子的估计数目。在一些实施例中，将使用2.8μm珠粒在每孔具有一个珠粒的板中进行寡核苷酸合成。另外，孔可被设计为约4和3μm深的圆柱形洞或腔室。当使用间距100微米的孔时，10mm2芯片可容纳10,000个孔。在其它实施例中，将使用35μm珠粒在每孔具有一个珠粒的板中进行寡核苷酸合成。孔可被设计为约50μm深和约40μm直径的圆柱形洞或腔室。在某些实施例中，孔间可存在约30μm间距。在某些实施例中，18mm2芯片可容纳约35,440个可寻址的孔。在许多情况下，当板是通过蚀刻制造时，孔将具有非圆柱形形状并且可为角锥形、锥形或方形。在一些情况下，孔可呈反向截头锥形。所生成的个别核酸分子的数目还将随着应用而变化。虽然可通过试剂使用减少实现成本节约，但是一般将期望生成例如高效组装所需的足够核酸分子。另外，所产生的具有特定核苷酸序列的核酸分子的数目将一般反映合成衬底的“携载能力”。举例来说，35微米珠粒通常可用于生成约1×1011个核酸分子。举例来说，在许多情况下，由于珠粒大小减小，可在每个珠粒上产生的核酸分子的数目也将减少。本发明的方法可用于生成约100至约1×1013个、约1,000至约1×1013个、约10,000至约1×1013个、约100至约1×1012个、约1,000至约1×1012个、约10,000至约1×1012个、约100至约1×1011个、约1,000至约1×1011个、约10,000至约1×101111个、约1×1011至约1×1013个、约100至约1×109个、约1,000至约1×109个、约10,000至约1×109个等设计成具有相同核苷酸序列的核酸分子。在某些示例性实施例中，每个珠粒或孔可生成约1×1011个核酸分子，而多个孔中所生成的设计成具有相同核苷酸序列的核酸分子的总量可为约1×105至约1×108个、约1×107至约1×1010个、约1×109至约1×1012个、约1×1011至约1×1013个、约1×1012至约1×1015个、约1×1011至约1×1016个，如约1×1012至约1×1013个。核酸分子合成位点(例如，孔)的数目可变化极大并且将通过多种因素决定，包括(1)工程改造和核酸分子合成硬件的限制和(2)所需核酸量(参见本文别处关于这个因素的论述)。举例来说，本发明实践中所用的合成平台中核酸分子合成位点(例如，孔)数目的总数可在9与300,000之间、9与100,000之间、9与40,000之间、9与1,000之间、9与500之间、1,000与200,000之间、1,000与400,000之间、1,000与500,000之间、1,000与1,00,000之间、1,000与10,000,000之间、20,000与1,000,000之间、50,000与10,000,000之间、10,000与5,000,000之间、1,000与100,000之间、2,000与100,000之间、5,000与100,000之间、10,000与100,000之间、20,000与100,000之间、30,000与100,000之间、1,000与80,000之间、1,000与70,000之间、1,000与50,000之间、1,000与40,000之间、1,000与30,000之间、1,000与20,000之间、1,000与10,000之间、1,000与8,000之间、1,000与5,000之间、5,000与50,000之间、10,000与50,000之间、5,000与35,000之间等变化。另外，每mm2核酸分子合成位点(例如，孔)的数目可在1,000与5,000之间、1,000与10,000之间、1,000与20,000之间、1,000与40,000之间、2,000与5,000之间、2,000与10,000之间、4,000与15,000之间、100与1,000之间、100与3,000之间、100与5,000之间、250与5,000之间等变化。在某些实施例中，孔数可为例如35,440个。在某些其它示例性实施例中，孔数可为例如196,160个或例如9020个。每个核酸分子合成位点(例如，孔)的试剂空间的量将随着孔的大小和形状并且具体来说，能够接收试剂的空间的面积而变化。这将随着以下因素而变化，如核酸分子合成位点是否是平坦表面(例如，依赖于表面张力以保持试剂定域在合成位点或空腔(例如，孔)上。另外，所施加试剂的量可由覆盖合成位点、递送必需量的反应物和/或稀释、去除或洗掉合成位点所存在的试剂所必需的试剂的量来决定。所施加试剂的量(当试剂是液体时)和在合成位点处的试剂空间的量可变化极大，包括在0.001×10-15l(飞升)与100μl之间、0.01×10-15l(飞升)与100μl之间、0.1×10-15l(飞升)与100μl之间、1.0×10-15l(飞升)与100μl之间、0.1×10-15l(飞升)与1μl之间、0.1×10-15l(飞升)与500nl之间、0.1×10-15l(飞升)与100nl之间、0.1×10-15l(飞升)与1nl之间、0.1×10-15l(飞升)与500pl(皮升)之间、0.1×10-15l(飞升)与100pl之间、0.1×10-15l(飞升)与10pl之间、0.1×10-15l(飞升)与1p1之间、0.001×10-15l(飞升)与1pl之间、0.001×10-15l(飞升)与1.0×10-15l(飞升)之间、0.001×10-15l(飞升)与100×10-15l(飞升)之间、1.0×10-15l(飞升)与500×10-15l(飞升)之间等。在本发明的各种方面中所用的孔的数目和大小将由微芯片的整体配置而决定，而用于核酸分子合成的珠粒的直径将继而取决于孔尺寸。在某些方面，微芯片的配置可通过某些参数的变化而加以调整。显示(i)芯片大小、(ii)有效面积和(iii)孔直径/距离的可能变化的示例性配置在图35的表中示出，其中所述有效面积包含其中含有孔(包括孔间的空间)的芯片的总面积。举例来说，18mm2微芯片可具有约73％的有效面积，其具有35,237个40μm直径和50μm深度的孔，孔间的距离为约30μm(孔直径的75％)并且孔容为6.28×10-5μl。在孔被配置成容纳一个珠粒的情况下，珠粒的直径(在乙腈中所测量)可为孔直径的约87.5％，在此实例中将为35μm。孔间的距离可在孔直径的10％至90％范围内，如20％至50％、30％至70％、50％至90％或60％至80％，例如75％。此外，孔的深度可在孔直径的约100％至约200％范围内，如约100％至约130％、约110％至约150％、约120％至约170％、约150％至约200％、约120％至约130％，例如约125％。在孔被配置成容纳单个珠粒的情况下，珠粒直径可在孔直径的约55％至约99％范围内，如约60％至约95％、约65％至约85％、约75％至约90％，例如约87％。在其它情况下，微芯片可被配置成在单个孔中容纳两个或更多个大小较小的珠粒。在某些实施例中，微芯片可具有如图24d中所示的形状，其具有叶状流室，而在其它实施例中，芯片可具有矩形或直角多边形。为了获得最优芯片配置，需要考虑某些参数变化的影响。尽管某些参数(如孔数或有效面积)可提供规模扩大的方式，但是其它参数可能影响芯片用于某些用途的性能或合适性。举例来说，大小太小的微芯片可能不允许用于流体学应用并且可能因此最小的大小不小于约10mm2，而大小太大的芯片(即，大于约20至25mm2)可能与高产率制造(例如，当使用cmos技术时)不兼容。同样，孔的大小和尺寸应使得可产生足够量的组装较大核酸分子所需的寡核苷酸。举例来说，直径小于约10μm的孔对于产生足够量的寡核苷酸可为次优的，而直径大于约90μm至约110μm的孔可致使试剂的扩散时间太长，其可在某些情况下，例如在产生ega的情况下存在问题。为了制造适合于核酸分子合成的固体支撑物材料，可将非核苷连接基团或核苷丁二酸共价连接到反应性氨基。然而，如果需要，其它表面官能团(如羧基、羟基或硫醇)例如可用于连接携载羟基的连接基团或替代地3′-连接的核苷酸。在许多情况下，在固体支撑物(如珠粒)上合成的核酸分子可通过连接基团物理偶合到支撑物。在某些示例性实施例中，连接基团，当存在时，可为将核酸分子的3′-o连接到固体支撑物(例如，固体支撑物上的官能团)的化学实体。在其它示例性实施例中，连接基团，当存在时，可具有使其可连接除3′-o以外的其它官能团的结构。这类连接基团结构公开在例如美国专利第7,202,264号中并且可根据本文所公开的某些实施例使用。在大多数情况下，连接基团对于在核酸分子合成期间所用的所有试剂将是稳定的，但是在合成方法结束时在特定条件下可裂解。核酸分子合成中常用的一种连接基团是丁二酰基连接基团。此外，通用连接基团可用于根据本文所公开和下文所论述的实施例的核酸分子合成。通用连接基团是不论待测序的第一核苷酸的3′-端碱基的性质都允许核酸分子合成的连接基团。具有不同特性的不同连接基团是所属领域的技术人员已知的并且可依据下游方法需求而由所属领域的技术人员选择。核苷固体支撑物(例如，预先用碱基衍生的支撑物)广泛用于核酸分子合成。这类支撑物的一个实例是其中3′-端核苷残基的3′-羟基经由3′-o-丁二酰基臂附接到固体支撑物的支撑物。核苷固体支撑物的使用需要使用预先用不同类型的碱基衍生的珠粒(每个碱基一个)。然而，核苷固体支撑物必须以序列特定方式(根据每个核酸分子所需的第一碱基)选择的事实使整个合成方法的生产量由于费力预先选择附接到特定起始碱基的珠粒并且分布到个别微孔而减少。更方便的合成方法开始于非核苷连接基团附接到固体支撑物材料的通用支撑物。此方法的优势在于可使用相同固体支撑物而不考虑欲合成的核酸分子的序列。可用于本发明的通用支撑物的一个实例描述在美国专利第7,202,264号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。然而，所属领域的技术人员已知的其它通用连接基团可同样适于进行本发明。为了从经组装的核酸分子完全去除连接基团和3′-端磷酸，所属领域中已知的一些通用固体支撑物需要氨气、氢氧化铵水溶液、醇、甲胺水溶液或其混合物。此外，所属领域中已知的一些通用固体支撑物可光裂解并且因此需要uv光波进行去除。参见例如anderson，e.等人，“用于寡核苷酸合成的新颖的可光裂解通用支撑物(novelphotocleavableuniversalsupportforoligonucleotidesynthesis)，”《核苷、核苷酸和核酸(nucleosides，nucleotidesandnucleicacids)》，第22卷(5-8)：1403-6(2003)，其公开包含受可光裂解基团保护的亲核胺的光裂解连接基团。在一些实施例中，可采用预先用存在的碱基(例如，du、da、dt、dc、dg等)衍生的支撑物。举例来说，可使用具有多个(例如，四个)负载区(例如，试剂流区)的合成芯片，使得预先用相同碱基衍生的珠粒可负载在同一区。另外，可进行多次合成操作，其中每次操作的起始碱基是不同的。因此，举例来说，可从da开始使用核酸分子进行第一次操作，随后是dc，接着是dt，接着是dg。另一种可能性将是合成核酸区段，其中所合成的所有核酸分子从相同碱基开始。举例来说，可选择从dg开始的合成起始点，选择作为起始点的初始dg经定位以使得生成合适的序列互补区，从而允许最终产物核酸分子的组装。多种用于合成核酸的方法是已知的。许多这些方法按照一系列基础步骤，如以下，以及使用例如乙腈、乙酸乙酯或适合于实践本发明的其它洗涤试剂的适当洗涤步骤：a)第一核苷酸，其已在5′位置处受保护(或在以5′至3′方向进行合成的某些实施例中，第一核苷酸可在3′位置处受保护)，衍生到如聚苯乙烯珠粒或受控微孔玻璃等固体支撑物，或是预先衍生获得的；b)第一核苷酸的糖基使用例如ega、含三氯乙酸的二氯甲烷或含二氯乙酸的甲苯脱保护(例如，经由脱除三苯甲基)(通常称为“脱保护”的方法)，其产生可监测反应进展的有色产物；c)第二核苷酸，其具有受保护的磷基、糖基和碱基，通常在催化剂(如四唑或4，5-二氰基咪唑)存在下添加到生长链中(通常称为「偶合」的方法)；d)使用例如乙酸酐和n-甲基咪唑封端未反应的第一核苷酸以避免缺失的累积(通常称为“封端”的方法)；e)通常使用任何合适的化合物(例如，碘试剂)氧化亚磷酸三酯以形成更稳定的磷酸三酯(通常称为“氧化”的方法)；f)按需要重复所述方法，其取决于所期望的核酸分子长度；以及g)通常在高温下使用氨水或氨气从固体支撑物进行裂解。所属领域的技术人员应认识到，在本发明的某些实施例中，步骤的次序可变化或包括洗涤步骤的一些步骤可根据所用方案而在适当时重复。在本发明中，现有技术亚磷酰胺合成化学通过修改以上方案的特定步骤而进一步改进。在一个实施例中，可使用有机催化剂提高例如偶合步骤的效率。有机催化剂和这类催化剂的一些用途陈述在avenier和hollfelder，组合介质效应和辅因子催化：金属配位合成酶使磷酸转移加速108(combiningmediumeffectsandcofactorcatalysis：metal-coordinatedsynzymesacceleratephosphatetransferby108)《欧洲化学(chem.eur.j.)》15：12371-12380(2009)和jordan等人，经由催化性p(iii)亚磷酰胺转移的不对称磷酸化：d-肌醇-6-磷酸的对映选择性合成(asymmetricphosphorylationthroughcatalyticp(iii)phosphoramiditetransfer：enantioselectivesynthesisofd-myo-inositol-6-phosphate)，《美国科学院院报(proc.nat.acad.sci.usa)》，107：20620-20624(2010)中。电化学生成酸和光生酸在一些实施例中，本发明利用经由电化学生成酸(ega)的产生的局部化学反应。在其它实施例中，本发明利用经由光生酸(pga)的产生的局部化学反应。举例来说，可寻址的电或光生信号可用于产生足够浓度的酸，从而使得可从表面脱除二甲氧基三苯甲基(dmt)保护基。(maurer等人，“电化学生成酸和其容放于100微米反应区域用于产生dna微阵列(electrochemicallygeneratedacidanditscontainmentto100micronreactionareasfortheproductionofdnamicroarrays)”《公共科学图书馆期刊(plos)》，第1期，e34(2006年12月).)作为在表面(例如，微表面)上的核酸分子合成方案的一部分，关于ega或pga产生的一个问题是“飞溅”到邻接区。“飞溅”，包括扩散，可导致反应发生在非预期位置(例如，由ega或pga的扩散引起)。虽然当一个反应发生时这类效应可相当微小，但是当多个反应接连发生飞溅效应时，多个反应循环可产生许多错掺的碱基。这个问题可以数种方式解决。一种方式是用缓冲液(例如，含有有机碱的缓冲液)覆盖反应区域，所述缓冲液足以中和酸(如果它离开局部环境)。另一种方式是通过物理容放或区室化。举例来说，如果ega或pga是在孔中生成并且催化所述孔中的反应，那么所述孔可具有足够大小以防止酸离开。孔内容量因此是孔的大小和生成酸的量的因数。在一些反应格式中，一些酸将不可避免地离开孔。除非足以催化反应的数量到达不应发生反应的另一个孔中，否则这将不造成问题。如上文所指出，覆盖缓冲液的使用可用于使这类反应减到最少。除飞溅以外的因素也可能导致失败或不完全的核酸合成，包括珠粒损失、具有珠粒的孔中的不完全填充、一个或多个孔的交叉污染、电极故障或试剂不正确或被污染。考虑到飞溅或这些其它因素，有待合成的每个单独的核酸分子可分配到不止一个孔中。另外，这些复制核酸分子在整个微芯片中的策略性放置可消减飞溅或可导致失败或不完全的核酸合成的其它因素的效应。与每个孔相关联的可个别寻址的电极的阵列允许相同核酸分子的复制品散布在整个微芯片。以此方式，可消减在合成步骤期间关于任何错误的效应。举例来说，如果在微芯片的特定区内发生意外事件(例如，相邻孔交叉污染、电极故障)，但是相同核酸分子的复制品散布在整个微芯片中而非集中在同一区中，那么较少复制品将受影响。这种风险消减策略可通过使用常规编程将相同核酸分子的复制品映射到微芯片的不同区来实现。向其中分配核酸分子进行合成的孔数可基于以下因素而变化，如有待产生的核酸的量、合成核酸分子有多难以及需要合成多少片段。向其中分配核酸分子的孔数可为例如1至10、1至20、1至50、1至100、1至1000、1至10,000、1至34,000、1至50,000、1至100,000、1至500,000、5至10、10至20、10至50、10至100、100至1000、1000至10,000、10,000至34,000、10,000至50,000、34,000至50,000、50,000至100,000以及100,000至500,000。举例来说，对于具有35,440个孔的微芯片，如果每个核酸分子被分配到10个孔中，那么可在单个微芯片上并行地合成3,544个核酸分子。增加微芯片中的孔数通常使得每个孔的体积大小较小。举例来说，对于具有35,440个孔的微芯片，孔的体积通常为约6.3×10-5μl。可用于本发明实践的板包括美国专利公开第2010/0137143a1号中所描述的修改形式的板，其公开内容以引用的方式并入本文中，示出了这类代表性板格式。图2a和2b是根据本发明的实施例的一行孔200的示意图。图的实施例2a和2b示出了各自在底部含有磁性珠粒201的五个孔。在每个孔下方的是电极202，其可将电流输送到与其相关联的孔。每个电极与电流控制器203连通，所述电流控制器调节通向电极的电流。磁性珠粒可含有与初始构建块缔合的连接基团。举例来说，珠粒可含有第一核苷酸(a、t、c、g或u碱基，或修饰碱基，取决于有待合成的核酸分子中所期望的第一碱基)。第一碱基可作为合成方法的一部分(例如，使用具有受保护羟基的珠粒)添加或可在插入到孔中之前经预先衍生。无论如何，在大多数情况下，将存在保护基(例如，在5′位置处)，其必须在另一碱基可作为核酸分子链的一部分共价连接之前去除。微流体通道(图2a中未示出)可被包括用于高效添加和从孔去除试剂。因此，本发明在某种程度上包括微流体板，其被设计成与微流体系统交界以便添加和从板孔去除流体。类似板中所用的微流体通道描述在美国专利公开第2010/0137143a1号中，其关于背景信息的公开内容以引用的方式并入本文中。图2a中所示的板204的覆盖物含有连接到电流控制器的对准电极。较大电极(例如，在所有孔的顶部上方延伸的电极)可被包括在覆盖物中以“闭合电路”。因此，覆盖物可含有与试图进行电化学反应的每个孔对准的一个电极；与板中的所有孔可操作连接的一个电极；或多个电极，其中的一些或全部与两个或更多个孔可操作连接。在一替代性实施例中，每个孔的覆盖电极替换成沿着每个孔的一个或多个侧壁嵌入或安放的一个或多个电极。因此，电极被安放在覆盖物中并非关键。实际上，在许多情况下，将电极放置在除覆盖物以外的位置将是所期望的(例如，易于制造)。还可包括参比电极(re)205以提供稳定和预定义的电位。为了在工作电极(we)上施加特定电位，可相对于re的电位测量we的电位。接着可调节反电极(ce)与we之间的电位，直到re与ce之间的电位具有正确值。一种用于脱保护的方法可采用在we上将氢醌氧化成苯醌(氧化还原系统)以便产生质子。为了设置孔中的特定ph值，可施加恒定电流一段规定的时间。在we不太活跃的情况下，we电位将出现强劲增长。这可能引起非预期反应(例如，溶剂氧化或we材料在高电位下损坏)。为了避免这种效应，可控制we的电位。电流控制器(可互换地，控制器)可为微处理器或处理器，如例如图15中所示。控制器(未示出)可包含常规电流控制系统，包括例如与存储器电路连通的微处理器电路。存储器电路可包括用于指导微处理器电路向一个或多个电极供电(例如，向与孔1或多个孔相关联的电极供电)的指令。任选地，存储器电路可包括用于激活一对电极中的一个(例如，激活与孔1相关联的底部电极)的指令。在另一实施例中，存储器电路可包括用于逐渐增加/降低电极偏压从而减小孔处突然电涌的可能性的指令。在另一个实施例中，电流控制器与外部处理器电路(如恒电位仪电路)、输入/输出(“i/o”)装置和显示器连通。电路或电路板能够控制装置并且还可用于与其它装置(如pc、ipad等)连通。在图2a实施例的一个变化形式中，两个电极(阳极和阴极)都可放置在孔底部。这使得电流可在孔底部附近生成，从而在紧邻珠粒的区域生成局部ega。依据将试剂添加到孔中和/或从孔中去除试剂的方法以及其它因素而定，这类配置可用于限制孔间的串扰、干扰或非预期ega污染。相关实施例在图2b中示出。此处，覆盖物含有对准电极205，其延伸到孔的试剂部分中。排流管206安放在每个孔的底部。这些排流管提供数种功能。一种功能是在化学反应步骤(例如，碱基添加、洗涤、脱保护等)完成时去除试剂。另一种功能是降低脱保护步骤的液面。换句话说，可将流体添加到所有孔中，随后可在向孔施加偏压之前经由排流管降低液面。降低孔的液面减少了孔间的交叉溢出并且增加了合成保真度。降低液面还降低了相邻孔之间的潜在串扰和污染。经由孔瓶的通用流体去除同样如此。这样做是因为ega的交叉孔污染可导致不正确的碱基掺入。即使ega生成的碱基错掺发生在邻接孔中合成的0.5％核酸分子中，但是最终结果可能是大致加倍的碱基错掺。因此，抽降孔中的液面和孔底部排流使得合成保真度提高。从孔中去除流体的一种方式是从孔的顶部。这可以通过多种方式来进行，包括使用移液管尖端或引入吸收性材料。在任一情况下，目标都将是从每个孔去除足够流体以使“飞溅”减到最少。在一些情况下，仅将会降低液面的孔将会是进行反应(例如，生成ega，导致脱保护)的孔。换句话说，液面降低可仅在生成一种或多种反应物的孔中进行。孔的构建可通过常规制造方法实现，包括例如cmos和vlsi技术。孔可在半导体或聚合物衬底中形成。在一示例性实施例中，使用常规蚀刻和开孔技术在半导体衬底中配置孔。孔的内表面可用绝缘材料涂布以减少相邻孔之间的串扰。在配套实施例中，可涂布孔表面以增加电导率，从而更均一地生成ega。孔表面可用不同层涂布以在增加孔内部电导率或热导率的同时减少串扰。因此，壁面可包含不同材料的复合物，其在减少孔间串扰的同时将提高每个孔内的电导率以便快速生成ega。孔的顶表面(相邻孔之间的跨距)也可经涂布以提供防试剂表面。举例来说，顶表面可用疏水性组合物涂布以抵抗交叉污染。用于减少孔与孔交叉污染的方法陈述在美国专利第6,444,111号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。此方法使用低浓缩碱作为质子清除剂，其产生在ega生成位点处的浓度高并且随着距反应中心的距离增加浓度降低的质子梯度。理想地，这类梯度应允许高效去除活性合成位置上dmt基团并且同时防止质子到达相邻合成位置。然而，此方法的难度在于将清除剂碱调节到使得在活性合成位置处100％脱保护并且在相邻非活性合成位置处0％脱保护的浓度。虽然过高的碱浓度将导致活性合成位点处不完全的脱保护反应，从而造成生长核酸分子中的缺失，但过低的碱浓度将使得质子可逃脱到相邻位点，从而造成那些非活性合成位点的脱保护和碱基插入。为了克服这些限制，本发明人已研发出一种使用结合到固体支撑物的质子清除剂碱的方法。使用清除剂珠粒避免合成位点之间串扰的代表性实施例在图47(画面a-f)中示出。在此实例中，核酸分子是在微流体芯片的孔中～32μm多孔单分散珠粒(“合成支撑物”)上经由如本文别处所述的ega生成来合成。去除合成支撑物上生长的核酸分子上的临时dmt保护基所需的质子(h+)是在包含有源电极的第一孔的底部生成(图47，画面a，左侧部分)，而在包含无源电极的相邻第二孔中未产生质子(图47，画面a，右侧部分)。第一孔中生成的质子扩散到孔顶部。为了防止质子离开第一孔，将用碱性基团(例如碱性胺基，如nh2或net2)涂布的较小珠粒(“清除剂珠粒”)置于第一和第二孔中以覆盖合成支撑物。碱性基团捕获从第一孔扩散的质子(在此实例中使得nh2基团转化成nh3基团)，使得无质子将到达具有无源电极的第二孔(图47，画面b)。假如一些质子可从第一孔逃脱，所述质子可在到达dmt保护基之前被第二孔中所存在的清除剂珠粒捕获。最后，用恢复溶液冲洗各孔以从清除剂珠粒去除质子，从而恢复清除剂珠粒上的碱性基团用于下一个合成循环。在图47画面c的实例中，恢复溶液包含碱性分子(例如，稀释于甲苯中的5％三乙胺(net3))。具有碱恢复特性的不同溶液是所属领域的技术人员已知的并且可由所属领域的技术人员依据所转化的清除剂基团的反应性来选择。质子介导的转化和经碱涂布的清除剂珠粒的后续恢复由图画面d至f进一步说明。在一些实施例中，清除剂碱不与用作合成支撑物上生长的核酸分子的构建块的亚磷酰胺反应。这可通过使用结合到脂肪族残基的非亲核清除剂基团(如三乙胺、二甲基吡啶或1，8-二氮杂双环十一-7-烯或二乙胺基团)来实现。或者，可选择在与亚磷酰胺反应后生成快速衰减的不稳定产物(如四唑盐)的清除剂碱。可提供各种大小的清除剂珠粒，但是应选择允许将多个清除剂珠粒与至少一个合成支撑物组合放置到孔中的大小。本发明实践中所用的清除剂珠粒大小可变化并且取决于孔的大小和/或给定大小的孔中所放置的合成支撑物的大小。通常，清除剂珠粒的大小可小于与清除剂珠粒组合使用的合成支撑物的大小。举例来说，清除剂珠粒的直径可为合成支撑物的直径的约10％、25％、30％、50％、60％、75％或80％。在某些实施例中，清除剂珠粒可包括直径在0.05μm与3μm、1μm与5μm、3μm与10μm、5μm与20μm、10μm与30μm之间的珠粒。在一些情况下，清除剂珠粒可填充含有合成珠粒的孔中大部分(例如，大于60％)的空隙。在这类情况下，清除剂珠粒将通常小到足以配合到各种空隙空间中。一个这类空隙空间是在合成珠粒下方的孔的下部。在一些情况下，清除剂珠粒可围绕合成珠粒。在这类情况下，合成珠粒将通常不填充孔的水平体积。在一些情况下，清除剂珠粒可大于含有合成珠粒的孔。在这类情况下，清除剂珠粒可用于将孔“封顶”。这类封顶清除剂珠粒可在更换试剂时由流体去除。另外，封顶清除剂珠粒可与小于合成珠粒的清除剂珠粒结合使用。在一些情况下，可调节孔深度以使得可在合成珠粒的顶部上添加各种深度的清除珠粒。在一些情况下，清除珠粒可与合成珠粒的大小相同并且孔的深度可适合于容纳两个珠粒。在这类情况下，通常清除珠粒将位于孔的顶部并且合成珠粒将位于孔的底部。如由实例11所进一步支持，本发明人已证明清除剂珠粒能够通过避免所生成质子的串扰而高效保护相邻合成位点。根据本发明的清除剂珠粒可用于应避免反应或合成位点之间的质子串扰的任何酸性环境(如使用电化学生成酸或光生酸的芯片或阵列格式，如本文别处所述)。所属领域的技术人员应理解，在生成碱(例如，电化学生成碱)的系统中，清除机制可逆转成使用在表面上携载酸性基团的清除剂珠粒。本发明因此包括一种用于保护固相核酸合成中的一个或多个第二合成位点不被在一个或多个相邻第一合成位点处生成的质子污染的方法，其中所述方法包含(a)提供在表面上携载碱性基团的固体支撑物，(b)将所述固体支撑物放置在第一合成位点，使得所述支撑物与从所述第一合成位点扩散的质子流体连通，(c)使得所述固体支撑物上的碱性基团与扩散质子反应，从而将所述碱性基团转化成相应酸，(d)任选地通过使所述固体支撑物与恢复剂接触而使所述固体支撑物上的碱性基团恢复。此外，本发明包含使用如上文针对基于ega或pga的核酸合成平台所指定的清除剂珠粒。最后，孔的形状可经配置以在增加反应速度的同时减少交叉污染。举例来说，孔可被配置成圆柱形、桶形或锥形。在许多使用例如图2a-2b的板配置的方法中，第一核苷酸的糖基是通过激活(供能)由电信号(或脉冲)引发的化学反应而脱保护。如本文别处所指出，一种用于这样做的方法是经由生成电化学生成酸(ega)。在其它实施例中，第一核苷酸的糖基是通过激活(供能)由光生信号引发的化学反应而脱保护。在许多情况下，控制所制造的化学反应物(例如，ega或pga)的量，从而在限制反应物交叉污染的可能性的同时高效催化脱保护反应。图17示出了具有三个电极的通道芯片设计的俯视图。反电极元件1700和1702位于两侧通道的顶部并且跨越流动通道1701的底部。还存在围绕具有工作电极1704的两个孔的参比电极1703。为了限制质子的流动，可采取一系列步骤，包括(1)使用在存在少量质子的情况下防止显著ph移位的缓冲液，(2)使用醌氧化还原系统以及(3)设计孔和通道的尺寸以使其之间维持相当大的距离(例如，根据通道体积使用小150倍的孔体积)。举例来说，出于说明目的使用图17中所示的示意图，工作电极1704与反电极元件1700和1702之间的距离可为约200μm。另外，通过碱分子拦截质子可用于降低到达其它孔的质子数。另外，孔之间具有与反电极元件1700和1702相同电位的参比电极条1703可用于生成碱分子并且还可防止质子“串扰”。如这些方法和组件，外加本文中所陈述的其它方法，实现高保真度核酸分子合成。出于说明目的，可将预先衍生的珠粒(其可为磁性或非磁性的)置于图2和2b的孔1至5中，其中“a”珠粒在孔1和5中，“c”珠粒在孔2中，“u”珠粒在孔3中并且“g”珠粒在孔4中。全部五个孔可随后用ega试剂(例如，含有甲醇、乙腈、氢醌、蒽醌、对甲苯磺酸四乙铵和2，6-二甲基吡啶的试剂)填充。接下来欲添加到链中的碱基是g并且有待生成的分子中在位置2处含有g的仅有的核酸分子在孔1中。因此，仅向孔1施加电流。这一电流形成酸性微环境，使得仅孔1中核苷酸的5′位置脱保护。在固定(或可变)的反应时间之后，洗涤全部五个孔。在催化剂(例如，四唑催化剂)存在下，将具有磷、糖和碱基(在此情况下，t)的核苷酸添加到所有孔中。在预定义的反应时间之后，洗涤全部五个孔并且可使用例如乙酸酐和n-甲基咪唑将未反应的第一核苷酸封端以避免缺失的累积。再次，在预定反应时间之后，洗涤全部五个孔并且可使用例如含碘试剂将通过化学反应形成的亚磷酸三酯氧化形成更稳定的磷酸三酯。随后重复这一方法，直到核酸分子的最末碱基已被添加。稍后，可从固体支撑物裂解合成的核酸分子。这可例如在加热下使用氨水或氨气来进行。然而，裂解方法可随着如所用连接基团等因素而变化。施加到每个孔的电流量和其持续时间将随着如有待生成的试剂量和孔大小等参数而变化。所施加的电流可为具有不同形状和/幅度的脉冲。脉冲可定义一系列不同幅度的脉冲(频率)或逐渐升高/降低的幅度。可调节脉冲的幅度和持续时间以优化试剂生成。举例来说，可调节施加到孔的电流持续一段规定的时间以便生成规定数量的ega。打算生成的ega的量将通常至少足够充分以完全催化所存在的核酸分子的脱保护。高保真度核酸合成需要在寡核苷酸链中添加下一个碱基之前发生几乎完全的寡核苷酸脱保护。不完全脱保护将通常产生“未脱保护”分子中缺失碱基的寡核苷酸子集。已显示强酸性环境使核酸分子脱嘌呤。这造成合成质量问题，因为强酸性条件将使得脱保护接近完全，但是还可能导致脱保护的寡核苷酸脱嘌呤。参数可按照在最低限度脱嘌呤的情况下进行寡核苷酸的接近完全脱保护的方式加以调节。为了实现这一目标可调节的一些因素包括与合成支撑物接触放置的ega前体的浓度、施加到含有合成支撑物的溶液的电流(直流或交流)的量、施加到溶液的电流的时长、溶液中缓冲剂的存在(当存在时，包括缓冲剂的类型、浓度和pka)、所合成的寡核苷酸分子数以及ega与合成支撑物接触的时长。本发明包括其中这些参数中的一个或多个以及其它参数经改变以调节核酸合成的保真度的组合物和方法。在许多情况下，将调节参数从而实现高保真度核酸合成。施加电流以影响基于ega的dmt脱保护：可不断施加至多2μa的电流并且将至多10v(如至多8v或7.5v)的电压施加到受控电路中的电极持续至多30秒的时段。在1ms至60s的时间期间，还可以1ms至2000ms的脉冲持续时间施加电流。还可以各种脉冲形式(例如，约两个至约10,000个、约十个至约10,000个、约五十个至约10,000个、约100个至约10,000个、约1,000个至约10,000个、约十个至约500个等脉冲)施加至多2μa(例如，约0.02na至约20,000na、约0.2na至约20,000na、约0.2na至约5,000na、约0.2na至约2,000na、约0.2na至约1,000na、约0.2na至约5000na、约2.0na至约20,000na、约2.0na至约10,000na、约2.0na至约5,000na、约2.0na至约2,000na、约5.0na至约20,000na、约5.0na至约8,000na、约10na至约20,000na、约10na至约8,000na、约10na至约5,000na、约20na至约20,000na、约20na至约8,000na、约50na至约20,000na、约50na至约10,000na、约50na至约5,000na、约100na至约10,000na、约500na至约20,000na、约500na至约10,000na、约500na至约5,000na、约1,000na至约20,000na、约1,000na至约10,000na等)的电流。在某些实施例中，可不断地或以脉冲形式施加至多约1μa(如至多约0.5μa或至多约0.3μa)的电流。在某些示例性实施例中，在工作电极与控制电极之间施加的电位为约7.5v。在一些情况下，电流可脉冲约1秒至约30秒、约2秒至约30秒、约4秒至约30秒、约5秒至约30秒、约5秒至约20秒、约5秒至约15秒、约5秒至约10秒等。当然，高效脱保护和核酸分子合成必须经测定，因为ega试剂的确切组成和浓度受电极和微孔的精确传导、结构和几何性质以及与电流的施加相关联的参数(电流、电压和时间)影响。ega组分的组成和浓度：ega试剂的确切组成和浓度受电极和微孔的精确传导、结构和几何性质以及与施加电流将ega转化成其酸形式相关联的参数(电流、电压和时间)影响。一般来说，为了影响脱保护所产生的ega的体积越小，所需电流强度和/或电流施加时间越小。由于这类微量系统中产生的核酸分子的量低于可直接并且精确测量的临限值，所以通常需要关于核酸分子合成和偶合效率的替代分析，如在目标扩增后的杂交或产物富集。多种试剂可用于产生电子生成酸。一般为了使连接到固体支撑物(例如，珠粒)的末端核苷酸脱保护，将需要局部生成酸。多种试剂是所属领域中已知的。这些试剂可含有当电子经由使用电极去除时产生质子的化合物、溶剂、缓冲剂和增强试剂混合物传导性的化合物。举例来说，由氢醌、醌、乙腈和六氟磷酸四丁铵构成的试剂陈述在pct公开wo2003/020415中。另外，由氢醌、蒽醌、乙腈、甲醇、对甲苯磺酸四乙铵和2，6-二甲基吡啶构成的试剂陈述在mauer等人，《公共科学图书馆期刊》，第1期：e34(2006)中。另外，由氢醌、苯醌、乙腈、甲醇、对甲苯磺酸四乙铵和2，6-二甲基吡啶构成的类似试剂陈述在pct公开wo2006/105037中。这些试剂可含有当电子经由使用电极去除时生成质子的化合物、溶剂、缓冲剂和增强试剂混合物传导性的化合物。由氢醌、醌、乙腈和六氟磷酸四丁铵构成的示例性试剂陈述在pct公开wo2003/020415中。另外，由氢醌、蒽醌、乙腈、甲醇、对甲苯磺酸四乙铵和2，6-二甲基吡啶构成的试剂陈述在mauer等人，《公共科学图书馆期刊》，第1期：e34(2006)中。另外，由氢醌、苯醌、乙腈、甲醇、对甲苯磺酸四乙铵和2，6-二甲基吡啶构成的类似试剂陈述在pct公开wo2006/105037中。乙腈可用能够溶解组分以形成解封闭溶液用于酸不稳定保护基的电化学解封闭的任何合适溶剂替换，只要所述溶剂不干扰化学合成方法即可。甲醇存在于解封闭溶液中以增强氢醌、苯醌和其衍生物的溶解性。简单来说，甲醇浓度越高，可添加到解封闭溶液中的氢醌越多。由于氢醌是在施加电场时的主要质子源，所以可调节所期望的氢醌浓度以在所选条件下生成所期望数目的质子。甲醇也可充当质子源。甲醇可用其它醇替换，只要甲醇官能团保存在解封闭溶液中即可。如果化合物在溶剂中的溶解度不成问题，那么可省略醇。苯醌被认为在阴极处反应形成氢醌衍生物。这种化合物也可被替换或甚至省略。然而，如果混合物中不存在苯醌(或类似化合物)，那么一般需要较高电位。这类较高电位可(1)损害电子组件和其它硬件，(2)诱导形成不期望的反应物，(3)破坏所产生的核酸分子以及(4)致使气泡形成。对甲苯磺酸四乙铵是向解封闭溶液提供传导性的盐，以允许在有源电极处电化学生成酸性试剂。这种化合物也可用执行类似功能的化合物替换。2，6-二甲基吡啶被认为通过与酸性试剂反应而将电化学生成酸性试剂限制于有源电极区域，因为电化学生成酸性试剂在有源电极上方立刻扩散远离所述空间。这种化合物也可用执行类似功能的化合物替换。可用于生成ega的溶剂可为水性或非水性的。陈述在美国专利第6,093,302号中的基于溶剂的水性ega试剂是由磷酸钠缓冲液ph7.2构成。其中公开的额外水性缓冲液包括乙酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、hepes缓冲液、mops缓冲液、磷酸盐缓冲液、tris缓冲液和ki溶液。非水性溶剂(例如，有机溶剂)可用于生成ega。溶剂的代表性实例包括二氯甲烷、1，1，1-三氯乙烷、1，1，2-三氯-1，2-二氟乙烷、1，1，2-三氯乙烷、1，4-二氯苯、1-丁醇、二甲亚砜、1-己烯、1-丙醇、乙酸2-(2-丁氧基乙氧基)乙酯、2-丁氧基乙醇乙酸酯、乙酸2-丁氧基乙酯、2-乙氧基乙醇乙酸酯、2-乙氧基乙醇、三乙二醇、2-甲氧基乙醇乙酸酯、2-甲氧基乙醇、2-甲基己烷、2-硝基丙烷、丙酮醇、丙酮、乙腈、烯丙醇、苯、乙苯、乙二醇、甲酰胺、糠醛、正甲氧基九氟丁烷、n-甲基吡咯烷酮、正壬烷、正辛烷、正辛醇、乙酸正丁酯、正戊烷、乙酸正丙酯、正丙醇、邻二氯苯、全氯乙烯、丙二醇二乙酸酯、丙二醇、叔戊醇、叔丁醇、四氢呋喃、甲苯、反式-1，2-二氯乙烯、三氯乙烯、三氯乙烯、三氯甲烷、氯乙烯二乙二醇、二甲基甲酰胺、糠醇、七氟环戊烷、七氟丙基甲基醚、庚烷、六氯环己烷、己烷、异戊醇、乙酸异丁酯、异丁醇、异丁酸异丁酯、异甲氧基九氟丁烷、异甲氧基九氟丁烷、异佛尔酮、乙酸异丙酯、异丙醇、甲醇、乙酸甲氧基丙酯、甲基戊基酮、甲基氯、甲基氯仿、甲基乙基酮、甲基二醇乙酸酯甲基异丁基酮、硝基苯、硝基甲烷、二丙二醇、乙醇、乙酸乙酯、乙苯、乙基醚、乙基二醇乙酸酯、乙基二醇、苯甲氯、联苯、二丙酮醇、二溴甲烷、二氯二苯基三氯乙烷、二氯乙烯、乙醚、环庚烷、环己烷、环己醇、环己酮、环壬烷、环辛烷、环戊烷、氯苯、氯溴甲烷、甲基丙基酮、单氯甲苯、正戊醇、乙酸正丁酯、正丁醇、正癸烷、环癸烷和二甲苯及其组合。在一些情况下，本发明的ega试剂可含有醇和/或二醇。可用于这类试剂中的醇和二醇包括2-乙氧基乙醇乙酸酯、2-乙氧基乙醇、2-甲氧基乙醇乙酸酯、2-甲氧基乙醇、1-丁醇、2-丁氧基乙醇乙酸酯、二甲基乙醇胺、二丙二醇、乙醇、乙基二醇乙酸酯、乙基二醇、乙二醇、甲醇、乙醇、丙醇、异丁醇、丙酮醇、烯丙醇、环己醇、二丙酮醇、二乙醇胺、二乙二醇、糠醇、异戊醇、异丙醇、正戊醇、正丁醇、正辛醇、正丙醇、丙二醇二乙酸酯、丙二醇、叔戊醇、叔丁醇、三乙醇胺和三乙二醇。在一些情况下，ega试剂可含有两种或更多种醇或二醇。在一些情况下，本发明的ega试剂可含有一种或多种盐(例如，有机盐)。可用于这类试剂中的盐包括1，3-二甲基-咪唑鎓双(五氟乙基)亚膦酸盐、1，3-二甲基-咪唑鎓甲基硫酸盐、1，3-二甲基-咪唑鎓三氟甲烷磺酸盐、1-丁基-3-甲基-咪唑鎓2-(2-甲氧基乙氧基)乙基硫酸盐、1-丁基-3-甲基-咪唑鎓双(三氟甲基)亚胺、1-丁基-3-甲基-咪唑鎓四羰基钴、1-丁基-3-甲基-咪唑鎓二氰胺、1-丁基-3-甲基-咪唑鎓六氟磷酸盐、1-丁基-3-甲基-咪唑鎓甲基硫酸盐、1-丁基-3-甲基-咪唑鎓辛基硫酸盐、1-丁基-3-甲基-咪唑鎓四氟硼酸盐、1-丁基-3-甲基-咪唑鎓甲苯磺酸盐、1-苯甲基-3-甲基-咪唑鎓六氟锑酸盐、1-苯甲基-3-甲基-咪唑鎓六氟磷酸盐、1-苯甲基-3-甲基-咪唑鎓甲基硫酸盐、1-苯甲基-3-甲基-咪唑鎓四氟硼酸盐、1-苯甲基-3-甲基-咪唑鎓三氟甲烷磺酸盐、1-丁基-1-甲基-吡咯烷鎓双(三氟甲基磺酰基)亚胺、1-乙基-2，3-二甲基-咪唑鎓三氟甲烷磺酸盐、1-乙基-3-甲基-咪唑鎓双(五氟乙基)亚膦酸盐、1-乙基-3-甲基-咪唑鎓双(五氟乙基磺酰基)亚胺、1-乙基-3-甲基-咪唑鎓双(三氟甲基)亚胺、1-乙基-3-甲基-咪唑鎓双(三氟甲基磺酰基)亚胺、1-丁基-1-甲基-吡咯烷鎓二氰胺、六氟磷酸四丁铵、对甲苯磺酸四乙铵、1，1-二丁基-吡咯烷鎓双(三氟甲基磺酰基)亚胺、1，1-二甲基-吡咯烷鎓三(五氟乙基)三氟磷酸盐、1，1-二丙基-吡咯烷鎓双(三氟甲基磺酰基)亚胺、1，2-二甲基-3-丙基咪唑鎓双(三氟甲基磺酰基)亚胺、1，2-二甲基-3-丙基咪唑鎓三(三氟甲基磺酰基)甲基化物、1-丁基-1-甲基-吡咯烷鎓六氟锑酸盐、1-丁基-1-甲基-吡咯烷鎓六氟磷酸盐、1-丁基-1-甲基-吡咯烷鎓甲基硫酸盐、1-丁基-1-甲基-吡咯烷鎓四氰基硼酸盐、1-丁基-1-甲基-吡咯烷鎓四氟硼酸盐、1-丁基-1-甲基-吡咯烷鎓三氟甲烷磺酸盐、1-丁基-1-甲基-吡咯烷鎓三(五氟乙基)三氟磷酸盐、1-丁基-2，3-二甲基-咪唑鎓六氟锑酸盐、1-丁基-2，3-二甲基-咪唑鎓六氟磷酸盐、1-丁基-2，3-二甲基-咪唑鎓甲基硫酸盐、1-丁基-2，3-二甲基-咪唑鎓四氟硼酸盐、1-丁基-2，3-二甲基-咪唑鎓甲苯磺酸盐、1-丁基-2，3-二甲基-咪唑鎓三氟甲烷磺酸盐、1-丁基-3-乙基-咪唑鎓三氟甲烷磺酸盐、1-丁基-3-甲基-咪唑鎓三氟乙酸盐、1-丁基-3-甲基-咪唑鎓三氟甲烷磺酸盐、1-丁基-3-甲基-吡啶鎓双(三氟甲基磺酰基)亚胺、1-丁基-4-甲基-吡啶鎓六氟磷酸盐、1-丁基-4-甲基-吡啶鎓四氟硼酸盐、1-丁基-咪唑鎓六氟磷酸盐、1-丁基-咪唑鎓四氟硼酸盐、1-丁基-咪唑鎓甲苯磺酸盐、1-丁基-咪唑鎓三氟甲烷磺酸盐、1-乙基-1-甲基-吡咯烷鎓双(三氟甲基)亚胺、1-乙基-1-甲基-吡咯烷鎓六氟锑酸盐、1-乙基-1-甲基-吡咯烷鎓六氟磷酸盐、1-乙基-1-甲基-吡咯烷鎓甲基硫酸盐、1-乙基-1-甲基-吡咯烷鎓四氟硼酸盐、1-乙基-1-甲基-吡咯烷鎓三氟甲烷磺酸盐、1-乙基-2，3-二甲基-咪唑鎓六氟锑酸盐、1-乙基-3-甲基-咪唑鎓甲苯磺酸盐、1-乙基-3-甲基-咪唑鎓三氟乙酸盐、1-乙基-3-甲基-咪唑鎓三氟甲烷磺酸盐、1-乙基-3-甲基-咪唑鎓三氟甲基三氟硼酸盐、1-己基-1-甲基-吡咯烷鎓双(三氟甲基磺酰基)亚胺、1-己基-1-甲基-吡咯烷鎓二氰胺、1-己基-2，3-二甲基-咪唑鎓四氟硼酸盐、1-己基-2，3-二甲基-咪唑鎓三氟甲烷磺酸盐、1-己基-3-甲基-咪唑鎓双(三氟甲基磺酰基)酰亚胺、1-己基-3-甲基-咪唑鎓双(三氟甲基磺酰基)甲烷、1-己基-3-甲基-咪唑鎓二氰胺、1-己基-3-甲基-咪唑鎓六氟锑酸盐、1-己基-3-甲基-咪唑鎓六氟磷酸盐、1-己基-3-甲基-咪唑鎓甲基硫酸盐、1-己基-3-甲基-咪唑鎓四氰基硼酸盐、1-乙基-2，3-二甲基-咪唑鎓六氟磷酸盐、1-乙基-2，3-二甲基-咪唑鎓甲基硫酸盐、1-乙基-2，3-二甲基-咪唑鎓四氟硼酸盐、1-乙基-2，3-二甲基-咪唑鎓甲苯磺酸盐、1-乙基-3-甲基-咪唑鎓双[1，2-苯二酚合(2-)-o，o′]-硼酸盐、1-乙基-3-甲基-咪唑鎓双[乙二酸根合(2-)]-硼酸盐、1-乙基-3-甲基-咪唑鎓四羰基钴、1-乙基-3-甲基-咪唑鎓二氰胺、1-乙基-3-甲基-咪唑鎓六氟锑酸盐、1-乙基-3-甲基-咪唑鎓六氟磷酸盐、1-乙基-3-甲基-咪唑鎓硝酸盐、1-乙基-3-甲基-咪唑鎓四氟硼酸盐、1-己基-3-甲基-咪唑鎓三(七氟丙基)三氟磷酸盐、1-己基-3-甲基-咪唑鎓三(五氟乙基)三氟磷酸盐、1-己基-3-甲基-咪唑鎓三(五氟乙基)三氟磷酸盐、1-己基-3-甲基-咪唑鎓四氟硼酸盐、1-己基-3-甲基-咪唑鎓三氟甲烷磺酸盐、1-甲基-3-(3，3，4，4，5，5，6，6，7，7，8，8，8-十三氟辛基)-咪唑鎓六氟磷酸盐、1-甲基-3-辛基-咪唑鎓四氟硼酸盐、1-甲基-咪唑鎓六氟磷酸盐、1-辛基-3-甲基-咪唑鎓双(三氟甲基磺酰基)亚胺、1-辛基-3-甲基-咪唑鎓双(三氟甲基磺酰基)甲烷、1-辛基-3-甲基-咪唑鎓六氟锑酸盐、1-戊基-3-甲基-咪唑鎓三(九氟丁基)三氟磷酸盐、1-戊基-3-甲基-咪唑鎓三(五氟乙基)三氟磷酸盐、1-苯丙基-3-甲基-咪唑鎓六氟锑酸盐、1-苯丙基-3-甲基-咪唑鎓三氟甲烷磺酸盐、1-十四基-3-甲基-咪唑鎓四氟硼酸盐、3-乙基-n-丁基-吡啶鎓六氟锑酸盐、3-乙基-n-丁基-吡啶鎓六氟磷酸盐、3-乙基-n-丁基-吡啶鎓四氟硼酸盐、3-乙基-n-丁基-吡啶鎓三氟甲烷磺酸盐、1-甲基-咪唑鎓四氟硼酸盐、1-甲基-咪唑鎓甲苯磺酸盐、1-甲基-咪唑鎓三氟甲烷磺酸盐、1-十八烷基-3-甲基-咪唑鎓双(三氟甲基磺酰基)亚胺、1-十八烷基-3-甲基-咪唑鎓六氟磷酸盐、1-辛基-1-甲基-吡咯烷鎓双(三氟甲基磺酰基)亚胺、1-辛基-3-甲基-咪唑鎓六氟磷酸盐、1-辛基-3-甲基-咪唑鎓甲基硫酸盐、1-辛基-3-甲基-咪唑鎓四氟硼酸盐、3-甲基-1-丙基-吡啶鎓双(三氟甲基磺酰基)亚胺、3-甲基-n-丁基-吡啶鎓六氟锑酸盐、3-甲基-n-丁基-吡啶鎓六氟磷酸盐、3-甲基-n-丁基-吡啶鎓甲基硫酸盐、3-甲基-n-丁基-吡啶鎓四氟硼酸盐、3-甲基-n-丁基-吡啶鎓三氟甲烷磺酸盐、4-甲基-n-丁基-吡啶鎓六氟磷酸盐、4-甲基-n-丁基-吡啶鎓四氟硼酸盐、苯甲基三苯基鏻双(三氟甲基)亚胺、双(三氟甲基磺酰基)亚胺、双-四甲基乙二酸铵、丁基二甲基咪唑鎓六氟磷酸盐、二甲基二硬脂基硫酸氢铵、二甲基二硬脂基甲基硫酸铵、乙基三苯基鏻乙酸盐、n-丁基吡啶鎓三氟甲烷磺酸盐、n-己基吡啶鎓双(三氟甲基磺酰基)亚胺、三氟甲烷磺酸胍、三(五氟乙基)三氟磷酸胍、三氟甲烷磺酸六甲基胍、三(五氟乙基)三氟磷酸六甲基胍、三氟甲烷磺酸n，n，n′，n′，n″-五甲基-n″-异丙基胍、三氟甲烷磺酸n，n，n′，n′-四甲基-n″-乙基胍、三氟磷酸n，n，n′，n′-四甲基-n″-乙基胍、n-丁基-吡啶鎓双(三氟甲基)亚胺、n-丁基-吡啶鎓六氟锑酸盐、n-丁基-吡啶鎓六氟磷酸盐、n-丁基-吡啶鎓甲基硫酸盐、n-丁基-吡啶鎓四氟硼酸盐、三(五氟乙基)三氟磷酸n，n，n′，n′，n″-五甲基-n"-异丙基胍、三氟甲烷磺酸n，n，n′，n′，n″-五甲基-n"-丙基胍、n-己基-吡啶鎓双(三氟甲基磺酰基)甲烷、三氟甲烷磺酸o-乙基-n，n，n′，n′-四甲基异脲、三(五氟乙基)三氟磷酸o-乙基-n，n，n′，n′-四甲基异脲、三氟甲烷磺酸o-甲基-n，n，n′，n′-四甲基异脲、三(五氟乙基)三氟磷酸四乙铵、双(三氟甲基)亚胺四甲铵、双(三氟甲基磺酰基)亚胺四甲铵、双[乙二酸根合(2-)]-硼酸四甲铵、双[水杨酸根合(2-)]硼酸四甲铵、六氟磷酸四甲铵、四氟硼酸四甲铵、三(五氟乙基)三氟磷酸四甲铵、乙基硫酸三丁基乙铵、双(2，4，4-三甲基苯基)亚膦酸三己基(十四基)-鏻、双(三氟甲基磺酰基)亚胺三己基(十四基)-鏻、双(三氟甲基磺酰基)甲烷三己基(十四基)-鏻、n-己基-吡啶鎓六氟磷酸盐、n-己基-吡啶鎓四氟硼酸盐、n-己基-吡啶鎓三氟甲烷磺酸盐、n-辛基-吡啶鎓双(三氟甲基磺酰基)亚胺、n-辛基-吡啶鎓三(三氟甲基磺酰基)甲烷、三氟磷酸o-甲基-n，n，n′，n′-四甲基-异脲、三氟甲烷磺酸s-乙基-n，n，n′，n′-四甲基异硫脲、三(五氟乙基)三氟磷酸s-乙基-n，n，n′，n′-四甲基异硫脲、四氟硼酸s-乙基-n，n，n′，n′-四甲基异硫脲、双(三氟甲基)亚胺四丁铵、双(三氟甲基磺酰基)亚胺四丁铵、硫酸氢四丁铵、六氟磷酸四丁铵、硝酸四丁铵、双(三氟甲基)亚胺四乙铵、双(三氟甲基磺酰基)亚胺四乙铵、高氯酸四丁铵、硫酸四丁铵、四氰基硼酸四丁铵、四氟硼酸四丁铵、三(五氟乙基)三氟磷酸四丁铵、乙酸四丁鏻、双(三氟甲基)亚胺四丁鏻、双[1，2-苯二酚合(2-)-o，o′]-硼酸四丁鏻、双[乙二酸根合(2-)]-硼酸四丁鏻、四氰基硼酸四丁鏻、三(五氟乙基)三氟磷酸四丁鏻、双[1，2-苯二酚合(2-)-o，o′]-硼酸四乙铵、双[1，2-联苯二酚合(2-)-o，o′]-硼酸四乙铵、双[丙二酸根合(2-)]-硼酸四乙铵、双[水杨酸根合(2-)]-硼酸四乙铵、六氟磷酸四乙铵、顺丁烯二酸氢四乙铵、四氟硼酸四乙铵、甲苯磺酸四乙铵、双[1，2-苯二酚合(2-)-o，o′]-硼酸三己基(十四基)-鏻、癸酸三己基(十四基)-鏻、三己基(十四基)-鏻二氰胺、六氟磷酸三己基(十四基)-鏻、四氰基硼酸三己基(十四基)-鏻、四氟硼酸三己基(十四基)-鏻、三(五氟乙基)三氟磷酸三己基(十四基)-鏻和甲苯磺酸三异丁基(甲基)-鏻及其组合。缓冲剂可包含例如有机碱并且可以约0.0001mm至约200mm的浓度存在。有机碱的代表性实例包括n，n-二异丙基乙胺、二甲基吡啶(二甲基吡啶异构体)、r1、r2和r3独立地选自由以下组成的群组：氢、经取代和未经取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂环和多环基团、和卤基、酰胺、羧基、氨基、仲氨基、叔氨基、肼基、叠氮基、烷基氧化偶氮基(alkazoxy)、氰基、异氰基、氰氧基、氰硫基、雷酸酯基、氰硒基、羧酰胺基、酰亚胺基、亚硝基、氨氧基、腙基、肟、酰肼基、脒基、硫基、硫代亚砜、砜、硫代砜、硫代硫酸酯基、羟基、甲酰基、氢过氧基、氨基甲酰基、三甲基硅烷基、硝基、亚硝基、氨基乙二酰基、五唑基、氨磺酰基、氨次磺酰基、次磺基、胺亚磺酰基、亚磺基、磺基、磺氨基、氢巯基、四唑基、硫代氨甲酰基、硫代卡腙基、硫代卡二腙基、硫代卡肼基、硫代羧基、硫代甲酰基、硫代酰基、氰硫基、硫代半卡肼基、硫代亚磺基、硫代磺基、硫脲基、三氮烷基、三氮烯基、三嗪基、三硫代磺基和磷酸酯。r4、r5、r6、r7、r8、r9和r10独立地选自由以下组成的群组：氢、经取代和未经取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂环和多环基团、和卤基、酰胺、烷氧基、酰基、酰氧基、氧基羰基、烷氧基羰氧基、羧基、氨基、仲氨基、叔氨基、肼基、叠氮基、烷基氧化偶氮基、氰基、异氰基、氰氧基、氰硫基、雷酸酯基、氰硒基、羧酰胺基、酰亚胺基、亚硝基、氨氧基、羧酰亚胺基、腙基、肟、酰肼基、脒基、硫基、亚砜、硫代亚砜、砜、硫代砜、硫代硫酸酯基、羟基、甲酰基、羟基过氧基、氢过氧基、过氧酸、氨基甲酰基、三甲基硅烷基、硝基、亚硝基、氨基乙二酰基、五唑基、氨磺酰基、氨次磺酰基、次磺基、胺亚磺酰基、亚磺基、磺基、磺氨基、氢巯基、四唑基、硫代氨甲酰基、硫代卡腙基、硫代卡二腙基、硫代卡肼基、硫代羧基、硫代甲酰基、硫代酰基、氰硫基、硫代半卡肼基、硫代亚磺基、硫代磺基、硫脲基、三氮烷基、三氮烯基、三嗪基、三硫代磺基和磷酸酯。酸产生剂和碱产生剂(当存在时)可为多种化合物，包括醌和非醌化合物。在一些实施例中，氢醌和苯醌可用硫代苯酚、1，4-丁二硫醇、1，3-丙二硫醇、甲基噻吩或其它硫醇替换。ega试剂可含有约0.1mm至约2.0m硫代苯酚、1，4-丁二硫醇、1，3-丙二硫醇、甲基噻吩或其它硫醇或其组合。还可使用其它化合物，如各种醌化合物。可能有用的化合物的实例是2-甲基氢醌、甲基氢醌、2-叔丁基氢醌、2，5-二叔丁基氢醌、2，6-二叔丁基氢醌、2，6-二甲基氢醌、2，3，5-三甲基氢醌、戊基醌、戊氧基氢醌、萘醌、蒽醌、4-叔丁基儿茶酚、4，6-二叔丁基儿茶酚、2，3，5，6-四氯-1，4-苯醌、甲基苯醌、2，6-二甲基苯醌和各种醌氢醌。ega试剂，还包括氢醌和苯醌与含六氟磷酸四丁铵或对甲苯磺酸四乙铵的无水乙腈，用于经由阳极氧化生成电化学酸以影响脱保护。其它ega试剂包括肼；三苯基甲烷衍生物；苯二胺；抗坏血酸；氢醌苯醌的衍生物和经取代的苯醌，包括(但不限于)四甲基苯醌、甲基氢醌、叔丁基氢醌和二叔丁基氢醌；儿茶酚，如3-甲基儿茶酚和4-甲基儿茶酚；1，3-二羟基萘；四氰基对醌二甲烷；蒽醌；四氰基对醌二甲烷；碘；n-卤基丁二酰亚胺，如n-氯丁二酰亚胺；烷基二硫烷；和具有氮的芳香族系统，如黄素。在施加电流影响脱保护之前，可制备浓度足以使得保护基(如dmt保护基)脱保护的ega试剂并且施用到芯片。举例来说，可提供浓度为约0.1m至约1m、约0.5m至约5m、约0.5m至约2m(如约1m)的ega试剂，其中上限可取决于所用试剂的溶解度。在确定最佳参数时，将一般需要避免由dna过度暴露于酸脱嘌呤引起的碱基损伤。同样，在某些实施例中，可经由在足以使得保护基(如dmt保护基)脱保护的浓度下产生光生酸而发生局部化学反应。本发明的一个方面是溶液的ph值可以受控方式通过光生酸而变化，如本文所公开。如本文所用，术语光生酸(pga)是指在由具有特定波长的光子辐照或光照之后由pga前体试剂(pgapr)产生的酸。光子的波长可在电磁波谱的任何适当区中，包括例如红外、可见、紫外或x射线波长。在某些实施例中，波长可介于约390nm至约700nm、如约400nm至约600nm范围内。在某些其它实施例中，波长可介于约200nm至约400nm、如约250nm至约350nm范围内。pgapr可为在辐照(例如用可见光和/或紫外光辐照)后产生pga的任何化合物。pgapr的非限制性实例可包括美国专利第6,426,184号中所公开那些。举例来说，根据本文所公开的各种实施例可使用的pgapr可包括重氮盐、全卤甲基三嗪、卤基双苯基a、磺酸盐、酰亚胺磺酰基酯、二芳基錪盐、锍盐、重氮磺酸盐和二芳基砜。在某些实施例中，pgapr可存在于具有至少一种溶剂的溶液中。至少一种溶剂可为化学反应中传统使用的任何常规溶剂，如ch2cl2、ch3cn、甲苯、己烷、ch3oh、h2o和/或包含如nacl、mgcl2和磷酸盐等至少一种溶质的水溶液。包含pgapr和至少一种溶剂的溶液可随后由具有特定波长的光子辐照或照射，使得pga生成。在本文所公开的某些实施例中，包含pgapr和至少一种溶剂的溶液可另外包含缓冲剂、中和剂、光敏剂、稳定剂和粘度添加剂中的至少一种。如本文所用，光敏剂可定义为激发能低于溶液中所用的pgapr的化合物。光敏剂可通过辐照激发，并且经激发的光敏剂进而致使pgapr生成pga。因此，光敏剂可用于降低生成pga所需的激发波长。可用于本文所公开的实施例中的合适光敏剂的非限制性实例包括例如美国专利第6,426,184号中所公开那些，如蒽和其衍生物、二氰基蒽、噻吨酮、氯噻吨、芘、二苯甲酮、苯乙酮、苯甲酰基c1-c12烷基醚、苯甲酰基三苯基膦氧化物、ru2+络合物和其衍生物。根据本文所公开的某些示例性实施例，核苷酸连接基团分子可附接到固体支撑物(如珠粒)，其中每个核苷酸可在5′-oh端受酸不稳定保护基保护。根据本文所公开的其它示例性实施例，通用连接基团分子可附接到固体支撑物，如珠粒。在某些实施例中，酸不稳定保护基可例如选自二甲氧基三苯甲基(dmt)或甲氧基三苯甲基(mmt)。在某些实施例中，核苷酸附接到珠粒，并且珠粒位于孔(如多孔板的孔)中。多孔板的孔可随后与pgapr溶液和光接触，用以生成pga。pga随后使5′-oh脱除酸不稳定保护基。脱保护的5′-oh基团可随后与如5′-oh端还受酸不稳定保护基保护的额外核苷酸等单体反应。可随后重复所述方法以使核酸链生长到所期望的长度。一般来说，未曝光的孔中将不生成pga。因此，可将预定光图案投影到多孔板的孔上，使得仅指定孔中的珠粒将暴露于pga并且脱保护。施加到每个孔的光量和其持续时间将随着如有待生成的试剂量和孔大小等参数而变化。光可定义一系列频率变化或频率逐渐升高/降低的脉冲。可调节脉冲的频率和持续时间以优化试剂生成。举例来说，可调节施加到孔的光持续一段规定的时间以便生成规定数量的pga。打算生成的pga的量将通常至少足够充分以完全催化所存在的核酸分子的脱保护。在本文所公开的实施例中，多孔板可为例如微芯片(如玻璃芯片)，其孔中包含光刻胶聚合物，如su-8suex(可从djdevcorp购得)。在某些实施例中，本文所公开的多孔板的覆盖物可为玻璃，并且光可来自光学半导体装置，如数字微镜装置(dmd)。在本文所公开的其它示例性实施例中，多孔板可为可从roche购得的454测序芯片。举例来说，多孔板可为包含光纤束的454测序芯片，所述光纤束可用于引导光穿过光纤到测序芯片上的个别孔或孔集合。微芯片可具有高密度孔，其可捕获大小范围介于例如约30μm至约40μm的珠粒。如所属领域的技术人员应了解，454测序芯片可视需要经修改以适合本文所公开的本发明实施例。生成pga所必需的光波长可通过所属领域中已知的任何光学系统产生。示例性光学系统可包含例如光源、至少一个滤光器、至少一个聚光透镜、反射器、dmd和投影透镜。在某些实施例中，光学系统可选自光纤阵列、液晶显示器(lcd)、液晶光阀、声光扫描光调制器(slm)、电流测定激光扫描器等等。在某些实施例中，可使用光掩模，例如美国专利第6,426,184号中所公开的具有计算机控制的空间光学调制器的光掩模。珠粒的使用与利用pga的核苷酸脱保护组合可相比在核酸分子合成中使用二维表面具有优势。举例来说，通过使用多孔珠粒可获得比二维表面大高达1,000倍的核酸分子浓度。此外，使用珠粒可使得能够分离(且随后释放并汇集在一起)仅属于单个所期望片段的珠粒。分离可通过任何可行的方式进行，例如通过本文所公开的方法；通过光力，如光镊；气泡生成，例如经由激光加热生成；微量移液；声力；等。用于分离珠粒的其它非限制性示例性方法可见于美国公开专利申请第2010/0216648号，其以引用的方式并入本文中。电润湿在本发明的一些方面中，可采用“电润湿”。其中电润湿可特别有用的本发明的两个方面是关于混合用于(1)核酸合成和汇集(模块1和2)和(2)组装(模块3)的试剂。简单来说，电润湿涉及使用电压修改固体表面上液体的表面张力。可修改电场(例如，交流或直流)的施加、流体与表面之间的接触角。举例来说，通过施加电压，疏水性表面的润湿特性可变得越来越亲水并且因此可润湿的。电润湿原理是基于在包含电极阵列的表面上操纵液滴和使用电压改变界面张力。在一些实施例中，电极阵列不与流体直接接触。在额外实施例中，电极阵列可经配置以使得支撑物具有亲水侧和疏水侧。经受电压的液滴将向着亲水侧移动。在一些实施例中，电极的阵列或图案可为高密度图案。当与亚磷酰胺化学试剂(以及其它试剂)结合使用时，电极阵列应能够移动体积范围介于1pl(和更少)至10pl的液滴。因此，本发明的方面涉及高电压互补性半导体微流体控制器。在一些实施例中，高电压互补性半导体装置(hv-cmos)具有含高密度电极图案和高电压电子器件的集成电路。在一些实施例中，所施加的电压在15v与30v之间。电润湿方法陈述在美国专利公开第2012/0220497a1号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。电润湿通过使用电压改变液滴的形状而起作用。在一些情况下，电润湿涉及定位在经电介质涂布的电极上的固着液滴。当施加电流时，液滴展平并且向外流动到侧边，从而润湿额外表面。当去除电流时，液滴返回到其原始形状并且从在电流施加后所覆盖的区域缩回。电润湿方法陈述在以下url的论文中：http：//www.ll.mit.edu/publications/journal/pdf/vol17_no2/17_2_4berry.pdf在本发明的一些实施例中，核酸合成位点可邻近的是当电流施加到正确试剂位置时流入合成位点和从合成位点撤回的一系列试剂。因此，本发明包括通过添加和从合成位点去除试剂用于合成核酸分子的方法，其通过添加和从相邻试剂去除电流而诱发。在一些情况下，邻近于核酸合成位点的试剂数可为约2至约10、约3至约10、约4至约10、约5至约10、约6至约10等。电润湿方法还可用于片段组装和纠错(模块3)。因此，本发明包括使用电润湿混合试剂用于核酸分子的组装和纠错的方法。在本发明的这些方面，可与核酸分子接触的试剂包括核酸外切酶、错配修复核酸内切酶(mme)、连接酶、缓冲剂、edta溶液等。使用电润湿方法的一个问题是“飞溅”，其可发生在混合区域之间并且还因为在许多情况下，使用平坦或半平坦表面。因此，除非采用微流体排出通道等，否则在试剂变更期间存在混合区域的飞溅污染的可能性。用于使此混合减到最少的两种方式是经由使用微流体通道和屏障。可放置屏障(例如，物理屏障，如升高的区域)以防止试剂从一个混合区域移动到另一个。在所期望的反应完成之后，可去除屏障。可在不同和/或重叠的混合区域子集依次进行不同反应。如上文所提及，核酸合成方法可在系统中根据本文所描述的各种实施例由处理器或计算系统实施和控制，如图15中所描绘的示例性计算系统。举例来说，施加电流(脉冲或连续波)到所选孔以生成特定数量的ega完全催化脱保护可受到根据本发明教示的各种实施例执行处理器可执行指令的计算系统控制。同样，施加光源到所选孔以生成特定数量的pga也可以受到执行处理器可执行指令的计算机系统控制。还可经由使用氧化还原系统进行解封闭。这类系统系统的实例包括氢醌/蒽醌；ph缓冲剂(如2，6-二甲基吡啶)以减少活性孔与非活性相邻孔之间的质子串扰。核酸分子的高效产生可能需要调整核酸合成步骤以适合所构建的分子。考虑以下实例，为了构建cg/at比率为60/40的病毒基因组所设计的核酸分子的构建。这类基因组的核酸分子构建块将始终保持c和g多于a和t。在此情况下，可能需要添加c和g的反应多于a和t。举例来说，碱基添加顺序可为重复atcgcatgcg。因此，本发明另外包括经调整以高效产生规定核酸分子的化学合成方法。在一个方面，这需要在化学合成期间以反映或紧密接近碱基在那些分子中的占有率的方式将碱基添加到核酸分子。本发明包括例如用于高保真度、微量产生核酸分子的方法。因此，本发明包括以如下参数产生核酸分子的方法：生成1×105至5×1012个核酸分子拷贝，其中碱基错掺的平均数在1/100个碱基至1/4,000个碱基之间。本发明包括具有表7中所陈述的参数的类似方法。在一些情况下，核酸分子的所有拷贝将在单个支撑物(例如，单个珠粒)上产生。在其它情况下，核酸分子的拷贝将在不止一个单个支撑物(例如，约两个至约20个、约三个至约20个、约四个至约20个、约五个至约20个、约六个至约20个、约三个至约10个等)上产生。对于核酸分子的拷贝数和碱基错掺数的目的，这些数目可表示为在单个支撑物上产生的核酸分子拷贝的函数或在合成操作中产生的核酸分子的所有拷贝的函数。举例来说，如果使用一个支撑物产生核酸分子的所有拷贝，那么可能以1/310个碱基的平均错误率产生1.0×1011个分子。作为第二个实例，如果使用两个支撑物产生相同核酸分子的拷贝，那么在一个支撑物上可能以1/300个碱基的平均错误率产生1.0×1011个分子并且在第二个支撑物上可能以1/320个碱基的平均错误率产生1.0×1011个分子。在此情况下，可能以1/310个碱基的平均错误率产生2.0×1011个分子。根据本发明制备和使用的核酸分子可含有经修饰的核酸分子，包括锁核酸(lna)、肽核酸(pna)等等。pna是聚酰胺类型的dna类似物，并且单体单元a、g、t、u和c是可商购的。此外，本发明的核酸分子可包含一个或多个选自包括(但不限于)以下的群组的修饰碱基：5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-d-半乳糖基q核苷、肌苷、n6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、n6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-d-甘露糖基q核苷、5′-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-n6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸、wvbutoxosine、假尿嘧啶、q核苷、肌苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-n-2-羧丙基)尿嘧啶和2，6-二氨基嘌呤。后面的修饰碱基可在与dt碱基配对时形成三个氢键并且可使短核酸分子的tm升高多达1-2℃/插入。然而，此效应是复杂的并且取决于序列环境。2-氨基嘌呤可取代核酸分子中的da。它是对局部环境敏感的天然荧光碱基，使得它成为用于监测dna发夹的结构和动力学以及用于检测双螺旋体的碱基堆叠状态的有用探针。2-氨基嘌呤可为不稳定的并且使tm略微降低。5-溴-脱氧尿苷是一种光反应性卤代碱基，其可掺入到核酸分子中，使得所述核酸分子在曝露于uv光的情况下与dna、rna或蛋白质交联。可在核酸分子的3′-端掺入其它修饰碱基(如反向dt)，产生抑制利用3′核酸外切酶降解和利用dna聚合酶延伸的3′-3′键。在本发明的另一个实施例中，反向二脱氧-t可置于核酸分子的5′端以防止不需要的5′连接。可使用二脱氧-c(ddc)3′链终止剂防止利用dna聚合酶3′延伸。5-甲基脱氧-c在取代dc时将使tm升高多达0.5℃/插入。在一个实施例中，可使用天然存在的碱基脱氧-肌苷，其没有涉及四个标准碱基的错配那么不稳定。因此，本发明在某种程度上提供与具有新颖特性和/或功能的经修饰的核酸分子的合成相关的组合物和方法。一种板格式的修改，即图2和2b中所示，是针对孔使用“液体覆盖物”。可进行此修改的一种方式是使得孔含有双层。举例来说，含有固体支撑物的孔底部可含有ega。其上方可为较低密度、任选地不可混溶的流体。较低密度流体层将防止或阻止酸扩散离开所期望的孔并且跨越到非所期望的孔。另外，较低密度流体可经定位以与上部电极进行传导接触。可商购的“液体盖片”的一个实例是由ventanamedicalsystems，inc出售(目录号650-010)。此产物是作为水性试剂与空气之间的屏障使用的溶液，其预防蒸发并且被设计成向如免疫组织化学和原位杂交反应等应用提供稳定水性环境。实践本发明方法的一种示例性方案如下。将具有1微米均一直径的经硅烷涂布的多孔磁珠(myonebeads，dynal)通过受控或脉冲流动添加到芯片表面，以确保珠粒均一分布遍及芯片上的微孔(约1.3μm直径)并且确保最大数目的孔装载有一个珠粒。不含珠粒的孔是通过说明空孔和含有导电磁珠的孔当中的电阻差的合成前电流检查来鉴别。多种化学物质是珠粒表面的制备中可能存在的。举例来说，可产生多层硅烷以赋予珠粒更大的功能性表面区域。制备硅烷涂层，使得存在羟基官能团的稳定附接；通常通过使用初始酰胺合成步骤而经由硅烷核心的三甲氧基或三乙氧基硅烷连接基团偶合到裸二氧化硅珠粒表面以暴露伯羟基。针对平面阵列表面电极所开发的用于dna合成的起始和偶合的基础化学可见于maurer等人，电化学生成酸和其容放于100微米反应区域用于产生dna微阵列，《公共科学图书馆期刊》1(1)：e34.doi：10.1371/journal.pone.0000034(2006)。芯片的制造：在合成、试剂添加和解封闭条件下，在针对高电导率和化学稳定性所选的经氧化的高电阻率硅上产生至多50nm厚的电极材料，如铱金属。电极通过超声波粘合连接到印刷电路板，提供数控模拟集成开关电路激活针对给定孔解封闭所选的电极。印刷电路板仔细对准并且粘合于规则微孔结构以生成合成芯片。为试剂和通用互补性电路电极提供内部容积并且密封的盖板粘合在微孔结构上表面的周边和上方以完成封闭的合成芯片。常规半导体或聚合物材料可用于形成孔200。举例来说，cmos技术可用于在如sio或sio2等半导体材料中形成具有所期望的形状或大小的孔。依据所期望的应用而定，电极202可与孔200一起制造或单独制造。核酸合成(例如，dna合成)试剂施用到芯片可通过多种方式进行。举例来说，一旦珠粒装载到芯片中，计算系统控制一系列试剂添加并且可进行洗涤以影响驻留在芯片微孔中的珠粒表面上的亚磷酰胺dna合成。可采用如下处理器可执行指令，其针对任何给定dna序列群体，确定dna合成试剂添加的最优排序、相对于试剂的体积/成本的试剂添加和洗涤步骤的顺序以及合成运行时间。此外，如上文所提及，控制电流到芯片上的特定孔的控制器或处理器决定在那些孔中可产生电化学生成酸并且脱保护以激活孔中珠粒上生长的核酸分子，其可经化学制备以偶合添加到反应容器中的下一个酰胺碱基。用于施用合成试剂和确保精确受控流体施用量的设备和组件的多种特定配置可能通过优化的开发过程实现。使用ega影响脱保护的亚磷酰胺dna合成步骤、条件和试剂可见于例如maurer等人，电化学生成酸和其容放于100微米反应区域用于产生dna微阵列，《公共科学图书馆期刊》1(1)：e34.doi：10.1371/journal.pone.0000034(2006)以及egeland和southern，用于dna微阵列制造的寡核苷酸的电化学引导合成(electrochemicallydirectedsynthesisofoligonucleotidesfordnamicroarrayfabrication)，《核酸研究(nucleicacidsresearch)》，33(14)：e125(2005)中。虽然在许多情况下可使用亚磷酰胺合成化学以及其变化形式产生寡核苷酸，但是其它方法也可用于产生寡核苷酸，包括pcr、限制酶消化、核酸外切酶处理或使用核苷酸转移酶的模板非依赖性合成。使用核苷酸转移酶的模板非依赖性合成的示例性方法陈述在美国专利第8,808,989号中。使用核苷酸转移酶(例如，末端脱氧核苷酸转移酶)掺入具有未经修饰的3′羟基和可裂解保护基的核苷酸类似物。合成在每个新碱基的添加下由于保护基而停顿，随即保护基裂解，离开聚核苷酸，这与天然存在的核苷酸基本上相同(即，被酶识别为用于其它核苷酸添加的底物)。因此，在某些实施例中，本发明包括通过酶反应产生寡核苷酸的方法。适合与酶促寡核苷酸合成方法一起使用的三磷酸核苷酸(例如，三磷酸脱氧核苷酸)(ntp)将具有防止ntp不被核苷酸转移酶作为底物使用并且可高效去除以允许添加到寡核苷酸链的保护基。因此，在某些实施例中，本发明包括经由酶反应进行核苷酸添加的方法。在许多情况下，ega将作为脱保护方法的一部分而生成。另外，在某些情况下，可在水溶液中全部或部分寡核苷酸合成反应。本发明的一个方面是控制反应环境的ph值的能力。然而，在某些实施例中，可由于存在强酸(如ega或pga)而发生dna降解。已知酸强度(其可由pka值表示)对脱嘌呤率具有以下效应：pka越低(酸性越大)，通过脱嘌呤的dna降解越显著。这在比较例如三氯乙酸(tca)和二氯乙酸(dca)时可变得明显。tca和dca都用于dna合成，但是3％tca(pka＝0.7)的脱嘌呤率比3％dca(pka＝1.5)的脱嘌呤率高约四倍。如本文所公开，添加合适分子充当质子载体可通过接收来自ega或pga的质子，借此升高溶液的pka值而减小dna降解的效应。可使用任何可接受的质子载体，包括pka范围介于约0至约3的每一种电化学稳定化合物。根据某些实施例，质子载体可为选自2-氯-6-甲基吡啶、二苯胺、2，2′，2′-次氮基三乙腈、哒嗪、脲和孔雀绿中的至少一种化合物。在反应位点，质子在最优酸强度(pka)下从质子载体释放。这使得dna脱嘌呤减少，并且因此提高核酸分子合成的数量和/或质量。由于极弱酸可导致脱保护时间长，所以根据本文所公开的某些实施例，质子载体的pka可为约1。举例来说，2-氯-6-甲基吡啶的pka值为约0.72，并且二苯胺的pka值为约0.78。作为其它实例，2，2′，2′-次氮基三乙腈的pka值为约1.1，哒嗪的pka值为约2.1，脲的pka值为约0.2并且孔雀绿的pka值为约1.0。在某些实施例中，质子载体(如2-氯-6-甲基吡啶)的添加例如可使dna降解减少至少约15％、至少约20％或至少约25％。使用上文所公开的质子载剂可得到有成本效益的简单方法，以增强基于ega和/或基于pga的方法的质量和数量。在本发明的某些实施例中，核酸分子或其一部分可在合成之前经历序列优化方法。用于序列修饰的不同计算方法是所属领域中已知的并且可用于在1)高效组装和/或2)提高在给定宿主中的性能方面优化给定核苷酸序列。为了设计适于最优组装的核苷酸序列，全长序列可借助于演算法考虑以下参数分解为具有最优杂交特性的限定数目的较小片段，所述参数如解链温度、重叠区、自身杂交、不存在或存在克隆位点等等。在本发明的某些方面，所期望的核酸序列的至少一部分可编码多肽或蛋白质。在此类情况下，可能需要优化开放阅读框以提高在给定同源或异源宿主中的性能，如表达产量或溶解度。基因表达增加可例如通过由优选密码子置换非优选或较不优选的密码子或通过增加开放阅读框中cpg二核苷酸的数目来实现，如例如美国专利第5,786,464号和第6,114,148号以及美国专利公开第2009/0324546aa号中所述，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一个特定实施例中，经优化的开放阅读框可与演算法组合以将秘密消息加密到开放阅读框中，如美国专利公开第2011/0119778aa号中所述。这类消息可允许鉴别或追踪某些合成核酸分子。在本发明的某些方面，可能需要使用同时考虑多个不同参数(包括组装以及表达相关的序列特性)的优化策略。可在本发明中用于优化序列设计的全面多参数方法的一个实例是美国专利公开第2007/0141557aa号中所描述的技术，所述专利公开内容以引用的方式并入本文中。因此，本发明在部分方面提供了用于包括组装和表达策略等下游应用的最优序列设计。模块2在模块1上完成合成运行之后，可在模块2中对支撑物缔合(例如，珠粒缔合)的核酸分子进行后处理。在模块2中进行的方法可在适当时手动或通过计算机指导的自动化控制以下步骤来进行，如从合成微孔阵列拾取珠粒(例如，磁性珠粒)并汇集以及气相裂解和脱保护以制备用于后续组装步骤的核酸分子。为了暴露珠粒附接的核酸分子的微孔阵列，可去除合成孔的覆盖物(当存在时)。在一个实施例中，覆盖物是以计算机控制方式由自动装置去除。依据应用和有待组装的核酸分子数目而定，可汇集微孔阵列的所有珠粒或仅珠粒的子集。当仅汇集珠粒的子集时或当珠粒的总数受到限制时，所汇集的珠粒数目可大幅变化并且包括约10至约50个、约50至约100个、约100至约1000个、约50至约10,000个、约100至约10,000个或约500至约10,000个单独的珠粒。这些珠粒可存放在任何合适的容器中。一个容器实例是微孔板的孔(例如，1536微孔板的孔)。a.磁性汇集机制在使用磁性珠粒的情况下，包含例如精密受控电微磁体的珠粒拾取仪器可经编程和控制以便提取和汇集含有合成的核酸分子的个别珠粒。适合用于本发明的自动化包括精密受控电微磁体拾取第一珠粒并且将其存放到汇集孔(即，含有多个珠粒以便收集试图组合使用的核酸分子的孔)中。或者，可如下使用精密受控电微磁体，其拾取第一珠粒并且随后沿x-y方向移动到下一位置，沿z方向下降以拾取第二珠粒，沿z方向向上倒退以离开磁场范围，沿x-y方向移动到第三个孔等。因此，磁体保持“启用”，拾取珠粒的集合(例如，约两个至约五十个、约十个至约五十个、约两个至约一百个、约十个至约一百个、约二十个至约八十个等)并且以珠粒串形式携带。随着珠粒集合的收集，此集合随后同时存放到汇集孔中。当然，可收集珠粒的多个集合并且存放在单个汇集孔中。在一些情况下，可使用如例如美国专利公开第2008/0281466aa号或第2008/0113361aa号或美国专利第6,887,431号、第7,347,975号或第7,384,606号中所述的系统提取珠粒并汇集，它们的公开内容以引用的方式并入本文中。在本发明的其它实施例中，可使用具有至少一个集成式精密受控电微磁体的珠粒拾取仪器。这类拾取仪器可由控制单元控制，所述控制单元可经编程以控制微磁体的移动以便对准特定微孔。在另一个实施例中，控制单元可提供控制微磁体与微孔之间的距离调节的装置。在一特定实施例中，微磁体可由电装置控制和激活，使得可提取携载特定核酸序列的单个磁性珠粒。在使用磁珠的本发明的方面中所用的电微磁体可为中空磁体或针状磁体，并且将通常具有使磁场集中在其尖端以允许特定靶向个别珠粒的大小和尺寸。在一特定实施例中，微磁体可由电磁体和永久磁体构成，其中永久磁体的活动性可由电磁体控制。结合本发明使用的电微磁体可为任意数目或格式并且可例如包含单个磁体或连同其它微磁体排成一行。在本发明的某些实施例中，电微磁体可用于提取和汇集单个阵列的微孔中所含的所有磁珠。出于此目的，电微磁体可分配到每个微孔以便以预定义或随机次序以逐步方式提取珠粒附接的核酸分子。在一个实施例中，全长构建体的组装所需的所有核酸分子可在单个阵列上合成。根据构建全长构建体所需的核酸分子的量，可使用不同大小和尺寸的阵列。在另一个实施例中，电微磁体可经编程以靶向特定阵列的仅一部分微孔，从而提取和汇集预定选择的珠粒附接的核酸分子。电微磁体可经编程以从两个或更多个不同板的微孔提取和汇集珠粒。拾取可将第一板的所有珠粒的全部提取与从第二板获得的一部分珠粒的选择性提取组合。第一和第二板可在大小和尺寸方面不同。通过微磁体提取的每个磁珠可随后由拾取仪器的可移动装置转移到汇集台。在一个实施例中，汇集台可含有腔室与微孔板。在一个实施例中，微孔板可为1536微孔板。然而，其它大小和尺寸的微孔板(例如，标准96孔板)是所属领域中已知的并且可用于本发明。所定义部分的核酸分子可汇集在微孔板的个别孔中，其中一个汇集的部分含有组装全长构建体的至少一个所定义片段所需的所有核酸分子。在一个实施例中，个别核酸分子池可含有组装全长构建体所需的所有核酸分子。分配到每个孔的不同核酸分子池可使用安置在微孔板上的机器可读标识符进一步鉴别。b.非磁性汇集机制静电力也可用于从合成平台移出珠粒和其它衬底。出于说明目的使用图2a和2b，寡核苷酸合成衬底(在此情况下，珠粒)可带静电并且从使用相反电荷与表面或孔的缔合分离。举例来说，如果图2a和2b中所示的一个或多个珠粒具有正电荷，那么下部电极可用于生成正电荷以排斥珠粒并且迫使其离开孔。磁荷也可用于达成相同目的。还可采用剩磁。本质上，剩磁是在暴露于磁力之后材料中保留的磁性。在许多情况下，磁性衬底将具有小尺寸。因此，这类衬底的引力将通常不需要强磁场。剩磁可存在于衬底、用于结合到衬底的选择探针或这两者中。另外，电荷可用于从合成平台选择性移出合成衬底的子集。可易于计算出用于从合成平台移出珠粒和其它衬底的静电力。下表8假定存在相对均匀的电场并且每个珠粒充当单个电荷点。核酸分子本身携载电荷，这在使用电荷从孔中挤出珠粒时应被考虑到。另外，电荷仅需要施加到所含衬底具所期望的核酸分子(例如，用于组装成较大核酸分子的核酸分子)的孔。表8在另一个实施例中，合成平台可含有一系列区，其与合成平台的其它区分开。举例来说，合成平台可含有呈方形10×10排列的100行合成区域。另外，合成平台可经设计以使其可分成十行的十个合成区域。出于说明的目的，假定有人试图产生八种不同的经组装的核酸分子并且这些经组装的核酸分子被设计成由以下数目的寡核苷酸组装形成：表9经组装的核酸编号寡核苷酸的数目行号经组装的分子编号寡核苷酸的数目行号17159528261063837137-84948159-10表9指出各种经组装的核酸分子的数字标号、将用于组装经组装的核酸分子的寡核苷酸数目以及合成寡核苷酸的行。在此实施例中，行1-5将各自具有至少一个将不产生寡核苷酸的合成区域。在合成结束之后，可将可分开的行分开并且收集/处理和组装所合成的核酸分子，如本文别处所述。在另一个方面，电解可用于从合成平台移出珠粒或其它衬底。图18示出了根据本发明教示使用电解从合成芯片1805选择性珠粒移出方法的简化实例。举例来说，合成芯片1805可为cmos芯片并且可含有多个微孔，如微孔1810。每个微孔还含有在微孔底表面处形成的第一电极1815(工作电极)和第二电极1820(反电极)。每个微孔大小设定成容纳固体衬底(如珠粒1825)和一定体积的工作流体。举例来说，电极1815和1820可类似于下文相对于图9和表11所进一步论述的电极并且可由多种化合物构成，包括铂、钯、铜、金、铝、铌、氧化铌、钨、钛、钽、钼、镍、铂、银、锰、钕、碳和硅，以及含有一种或多种上述元素以及其它元素的合金材料或化合物材料。在电极1815(工作电极)与电极1820(反电极)之间由控制器(未示出)提供足够高的电位差以使得电流在微孔的流体中流动并且产生电化学反应(例如，电解)，从而在微孔中形成一个或多个气泡。举例来说，如果流体是水，那么可施加约0.01v至约10,000v、5v至约30v、或约10v至约20v、或约15v至约30v电压以产生电化学反应。随着一个或多个气泡膨胀并且向微孔1810的表面移动，珠粒1825也将会上升。因此，微孔1810中流体的体积移置并且珠粒1825例如沿着由图18中箭头所指示的方向从微孔1810释放到流体通道(未示出)中。电流控制器，其可以是相对于图2a和2b所论述的电流控制器，可用于控制施加到每个电极的电流量，继而可控制珠粒从其相应孔的移置。电流增加超过电流阈值可在珠粒移出方法和/或每个孔内的流体加热期间导致珠粒的潜在损失。举例来说，一个电极的电流上限可乘以有源电极的数目以得到总电流上限，其可由电流控制器设定。气泡的生成一般快速地发生，通常珠粒由于一个或多个气泡的上升而移置耗时不到一秒(虽然可使用更长时间)，并且不取决于珠粒的表面电荷或其它特性。如本文中所指出，微孔板中气泡的生成可用作从相应孔移出珠粒的方法。气泡可以电化学方式在水性或非水性缓冲液中(例如，水、nacl水溶液以及更复杂的非水性缓冲液，如10mlmeoh；35mlacn；1m氢醌；10mm苯醌；0.25mnet4ptso)产生。所用缓冲液的固有特性可对系统的效率或性能具有显著影响。举例来说，缓冲液的组成可影响所产生气泡的表面张力。表面张力是孔中气泡移动的关键(保留势能)。为了从孔中高效移出珠粒，需要使珠粒和气泡都从孔排出(与气泡残留在孔中并且干扰系统的流体流动相比)。如果表面张力过低，那么生成的气泡将通过孔与珠粒之间的间隙排出而无法提升珠粒。然而，如果表面张力过高，那么气泡将紧紧地粘附到孔壁，这可能需要额外处理以去除气泡，如较长时间冲洗或用低表面张力溶剂(例如甲醇)冲洗。另外，高表面张力也可能导致珠粒粘附于气泡而不释放到流体流中。有利的表面张力可通过混合有机溶剂(例如，乙腈、异丙醇)和水溶液而获得，优选50-90％有机溶剂、更优选地60-70％有机溶剂。还可选择缓冲液以避免对合成方法的负面影响。举例来说，酸性环境有可能损坏新生寡核苷酸链，并且碱性条件可能促使寡核苷酸从珠粒提前裂解。因此，缓冲系统可用于避免生成这类不期望的条件。虽然可利用不同缓冲系统(例如，hepes、tris、碳酸盐或基于铵的缓冲液)，但是挥发性缓冲液(例如，硫酸铵)优选地用于所述应用以避免可负面影响其它反应步骤的不期望的残余物。在某些情况下，提升缓冲液可包含水、对甲苯磺酸四乙铵(net4ptso)、乙腈和甲醇。在一示例性实施例中，可使用包含0.7m(net4ptso)、50％水、30％甲醇和20％乙腈的提升缓冲液。此缓冲液具有电化学生成气泡所需的高电导率，同时其表面张力允许高效珠粒提升和从孔去除气泡。使用此缓冲液，可在＞4.5v的电位下实现珠粒提升。在某些实施例中，可使用较高电位以获得最优珠粒提升。举例来说，可使用8.5v而不限制电流。在典型实验中，可针对大致3,500个孔观测到20-60ma的电流。在某些实施例中，从多孔板移置一个或多个珠粒是由计算机指导的自动化控制和程序化。举例来说，当合成芯片1805被形成为cmos芯片时，在微孔底部所形成的每个工作电极是可个别寻址的，其使得控制器可在给定时间给一个或多个工作电极选择性供电。因此，一个或多个珠粒可同时或在大致相同时间从其相应微孔移置以便随后收集用于进一步处理和分析。举例来说，合成芯片1805可具有多个微孔，每个微孔具有相关联的工作电极。如上文所论述，多孔板中的孔数也可能大幅变化并且受以下因素限制，如有待产生的核酸量、技术因素(如可制造性)和与用途相关的机械因素(例如，磁性珠粒提取器的大小下限)。微孔中的流体，如上文相对于ega组分的组成和浓度所进一步论述，可包括水性或非水性缓冲溶液。举例来说，流体可包括相对简单的溶液，如水、nacl水溶液以及更复杂的非水性缓冲液，如10ml甲醇；35ml乙腈；1m氢醌；10mm苯醌；0.25mnet4ptso)。一旦珠粒或其它衬底从其相应微孔被移置，可通过珠粒收集装置收集珠粒或其它衬底，所述珠粒收集装置可经编程和控制以提取和汇集含有合成的核酸分子的个别珠粒。依据应用和有待组装的核酸分子数目而定，可汇集微孔阵列的所有珠粒或仅珠粒的子集。举例来说，珠粒或其它衬底可通过珠粒收集装置1905(如图19中所示并且在图20中更详细地示出)收集，并且放置到多孔板1910或其它合适容器中用于进一步处理和分析。以此方式，珠粒收集装置可用于将一个或多个珠粒或其它固体支撑物从合成芯片以自动化方式转移到多孔收集板或其它合适容器的一个或多个孔中用于进一步处理。另外，珠粒收集装置可用于将具有类似大小和尺寸的珠粒或其它衬底(例如小泡或细胞)浓缩成较小体积。珠粒收集装置1905可包括第一流动通道1915，其可经操作以使珠粒1825和相关联流体沿第一方向(例如，向下)流动，从而被置于多孔板1910或其它合适容器的孔中。举例来说，由于重力，珠粒可落入多孔板1910的所选孔中并且被收集。珠粒收集装置1905还可包括第二流动通道1920，其可经操作以使流体(例如，废弃流体)沿与第一方向相反的第二方向(例如，向上)流动到可被丢弃的地方。泵1925(例如注射泵)和相关联管道1930可用于提供足以致使流体流过第二流动通道1920的负压(例如真空)。第二流动通道1920可装备有屏障或导柱以防止珠粒进入第二流动通道。以此方式，珠粒收集装置可用于从合成平台收集和汇集具有属于一个片段的核酸分子的所有珠粒。在适当时，汇集的珠粒可转移到多孔板或其它合适容器的一个或多个孔中用于进一步处理(如裂解和脱保护)以制备用于后续组装步骤的核酸分子。多孔板1910的每个微孔可大小设定成容纳一个或多个珠粒。在一个实例中，多孔板1910可由可移动的支撑结构1930(例如xyz工作台)支撑，其可经操作以在至多三个自由度致动。这可使得由珠粒收集装置收集的珠粒1825转移到多孔板1910上的特定微孔中。或者，珠粒收集装置1905可安装在可移动的支撑结构上，所述可移动的支撑结构可使得珠粒收集装置1905以至多三个自由度致动。这种使用珠粒收集装置将珠粒或其它衬底转移到微孔板中的方法可手动或通过计算机指导的自动化进行。在某些实施例中，珠粒收集装置1905可包括声学模块和相关联的供电和控制电路(未示出)，其可经操作以振动整个珠粒收集装置1905或选择性振动第一和/或第二流动通道1915、1920以促进珠粒1825安置或流体去除。珠粒收集装置1905还可包括检测器(未示出)，其可经操作以检测寡聚珠粒1825是否已从珠粒收集装置1905移出。在一个实施例中，其中放置珠粒的多孔板包括流体渗透结构以便于珠粒安置到多孔板中和珠粒浓缩成较小微孔体积。图21示出了根据本发明教示的另一个实例多孔板2105。多孔板2105可包括可永久性或非永久性附接到多孔板2105的顶表面的流体渗透结构2110(例如，微目筛)。流体渗透结构2110可由渗透流体并仍提供足以使一个或多个寡聚珠粒固持在给定孔内的硬度的材料构成。多孔板2105还可由通过流体渗透结构2110分隔开的两个多孔板构成。在一个实例中，如所属领域中所已知，多孔板是标准1536孔板。在图21的实例中，珠粒收集装置，类似于如图19中所示的珠粒收集装置1905，可包括针或针状结构2115和相关联管道2120以将一个或多个珠粒置于多孔板2105的一个或多个孔中以及从多孔板2105去除过量流体。针2115可耦合到可移动的支撑结构(例如，xyz工作台)以便以一个或多个自由度移动针2115，从而将珠粒放置在多孔板2105的适当孔中。针2115还可具有针中针或管中针排列，使得第一针定位在第二针内部或管道2120内部。或者，第一针可定位成邻近于/平行于第二针或管道2120。举例来说，第一针可经操作以将珠粒递送到多孔板2105并且第二针或管道可经操作以从多孔板2105去除过量流体。在这类设置中，第一针的长度超过第二针或管道的长度，使得在操作中仅第一针与流体渗透膜和流体渗透膜与孔底部之间所含的液体体积接触，而第二针或管道与流体渗透膜与孔顶部之间所含的液体体积接触。另外，第一和第二针的形状可相同或可不同。举例来说，第一针可具有能够穿刺过流体渗透结构2110的尖锐或尖利端，而第二针或管道可具有钝端。此外，第一针的管腔可等于或小于第二针或管道的管腔。第一针的管腔尺寸应使得具有如本文别处所公开的大小并且任选地负载有寡核苷酸的一个或多个珠粒能够流畅地通过它进入孔中，而第二针或管道的管腔尺寸应使得过量液体能够通过真空从孔中去除。可利用由规格号所描述的广泛多种外径的针，其中规格号越小指示外径越大。针的内径取决于规格和壁厚。出于说明目的，第一针可以是例如具有路厄锁(luer-lock)和25或26规格的注射器，而第二针可以是具有路厄锁和17规格、18规格或19规格的钝器。在操作中，针2115可穿刺过流体渗透结构2110并且已从合成芯片1805移出的珠粒可转移到多孔板2105中。珠粒由于流体渗透结构2110而无法离开多孔板2105的孔，而过量流体可以离开并且通过真空而经由第二针或管道去除。这种排列可减少孔之间的交叉污染。如果需要的话，那么可现在洗涤针2115并且准备用于接下来的寡聚珠粒输送。在将所有珠粒放置到多孔板2105之后，可进行离心步骤以确保珠粒在孔底部。保持流体渗透结构2110在多孔板2105的顶部还可有助于附接到珠粒的核酸分子的气态脱保护。在脱保护之后，可打开多孔板2105并且具有经裂解/脱保护的核酸分子的底板准备用于基因组装反应。在其它实施例中，并非使用针穿刺流体渗透结构，而是将压力施加于多孔收集板中所选孔的顶部，所述压力足以破裂流体渗透结构并且将一个或多个珠粒递送到多孔收集板的所选孔中。在某些实施例中，为了破裂流体渗透结构所施加的压力在0.1-50、0.1-25、0.1-20、0.1-15、0.1-10、1-25、1-20、1-15或1-10巴之间。在其它实施例中，在微芯片上合成的寡核苷酸可在排列于多孔收集板的顶表面上或多孔收集板内的流体渗透结构上汇集、浓缩、裂解并且脱保护。裂解的寡核苷酸可随后洗脱到多孔收集板的孔中而不必穿刺或以其它方式破裂流体渗透结构。图22示出了一种示例性系统，通过它从合成微芯片收集珠粒并且在排列于多孔收集板的顶表面上或多孔收集板内的流体渗透结构上汇集。根据本发明，虽然珠粒保留在流体渗透结构上，但是珠粒上的寡核苷酸被裂解、脱保护和洗脱到微孔收集板的孔中。根据本文所论述的各种机制，珠粒2215可从合成芯片2205移出并且如在(1)处所示，收集、汇集并且浓缩到多孔板2220的个别孔2225中。可施加真空2230以将珠粒2215经由流体导管2210的一端引导到多孔板2220的孔2225中。如上文相对于图21所论述，多孔板2220可包括排列在多孔板2220的顶表面上或内部的流体渗透结构2230。流体导管2210可将珠粒2215安置到流体渗透结构2230的顶表面上。可使用例如氨气气氛2240使寡核苷酸从珠粒2215裂解并且脱保护，如在(2)处所示。一旦寡核苷酸从珠粒2215裂解并且脱保护，它们可洗脱2245穿过流体渗透结构2230并且收集在多孔板2220的孔底部，如在(3)处所示。多孔收集板2220的框架可由任何合适的材料构成，包括(但不限于)聚苯乙烯、聚乙烯(“pe”)或聚丙烯(“pp”)材料或环烯烃共聚物(“coc”)、不锈钢、聚四氟乙烯(“ptfe”)或聚碳酸酯，并且可以是溶剂可相容的。多孔收集板2220可在顶表面上由流体渗透结构2230覆盖。流体渗透结构2230可由任何合适的材料构成，包括(但不限于)聚对苯二甲酸乙二酯(“pet”)、聚四氟乙烯(“ptfe”)、聚丙烯(“pp”)或聚醚醚酮(“peek”)材料，所述材料是可渗透流体和气体的，但是能够将珠粒固持在孔2225内。举例来说，流体渗透结构可以是聚丙烯目筛。目筛可以如图45b中所指示放置在两个多孔板之间。为了避免液体(和洗脱的寡核苷酸)在相邻孔之间侧流和/或将目筛固定在多孔板内，可对目筛进行热处理(例如在加热板上)以沿着上部和/或下部多孔板的孔突出部分的轮缘熔融材料并密封。可通过向上部和/或下部多孔板的外表面施加压力而推进密封方法。在一个实施例中，珠粒收集装置可包含如上文所论述的具有流体渗透结构的多孔板(“过滤板”)和如图45a中所示的同轴针组装件。针组装件确保将珠粒快速汇集到过滤板的一个或多个孔中。针或针状结构可与管道相关联以便将一个或多个珠粒放置在过滤板的一个或多个孔中。针可被耦合到可移动的支撑结构(例如，xyz工作台)以便以一个或多个自由度移动针，从而将珠粒放置在过滤板的适当孔中。针还可具有针中针或管中针排列，使得第一针定位在第二针内部或管道内部。或者，第一针可定位成邻近于/平行于第二针或管道。举例来说，第一针可经操作以将珠粒递送到过滤板并且第二针或管道可经操作以提供洗涤和/或洗脱缓冲液，以便冲洗过滤板中所收集的珠粒和/或洗脱寡核苷酸穿过目筛。针组装件可被配置成允许同时汇集和洗涤珠粒。用于通过电解卸载珠粒的化学溶液优选地含有高浓度的盐以获得高电导率。在核酸分子从珠粒裂解和洗脱之前，需要通过用合适缓冲液(例如50％乙腈、50％水)洗涤而去除盐。可通过使用例如针中针配置实现同时洗涤，其中第一针与微流体芯片连接并且被配置成接受珠粒并将珠粒放置到微孔板的预定孔中。第二针可与一个或多个含有洗涤和/或洗脱试剂的储槽连接并且可被配置成将来自储槽的液体转移到含有汇集的珠粒的孔中。一旦寡核苷酸如本文别处所述已从珠粒裂解并且脱保护，它们就可从过滤板洗脱穿过流体渗透目筛到排列在过滤板下方的另一个多孔板中，如图45c所示。出于此目的，过滤板可以从第一洗涤/清洗位置移动(例如，借助于xyz工作台)到第二洗脱位置。其它多孔板可包含大小和尺寸允许过滤板的孔与其它多孔板的孔对准的孔，使得寡核苷酸可同时或相继从过滤板的多个孔洗脱到所对准的其它多孔板的多个孔中。在某些情况下，下部过滤板的突出部分可配合到其它多孔板的孔的突出部分中。在其它情况下，两块板的突出部分可精确对准并且彼此接触放置。寡核苷酸可以通过离心力或真空洗脱。举例来说，过滤板和其它微孔板可在离心或真空步骤期间被排列在将两块板固持在一起的固定装置或框架中。多孔收集板、过滤板或其它多孔板可包含任何适当数目的孔。最常见的多孔板具有96、384或1536个孔。在某些实施例中，多孔收集板具有1536个孔。1536孔板中每个孔的体积为约12μl，其中工作体积为约3-10μl。多孔收集板的每个孔可容纳来自合成芯片的一个或多个珠粒。举例来说，在某些实施例中，多孔收集板的每个孔包含1-1，000、1-500、1-350、1-250、1-100、1-50、100-1,000、100-500、100-350、100-250、250-500、250-350或约330个从合成芯片转移的珠粒。另外，珠粒可占据孔的特定体积。举例来说，对于1536孔板，珠粒可占据总孔体积的至多约90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、1％、0.5％、0.1％或0.05％。在一个实施例中，珠粒占据总孔体积的约0.1％。其它方法也可用于收集和汇集核酸合成衬底，包括(1)“抓取”，例如通过使用基于机械(例如，实际抓取)、光学、声波、磁性原理操作的类似镊子的装置，(2)通过如化学溶解或经由使用激光的方法“破坏”核酸合成衬底周围的结构，(3)通过例如使用热能、静电能、磁能、流体能移动核酸合成衬底，(4)混合型夹持器，其组合例如(a)磁性和流体冲洗、(b)磁性和压电方法以及(c)静电提升和流体冲洗，(5)使用例如合成衬底上的调制型永久磁体、外部线圈、平面线圈等进行磁性固定/收集，(6)静电提升和收集，以及(7)通量方向(例如，将流体添加到孔底部以提升衬底)。另外或替代地，可使用其它非磁性技术将珠粒从合成芯片移出，包括(但不限于)重力进料、介电泳、阀调或在合成微芯片上使用堰结构。举例来说，如果珠粒含有介电材料，那么可使用例如合成微芯片的电极生成不均匀电场，以产生可用于将珠粒从合成微芯片上其相应的孔选择性移出的力(介电泳)。作为又一个实例，合成微芯片可包括阀调、堰或类似屏障的结构，其可用于将所移出的珠粒的流动更改成特定方向，以便将珠粒引导到多孔收集板的特定孔中。c.核酸的电化学生成碱裂解在本文所公开的某些实施例中，合成的核酸分子可直接从微芯片中的珠粒或其它合适的固体支撑物裂解并洗脱到合适容器(如多孔板)中。在某些实施例中，可如本文所述使用电化学生成碱(egb)从一个或多个珠粒裂解核酸分子。属于相同片段的核酸分子可在如本文所述的这一阶段汇集在一起。如本文所述，在裂解之后，可例如使用逆相材料或任何其它合适的树脂进行浓缩步骤。在本文所公开的某些实施例中，可使用egb直接从微芯片孔中的珠粒或其它合适的固体支撑物裂解合成的核酸分子。在第一步骤中，根据本文所公开的方法合成受保护的核酸分子并且经由碱可裂解的连接基团(如丁二酸酯基)偶合到珠粒。如本文所用，碱可裂解的连接基团可定义为能够通过碱催化的反应从固体支撑物裂解的任何连接基团。如本文所公开，核酸分子是在包含至少一个电极(如铂电极)的微芯片中的珠粒或其它固体支撑物上合成的。接着，如偶氮甲烷等化合物可在至少一个电极上化学还原产生egb。可在至少一个电极上化学还原产生ebg的其它化合物包括例如偶氮苯、蒽醌、芳香族卤化物(其中卤化物是碘或溴)和二硫化碳。egb随后用以从珠粒或其它合适的固体支撑物裂解合成的核酸分子。由于egb仅在激活的电极上生成，所以可实现所期望的核酸分子的位点选择性裂解。电极的激活致使用碱可裂解的连接基团连接到珠粒的核酸分子裂解，并且裂解可以高度选择性方式进行，使得仅选择并激活的电极使核酸分子裂解。裂解的核酸分子于是游离在溶液中并可用于进一步处理。图25示出了其中核酸分子经由碱可裂解的连接基团结合到珠粒的示例性反应。图25示出了用以使偶氮甲烷还原成碱(甲胺)的来自电极的电子。甲胺随后用以将核酸分子从珠粒裂解到溶液中。在某些示例性实施例中，可经由在约7.5v下激活电极约5分钟而由1m偶氮甲烷生成egb。d.核酸的光解裂解和还原性裂解在某些其它示例性实施例中，合成的核酸分子还可通过所属领域中已知的其它裂解方式从珠粒或其它固体支撑物裂解，如光解裂解和还原性裂解。在某些实施例中，裂解条件可以位点选择性方式，如在所选孔中和/或所选珠粒上生成。在某些示例性实施例中，通用连接基团(如unylinkertm)或预装载的碱基位于合成的核酸分子与可裂解的连接基团之间以防止所期望的核酸分子3′磷酸化。关于光解裂解，可用光波(如uv光波)辐照可光裂解连接基团。光波触发核酸分子从固体支撑物(例如，珠粒)裂解。在某些实施例中，可以使用光源实现空间控制，如镜装置，比如数字微镜装置。在某些示例性实施例中，光源照射所选合成位置(例如，孔和/或珠粒)，从而裂解所选核酸分子。图31示出了一个示例性实施例，其中可光裂解连接基团结合到珠粒和寡核苷酸。可提及的可光裂解连接基团的非限制性实例包括例如邻硝基苯甲基、二苯乙酮基、反式邻苯基丙烯酰基、间硝基苯基和苯甲基磺酰基。关于还原性裂解，可使用的连接基团可经由电化学还原化合物裂解。在一个例示性实施例中，可使用二硫化物连接基团，如图32中所示。当使用二硫化物连接基团时，举例来说并且如图32中所示，可以在所期望的合成位置上电化学还原2-羟乙基二硫化物以就地生成2-巯基乙醇。在某些实施例中，还原试剂(如2-羟乙基二硫化物)仅在所期望的激活电极上还原以使得裂解是定点的。所得一硫化物用以从二硫化物连接基团裂解所期望的寡核苷酸。e.使用固相材料富集核酸在某些实施例中，在裂解的核酸分子释放到溶液中之后，可能需要进行浓缩步骤。举例来说，在某些实施例中，可以浓缩裂解的核酸分子体积，使得体积可相容用于某些多孔板中以便如本文所论述汇集，包括例如20μl孔或1536微孔板(10μl孔)。关于富集裂解的核酸分子的数个示例性实施例是可行的。在本文所公开的某些实施例中，可使用固相材料吸附裂解的核酸分子，其中所述固相材料处在裂解步骤后的直流路径中，使得裂解的核酸分子流到固相材料，并接着到任选的洗涤步骤，随后是洗脱步骤，处于裂解、吸收、任选地洗涤和洗脱的循环中。或者，在某些其它示例性实施例中，固相材料可用于多孔板的多个位置中，使得裂解、吸收、任选的洗涤和洗脱步骤可并行地接连发生。这类并行的裂解、吸收和洗脱相对于循环裂解、吸收和洗脱可以是有利的，因为其在某些实施例中可更具时效性。可以通过所属领域中已知的任何方式吸附裂解的核酸分子。举例来说，在某些实施例中，可以通过逆相树脂材料吸附裂解的核酸分子。当使用逆相树脂材料浓缩已由egb裂解的寡核苷酸时，与egb的裂解反应可以在水溶液中，或在某些实施例中，包含少量至少一种有机溶剂(如20％乙腈)的水溶液中进行。随后，具有相对低浓度核酸分子的核酸分子溶液可以泵送经过少量逆相材料。如本文所用，逆相材料是指对疏水性化合物具有亲和力的疏水性材料，从而允许亲水性化合物洗脱在水溶液中。逆相材料可包括例如基于二氧化硅的逆相材料，如经c18修饰的二氧化硅或在某些实施例中，聚苯乙烯逆相材料。受保护的核酸分子将保留在逆相材料上，其可随后洗涤并例如用氮气和/或空气干燥。接着，受保护的核酸分子可以用包含至少一种用于从核酸分子去除保护基的试剂的有机溶液洗脱，如含甲胺的水/乙醇混合物。可使用任何额外的合适有机溶剂，包括例如乙腈、甲醇、四氢呋喃和异丙醇中的至少一种。在某些实施例中，核酸分子可以用80％乙腈洗脱。在某些实施例中，可以通过尺寸排阻材料，如交联葡聚糖凝胶(例如，)吸附裂解的核酸分子。裂解的核酸分子可以保留在尺寸排阻材料中且随后经由重力洗脱，如在离心机中。在本文所公开的某些其它实施例中，可以通过阴离子交换树脂吸附裂解的核酸分子。示例性阴离子交换树脂可以包括例如包含季铵基团作为离子交换基团的树脂，例如在基于苯乙烯的树脂(如交联聚苯乙烯)中或在丙烯酸树脂中。在某些实施例中，可在相对低的阴离子浓度(如约1mm)下进行吸附。在某些示例性实施例中，可使用1mmcl-离子。当使用阴离子交换树脂时，可以在相对高的阴离子浓度(如约1m)下洗脱裂解的核酸分子。在某些示例性实施例中，可使用1mcl-离子。在本文所公开的某些其它实施例中，可在二氧化硅珠粒上进行裂解核酸的吸附，如可从thermoscientific购得并且以二氧化硅珠粒dna凝胶提取试剂盒形式出售的那些二氧化硅珠粒。在此实施例中，裂解的核酸和至少一种离液盐在给定ph值下应用到二氧化硅固相。至少一种离液盐的存在使得裂解的核酸可以吸附于二氧化硅。在某些实施例中，可以进行任选的洗涤步骤，随后利用洗脱液从二氧化硅洗脱核酸。在某些实施例中，裂解的核酸可以在给定ph值(如酸性ph值)下吸附到二氧化硅，并随后随着洗脱液的ph梯度变化，例如升高到碱性更大的ph值而从二氧化硅洗脱。在某些实施例中，洗脱液可以是水或tris-edta缓冲液，如tris-乙酸edta缓冲液或tris-硼酸edta缓冲液。在某些实施例中，洗脱溶液的体积可以被选择成足够低以使得能够用部分收集器将所得溶液分配到多孔板(如1536微孔板)中。合成的核酸分子可以现在脱保护并且汇集在多孔板的孔中，优选地在0.1μl至25μl、0.1μl至10μl、1μl至25μl、1μl至10μl、5μl至25μl、5μl至10μl或约10μl的体积中。在某些实施例中，包含合成的核酸分子的溶液可接着例如在speedvac中蒸发，随后进一步处理。任选地，在某些实施例中，酶混合物可以添加到干燥的核酸分子混合物中以便起始基因组装方法或任何其它所期望的反应。在替代性实施例中，可以使用多孔板，如1536过滤板，其已装载有固相树脂，如逆相树脂、二氧化硅材料或阴离子交换树脂。在利用egb将核酸分子从一个或多个珠粒裂解之后，如本文所公开，可以冲洗过滤板的个别孔中裂解的核酸分子，其中所述核酸分子将结合于固相树脂。接着，可以使用已知技术去除核酸分子上的保护基团，包括例如气相或液体脱保护。在某些实施例中，可使用洗涤步骤去除任何游离保护基和/或截短的核酸分子。本文所公开的用于在合成之后获取核酸分子的另一种方法是使用微流体芯片回收核酸分子，如来自复杂微阵列的属于相同片段的核酸分子。用于获取核酸分子的微流体芯片可例如类似于本文所公开的微孔板或可类似于autebert，j等人，分层流体动力学流动限制：用于表面微量化学的化学物质的高效使用和获取(hierarchicalhydrodynamicflowconfinement：efficientuseandretrievalofchemicalsformicroscalechemistryonsurfaces)，langmuir2014，30(12)3640-3645中所公开的微流体芯片。本文公开了使用微洗脱从多孔板、微流体芯片或微阵列获取核酸分子的方法。已经证明，杂交的核酸分子可以通过用naoh溶液(如约0.5mnaoh)表面处理局部变性而回收。因此，一种用于获取核酸分子的方法包含在两个微流体芯片上制备核酸分子的两个互补集合，其中核酸分子第一集合的成员可与核酸分子第二集合的成员杂交且反之亦然。在某些实施例中，使用相同类型的微流体芯片或微阵列进行核酸分子两个集合的合成。核酸分子的互补集合可通过所属领域中已知的任何方法合成，例如经由喷墨或其它技术，包括本文所公开的合成技术。在某些示例性实施例中，核酸分子可以在珠粒上合成，并且微流体芯片可包含多个孔，其中珠粒可以位于每个具有相关联工作电极的可个别寻址的孔中。核酸分子的第一和/或第二集合可以在多孔板、微流体芯片或微阵列的一个或多个孔中制备，并且可以约1阿托摩尔至约1皮摩尔、约10阿托摩尔至约1皮摩尔、约10阿托摩尔至约100皮摩尔、约10阿托摩尔至约100阿托摩尔等的平均量制备。如本文所公开，核酸分子的第一集合是在第一微流体芯片上合成的，并且与第一集合互补的核酸分子的第二集合是在第二微流体芯片上合成的。在某些实施例中，合成核酸分子的合成集合，使得组装特定片段所需的核酸分子位于两个芯片的相同区。举例来说，如果核酸分子的两个集合是在相同的微流体芯片上合成，那么与有待由第一集合核酸分子组装的片段相关联的核酸分子的子集可以在第一芯片上的特定x-y位置(例如，区或孔)中合成。与有待由核酸分子的第二集合组装的相同片段相关联的核酸分子的相同子集也可以在第二芯片上的相同x-y位置合成。在合成之后，裂解来自第一芯片的核酸分子并且脱保护。去除来自第二芯片的核酸分子的侧保护基团，但是根据本文所公开的实施例，第二芯片上的核酸分子保持连接到表面。为了实现这一点，例如核酸分子的第一和第二集合可以分别经由第一和第二类型的连接基团附接到表面(例如，孔中的珠粒)，其中第一类型的连接基团使得核酸分子的第一集合可在脱保护条件下裂解，并且其中第二类型的连接基团使得核酸分子的第二集合可在脱保护条件下保持连接到表面。举例来说，第一类型的连接基团可以是可化学裂解的连接基团并且第二类型的连接基团可以是如本文别处所论述的可光裂解或可还原性裂解的连接基团。接着，第二芯片在杂交条件下与来自第一芯片的脱保护的核酸分子接触，使得来自第一芯片的脱保护的核酸分子与第二芯片上的核酸分子杂交。任选地，可以进行至少一个洗涤步骤以从第二芯片洗掉未结合的核酸分子。接着，用变性溶液使与第二芯片杂交的来自第一芯片的核酸分子变性。在某些实施例中，结合的核酸分子可用碱性溶液(如naoh溶液)化学变性。在某些实施例中，可使用0.5mnaoh溶液使核酸分子变性。随后汇集变性的核酸分子并收集。在某些实施例中，微流体装置可用于添加溶液(例如，缓冲或变性溶液)或转移从第一微流体芯片裂解的核酸分子到第二微流体芯片上的特定区(如多孔板中的孔)。如所属领域的技术人员应了解，在裂解和脱保护之后，在第一芯片的特定x-y位置中合成的核酸分子可以与第二芯片的相同x-y位置中合成的相同核酸分子组合用于杂交步骤。以此方式，相同核酸分子可以在第二芯片的相同孔中物理性组合，而不存在其它核酸分子。微流体装置还可用于从特定位置(如多孔板的孔)去除溶液(例如，缓冲或变性溶液)和变性的核酸分子，其中它们可被收集在例如新的多孔板或液滴制造装置用于进一步处理，如片段组装。在某些实施例中，微流体装置可以类似于autebert，j等人，分层流体动力学流动限制：用于表面微量化学的化学物质的高效使用和获取，langmuir2014，30(12)3640-3645中所公开的微流体探针。图26示出了根据本文所公开的某些实施例的一种示例性微流体装置。如图26中所示，至少一种缓冲溶液可以经由微流体装置2600中的第一入口通道2601添加到第二微流体芯片2605中。此外，变性溶液和第一微阵列的脱保护的核酸分子可以经由微流体装置2600中的第二入口通道2602添加到第二微流体芯片2605中。至少一种缓冲溶液可用于“嵌套”变性溶液和核酸分子，如图26中所示。至少一种缓冲溶液可随后经由第一出口通道2604离开微流体装置2600，而变性溶液和核酸分子可经由第二出口通道2603离开微流体装置2600。可随后收集来自第二出口通道2603的核酸分子用于进一步处理。上述使用微流体芯片和微流体装置回收核酸分子可相比使用来自多孔板的混合物具有数种优势。举例来说，核酸分子的稀释度可能极低，因为微流体芯片可能仅含有微升或甚至纳升体积。此外，属于相同片段的核酸分子可以物理方式组合，而不存在其它核酸分子。所属领域中已知的通过例如pcr由混合物扩增所期望的核酸分子的其它方法可能更耗时的并且具有更多污染。最后，杂交步骤增添了纠错步骤，因为从第一微流体芯片裂解的仅无错误或具有微小错误的核酸分子序列将与第二微流体芯片杂交。杂交步骤还增添了清洁步骤，因为极短的核酸分子可通过优化杂交条件而去除。本发明的实践中所用的汇集台可另外含有微孔操作装置，其包含可控制的可移动工具用于将微孔板从第一位置沿x和/或y和/或z方向移动到至少一个第二位置，并且可经编程以进行液体操作步骤。这类汇集台可另外装备有移液装置和抽吸设备以允许控制试剂的添加和去除。或者，可通过真空方式或使用适合声学操作的容器进行液体的去除。移液装置还可连接到试剂储槽和混合工具以混合并添加纯化和后续处理与组装步骤所需的规定量的试剂。组合相应功能的集成式液体操作装置是所属领域的技术人员已知的。在一特定实施例中，汇集台集成工具以使得来自第一和第二孔的一个或多个核酸分子池另外组合到第三孔中以产生更大的核酸分子池。在由相同和可变序列元件组装全长构建体的变异体或文库的情况下，可能需要这类逐步汇集。本发明的实践中所用的汇集台可另外含有位于微孔板下方的磁体。在一特定实施例中，这类板磁体可充当微磁体的对应部分以便触发所提取的珠粒释放到接收微孔中。或者，电微磁体可以是连接到毛细管的中空磁体，其可用液体冲洗以将结合的珠粒吹到接收孔中。还可采用其它珠粒释放方式。关于核酸分子的汇集，这可以进行多种方式。举例来说，可以将合成衬底收集并置于单个容器中。或者，核酸分子可以从合成衬底释放并且随后彼此接触。另外，核酸分子可以通过杂交组装。这意味着在相同容器中可发生不止一次组装。换句话说，本发明包括由化学合成的较小核酸分子组装不止一个(例如，二、三、四、五、六个等)核酸分子的方法。其中组装不止一个较大核酸分子(例如，可复制的核酸分子)可能有用的一个应用是在经组装的核酸分子打算插入到相同细胞中时。因此，一种经组装的核酸分子可以是染色体并且另一种可以是质粒。一旦所期望的核酸分子池已生成，就将通常进一步处理珠粒附接的核酸分子，例如以获得用于下游反应的功能性核酸分子。在链合成之后，5′-末端5′-羟基通常受例如二甲氧基三苯甲基(dmt)保护；核苷间磷酸或硫代磷酸部分也可受例如2-氰基乙基保护；并且所有核碱基(除t和u以外)中的环外氨基可以受例如酰基保护基保护。通常，在支撑物上的最后一个合成循环之后，裂解5′-末端dmt基团，随后汇集珠粒附接的核酸分子。然而，所有保护基必须在脱保护步骤中去除，随后核酸分子可高效地用于后续方法中。在本发明的一个实施例中，例如在不从珠粒释放核酸分子的情况下进行脱保护。这可通过选择不可裂解的碱稳定连接基团来进行。相应连接基团是所属领域的技术人员已知的。在一个实施例中，核酸分子在下游组装之前从珠粒释放。如果需要裂解核酸分子，那么可以在单个步骤中进行裂解和脱保护。核酸分子的释放可以通过用合适试剂裂解将核酸分子的3′端附接到珠粒(例如，磁性珠粒)的连接基团来实现。适用于裂解的试剂和条件取决于如本文别处所述的键的性质并且是所属领域的技术人员已知的。在某些实施例中，如本文所述，使用例如egb、可光裂解连接基团或还原性连接基团从珠粒释放核酸分子。在本发明的一个实施例中，核酸分子是经由丁二酰基附接到固体支撑物(例如，磁性或非磁性珠粒)。在某些实施例中，通用连接基团可以位于丁二酰基与核酸分子之间。丁二酰基连接基团可以通过使用例如浓氢氧化铵水溶液裂解。反应通常在50℃与80℃之间的温度下进行至少一至约八个小时。在某些实施例中，可以通过使用氨气，使用增加的热量和压力，如约80℃的温度和约3巴的压力持续约2小时的时间来裂解丁二酰基连接基团。当然，裂解条件可依据所用方案和保护基而变化。在使用氢氧化铵水溶液的实施例中，氨水溶液可随后通过蒸发去除，从而留下核酸分子准备用于纯化。在一个实施例中，可以通过气相处理进行裂解。在气相处理中，核酸分子可以在密闭腔室中在包含气态裂解/脱保护试剂(如氨气或氢氧化铵蒸汽)的气态环境中裂解。相应方法陈述在例如美国专利第5,514,789号或第5,738,829号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。以上反应通常还将触发其它保护基的裂解，包括氰基乙基和保护杂环伯胺的基团。因此，适当时，可使用单个裂解反应以去除所有存在的保护基。可以使用至少两种方法裂解本发明的实践中所用的连接基团：(a)同时在与脱保护步骤相同的条件下或(b)在脱保护步骤完成之后相继利用不同条件或试剂进行连接基团裂解。从核酸分子去除通用连接基团的各种方法描述在所属领域中，如美国专利公开第2002/0143166a1号，其公开内容以引用的方式并入本文中。对于下游应用，可能需要例如通过沉淀纯化汇集并脱保护的核酸分子以去除裂解的基团。可能还需要使核酸分子混合物与磁性粒子或其它支撑物分离。在一个实施例中，位于微孔板下方的板磁体可用于固定孔中的珠粒，同时可例如通过抽吸洗脱核酸分子。或者，在不存在板磁体的情况下，珠粒可以通过磁性方式自动从孔去除，而核酸分子将保留在孔中以在皮摩尔浓度下获得飞摩尔的个别高质量核酸分子池，准备进行进一步处理或使用。在一些情况下，核酸分子可以与固体支撑物分离，而固体支撑物保持定域在与合成核酸分子的位置相同或类似的位置。在此类情况下，通常在合成结束之后，可以去除与合成支撑物接触的寡核苷酸合成试剂，随后添加一种或多种用于释放构建的寡核苷酸的试剂，也称为裂解试剂。这些释放试剂可以呈如液态或气态形式。气态试剂如上文所提及。在许多情况下，裂解试剂将是挥发性(例如，其可经由冷冻干燥去除)和非离子性的。裂解的寡核苷酸可随后通过从孔移出(当存在时)或通过冲洗合成衬底来回收。当采用微孔进行合成时，可使用呈液体形式的裂解试剂。合成衬底可以用这类液体试剂涂布，随后去除合成的寡核苷酸的基团或去除个别寡核苷酸(少于所有存在的寡核苷酸)。在裂解已发生之后，可以例如通过限制衬底的搅动和定点去除(例如，用移液管尖端)含有个别寡核苷酸的流体来实现个别寡核苷酸的去除。当衬底含有孔或空腔时，这类方法将特别有用。任选地，合成的核酸分子可以在汇集、裂解和/或脱保护之后但在进入模块3方法之前浓缩。一种这类浓缩方法将通过额外第二结合、洗涤和洗脱系列集合以减少最终体积。这一升高的浓度将升高合成的核酸分子的浓度，使得可以按期望加速子片段生成中重叠区段的杂交。浓缩到升高的浓度还可用于将多个池的浓度“归一化”到更恒定的范围，以使得模块3方法(例如，所有模块3方法)中需要采用有限的例如组装条件集合。图13示出了合成的寡核苷酸可与支撑物分离的两种方法。在这幅图中，寡核苷酸已在珠粒1300上合成并释放到微孔滴定板1301的周围孔中。在每种情况下，含有供收集的寡核苷酸的孔用流体1302覆盖并且使用移液管尖端1303收集所述流体。图左侧的是孔内含有流体的两个孔。另外转向图13右侧，屏障1304延伸高于孔以允许在较高层面收集流体。在两种情况下，流体可以在那里，随后使得移液管尖端紧密接近，或流体可以通过移液管尖端递送。另外，可以通过利用移液管尖端1303流动递送使围绕珠粒1300的流体循环以分布释放的寡核苷酸。在某些实施例中，具有汇集的珠粒的多孔板或其它合适容器例如在speedvac中干燥以浓缩多孔板或其它合适容器中的珠粒。在此之后可如本文所述从珠粒裂解核酸分子并脱保护，包括例如在气相处理中或在液体中裂解和脱保护。在裂解和脱保护之后，可优选地在组装所用的缓冲液中洗脱核酸分子。核酸分子可如上文所指示在缓冲液中转移到组装工作台或干燥。模块3一旦化学合成阶段已完成，所得核酸分子可以组装(如果需要)成较大核酸分子。依据最终核酸分子有待使用是最终目的而定，化学合成核酸分子的“质量”(例如，从序列保真度的角度)可能太低而不能用于预定应用。举例来说，如果化学合成核酸分子将用作长探针，那么他们可以具有足以用于所述目的而无需进一步处理的质量。然而，考虑将要组装一百个核酸区段的情形，每个核酸区段是一百个碱基对长并且每200个碱基对存在一个错误。最终结果是经组装的核酸分子每10,000个碱基对中平均将存在50个序列错误。如果有人打算例如由经组装的核酸分子表达一个或多个蛋白质，那么所述序列错误数将可能被认为过高。另外，虽然个别核酸分子可以进行测序，但是这是耗时的并且涉及额外成本。因此，在许多情况下，可以进行错误去除步骤。通常，这将在第一轮组装之后进行。因此，在一个方面，本发明的方法涉及以下(按此次序或不同的次序)：1.片段扩增和组装(例如，pcr/活体外组装)。2.纠错。3.最终组装(例如，活体内组装)。在本发明的各种实施例中，错误去除步骤还可通过执行处理器可执行指令来实施。本发明因此包括基于以下指令的软件，所述指令用于进行与错误去除方法相关联的机械功能以及本发明的其它方面。可使用多种方法进行片段扩增和组装。一种示例性方法描述在yang等人，《核酸研究》，21：1889-1893(1993)和美国专利第5,580,759号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。在yang等人论文所述的方法中，线性载体与末端共有序列同源性的双链核酸分子混合。添加具有核酸外切酶活性的酶(即，t4dna聚合酶、t5核酸外切酶、t7核酸外切酶等)，其将混合物中所存在的所有末端的一条链向后剥离。“向后剥离的”核酸分子随后退火，与dna聚合酶和脱氧核苷酸三磷酸一起在允许填充单链空隙的条件下保温。所得核酸分子中的切口可以通过将分子引入到细胞中或通过添加连接酶来修复。当然，依据应用和工作流程而定，可以省略载体。另外，所得核酸分子或其子部分可以通过聚合酶链反应来扩增。其它核酸组装方法包括美国专利公开第2010/0062495a1号、第2007/0292954a1号、第2003/0152984aa号和第2006/0115850aa号以及美国专利第6,083726号、第6,110,668号、第5,624,827号、第6,521,427号、第5,869,644号和第6,495,318号中所描述的那些，它们的公开内容以引用的方式并入本文中。一种用于核酸分子等温组装的方法陈述在美国专利公开第2012/0053087号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。在此方法的一个方面，供组装的核酸分子与具有核酸外切酶活性的热不稳定蛋白质(例如，t5聚合酶)、热稳定聚合酶和热稳定连接酶在核酸外切酶活性随时间的推移降低的条件(例如，50℃)下接触。核酸外切酶“向后咀嚼”核酸分子的一条链并且如果存在序列互补，那么核酸分子将彼此退火。热稳定聚合酶填充空隙并且热稳定连接酶密封切口。像这样的方法可结合图16的设备使用。另外，多于一个核酸分子可以与其它合适试剂一起储存在1609的个别储存单元中并且这些储存单元可以设定成例如50℃的温度以便组装储存的分子。一种可用于组装本发明的核酸分子以及将这类核酸分子插入到载体中的可商购的试剂盒是无缝克隆和组装试剂盒(目录号a13288)，其可从加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司(lifetechnologiescorp.，carlsbad，ca)购得。举例来说，可以包括单链结合蛋白(如t4基因32蛋白和reca)以及所属领域中已知的其它核酸结合或重组蛋白以便于核酸分子退火。在一些情况下，核酸分子可以在固体支撑物上扩增。因此，本发明包括在固体支撑物上合成核酸分子但是不从合成核酸分子的固体支撑物裂解的方法。在此类情况下，经扩增的核酸分子可直接使用(例如，作为探针)或如本文别处所述组装。一种用于组装核酸分子的方法(图3)涉及以重叠的核酸分子为起始物质，使用pcr将其“拼接”在一起。在许多情况下，拼接的核酸分子将是化学合成的并且长度将小于100个核苷酸(例如，约40至100个、约50至100个、约60至100个、约40至90个、约40至80个、约40至75个、约50至85个等核苷酸)类似于图3中所示的方法陈述在美国专利第6,472,184号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。例如期望插入到克隆载体中时，还可以使用含有限制位点的引物。一种合适的克隆系统称为goldengate，其以各种形式陈述在美国专利公开第2010/0291633a1号和pct公开wo2010/040531中，它们的公开内容以引用的方式并入本文中。因此，在需要时，经组装的核酸分子可直接插入到载体和宿主细胞中。当所需构建体相当小(例如，小于5千碱基)时，这可为适当的。当需要较大构建体(例如，5至100千碱基)时，ii型限制位点介导的组装可用于组装多个片段(例如，两个、三个、五个、八个、十个等)。基于pcr的核酸分子(例如，化学合成核酸分子)组装的替代方法是基于5′-磷酸化核酸分子的重叠对的直接连接(“基于连接的组装”)。在此方法中，合成单链核酸分子，磷酸化并且退火以形成具有互补突出端(例如，具有四个核苷酸的突出端)的双链分子。个别双链分子随后彼此连接以形成较大构建体。在某些实施例中，此方法可比pcr方法合乎需要，尤其在将要组装高度重复序列(如gc段)。此方法可用于组装约两个至约四十个核酸分子(例如，约两个至约四十个、约三个至约四十个、约五个至约四十个、约八个至约四十个、约两个至约三十个、约两个至约二十个、约两个至约十个等核酸分子)。相关方法描述在美国专利第4,652,639号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。在许多情况下，当使用化学合成核酸分子进行基于连接的组装时，分子长度将小于100个碱基对。另外，可用于接合核酸分子的互补重叠序列将一般是两个至十个(例如，约两个至约十个、约四个至约十个、约五个至约十个、约两个至约八个、约三个至约七个等核苷酸长)(图4)。一种可用于组装核酸分子的方法是red/et重组。此方法采用由噬菌体蛋白质对(如rece/rect或redα/redβ)介导的基于大肠杆菌的同源重组。此方法不受核酸大小限制并且不依赖于限制位点。基本上，可以在任何位点使用red/et重组工程改造大肠杆菌中几乎任何大小的任何dna分子。基本上，red/et重组涉及三个步骤/条件。第一步骤或条件是线性dna中存在同源臂(例如，50个碱基对长度的臂)。第二步骤或条件是大肠杆菌细胞中插入或存在所述线性dna。第三步骤或条件是大肠杆菌细胞中表达或存在任何适当的噬菌体对(例如，rece/rect或redα/redβ)。red/et重组陈述在美国专利第6,355,412号和第6,509,156号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。另外，如图4中所示，可使用多轮聚合酶链反应连续生成较大核酸分子。在大多数情况下，不论由化学合成核酸分子生成较大核酸分子的方法如何，都将存在来自化学合成方法的错误。因此，在许多情况下，纠错将是所需要的。可通过多种方式实现纠错。一种方法是通过分别对化学合成核酸分子进行测序。经序列验证的核酸分子可随后通过多种方式获取。一种选择正确序列的核酸分子的方式称为“激光弹射”并且依赖于使用高速激光脉冲从测序板弹出所选克隆核酸群体。此方法描述在例如美国专利公开第2014/0155297号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。另一种纠错方法陈述在图6中。图6是用于合成错误最少的核酸分子的示例性方法的流程图。在第一步骤中，获得长度小于所期望的全长核苷酸序列的核酸分子(即，所期望的全长核苷酸序列的“核酸分子片段”)。预期每个核酸分子具有所期望的核苷酸序列，其包含所期望的全长核苷酸序列的一部分。还可预期每个核酸分子具有所期望的包含以下的核苷酸序列：用于核酸分子pcr扩增的衔接子引物、使核酸分子附接到dna微芯片的系链序列或由任何实验目的或其它打算所确定的任何其它核苷酸序列。核酸分子可以任何一种或多种方式获得，例如经由合成、购买等。在任选的第二步骤中，将核酸分子扩增以使得每个核酸分子获得更多。然而，在许多情况下，将产生足够数目的核酸分子，使得不必扩增。当采用时，可以通过所属领域中已知的任何方法实现扩增，例如通过pcr、滚环扩增(rca)、环介导等温扩增(lamp)、基于核酸序列扩增(nasba)、链置换扩增(sda)、连接酶链式反应(lcr)、自动维持序列复制(3sr)或固相pcr反应(sp-pcr)，如桥式pcr等(关于各种扩增技术的综述，参见例如fakruddin等人，《药学与生命科学杂志(jpharmbioalliedsci.)》2013；5(4)：245-252)。在扩增期间可能将额外错误引入到任何核酸分子的核苷酸序列中。在某些情况下，在合成之后避免扩增可能是有利的。当已在第一步骤中以足够产率产生核酸分子时，可以省略任选的扩增步骤。这可以通过使用本发明改进的组合物和方法(如本文别处所述经优化的珠粒格式)来实现，所述改进的组合物和方法被设计成允许以足够产率和质量合成核酸分子。在第三步骤中，将任选地经扩增的核酸分子组装成预期具有所期望的长度的分子的第一集合，所期望的长度可以是所期望的核苷酸序列的预定全长。经扩增的核酸分子组装成全长分子可以任何方式实现，例如通过使用基于pcr的方法。在第四步骤中，使全长分子的第一集合变性。变性使双链分子变成单链分子。变性可以通过任何方式实现。在一些实施例中，变性是通过加热分子来实现。在第五步骤中，使变性分子退火。退火使得单链分子变成全长双链分子的第二集合。退火可以通过任何方式实现。在一些实施例中，退火是通过冷却分子来实现。一些经退火的分子可含有一个或多个指出序列错误位点的错配。在第六步骤中，全长分子的第二集合与一种或多种裂解错配的核酸内切酶反应，产生分子的第三集合，预期其长度小于所期望的完整基因序列的长度。核酸内切酶将第二集合中的一个或多个分子切割成较短分子。切割可以通过多种方式实现。特别期望的是在任何核苷酸序列错误位点处的切割，因为一个或多个已在错误位点处切割的分子碎片的组装提供在最终方法步骤中去除切割错误的可能性。在一示例性实施例中，分子是在锰存在下用t7核酸内切酶i、大肠杆菌核酸内切酶v和绿豆核酸内切酶切割。在此实施例中，预期核酸内切酶在分子中的任何序列错误位点处以及不存在序列错误的随机位点处引入切割。在另一示例性实施例中，分子仅用一种核酸内切酶(如t7核酸内切酶i或具有类似功能的另一种核酸内切酶)切割。在第七步骤中，分子的第三集合组装成分子的第四集合，其长度预期的所期望的核苷酸序列的全长。由于能够通过所提供的方法实现后期纠错，所以预计分子集合的核苷酸序列错误比通过
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中的方法可提供的少得多。任选地，步骤四至七可以重复一次或数次以进一步提高错误减少的效率。上文和图6中所陈述的方法也陈述在美国专利第7,704,690号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。此外，上文所述之方法可以作为处理器可执行指令编码到计算机可读介质上。用于在化学合成核酸分子中实现纠错的另一种方法是通过一种称为errasetm(novicibiotech)的商业方法。纠错方法和适用于纠错方法的试剂陈述在美国专利第7,838,210号和第7,833,759号、美国专利公开第2008/0145913a1号(错配核酸内切酶)以及pct公开wo2011/102802a1中，它们的公开内容以引用的方式并入本文中。示例性错配结合和/或裂解酶包括核酸内切酶vii(由t4基因49编码)、resi核酸内切酶、celi核酸内切酶和sp核酸内切酶或含有核酸内切酶的酶复合物。举例来说，muthls复合物构成细菌错配修复系统，其中muts具有错配检测和错配结合活性，muth具有核酸酶活性并且mutl将muth引导到muts结合的错配位点。所属领域的技术人员应认识到，可以在本发明的某些实施例中实践其它纠错方法，如例如美国专利公开第2006/0127920aa号、第2007/0231805aa号、第2010/0216648a1号、第2011/0124049a1号或美国专利第7,820,412号中所描述的那些，它们的公开内容以引用的方式并入本文中。纠错方法的另一示意图在图7中示出。以合成方式生成的核酸分子的错误率通常是约1个碱基/300-500个碱基。如上文所指出，在许多情况下，可以调节条件，使得合成错误基本上低于1个碱基/300-500个碱基。另外，在许多情况下大于80％的错误的单个碱基移码缺失和插入。另外，当采用高保真度pcr扩增时，小于2％的错误由聚合酶的作用导致。在许多情况下，将使用固定的蛋白质：dna比率进行错配核酸内切酶(mme)纠正。一种纠错方法涉及以下步骤。第一步骤是使反应缓冲液(例如，200mmtris-hcl(ph8.3)、250mmkcl、100mmmgcl2、5mmnad和0.1％)中所含的dna在98℃下变性2分钟，随后冷却到4℃持续5分钟，接着使溶液升温至37℃持续5分钟，随后储存在4℃下。稍后，将t7核酸内切酶i和dna连接酶添加到37℃溶液中持续1小时。通过添加edta停止反应。类似方法陈述在huang等人，《电泳(electrophoresis)》33：788-796(2012)中。可以多种方式生成紧密匹配预定核苷酸序列的核酸分子。一种方式是在高序列保真度下化学合成核酸分子(例如，寡核苷酸)。另一种方式是从个别分子的群体中选出经化学合成的具有所期望的序列的核酸分子，所述群体中的一些不具有正确的核苷酸序列。又一种方式是纠正被认为含有“错误”的核酸分子群体中的序列错误。与上述相关的方法陈述在本文别处。本发明的方法包括生成与预定核苷酸序列具有若干变化(例如，错误)的核酸分子的任何一种、两种或全部三种方式。举例来说，可以在高序列保真度下合成核酸分子，随后纠错，随后选择具有所期望的核苷酸序列的群体成员。“预定核苷酸序列”意思指核苷酸序列是已知的并且期望获得具有所述序列的核酸分子。与预定核苷酸序列的偏差基本上在本文中称为错误。一种用于纠正核酸分子中的错误的方法概略地陈述在图6中。在图6中所陈述的方法的倒数第二个步骤中，经退火的核酸分子与一种或多种核酸内切酶反应作为纠错方法的一部分。此方法的变化形式如下。第一，可以进行两轮或更多轮(例如，两轮、三轮、四轮、五轮、六轮等)纠错。第二，可以在一轮或多轮纠错中使用不止一种核酸内切酶。举例来说，可以在每一轮纠错中使用t7核酸内切酶i和celii。第三，可以在不同纠错轮次中使用不同核酸内切酶。举例来说，可以在第一轮纠错中使用t7核酸内切酶i和celii并且可以在第二轮纠错中仅使用celii。表10示出了通过对dna的超过两百万个碱基对进行测序，单独和共同使用两种不同酶纠错的结果。出于说明的目的使用酶混合物t7核酸内切酶和celii，在第一、第二和第三轮纠错之后，所存在的错误数分别是1/4363、1/16,115和1/36,293。一些数据中所见的大标准差被认为至少部分归因于所存在的错误数少。表10还示出了经由纠错优先减少的某些错误类型。举例来说，插入/缺失错误(插入缺失)在多轮纠错之后基本上被消除。a到g和c到t取代更难纠正。使用第0轮和第3轮的t7n1行的数据，这类取代的数目分别是7/62,192(1/8,884)和21/933,716(1/44,463)个测序碱基对。这表示a到g和c到t取代减少约5倍。在许多情况下，在纠错期间反应物中可能存在连接酶。据相信，纠错方法中所用的一些核酸内切酶具有切口酶活性。包括一种或多种连接酶被认为是密封由这类酶产生的切口并且提高在扩增之后经纠错的核酸分子的产率。可使用的示例性连接酶是t4dna连接酶、taq连接酶和pbcv-1dna连接酶。本发明的实践中所用的连接酶可以是热不稳定或热稳定的(例如，taq连接酶)。如果采用热不稳定连接酶，那么它将通常需要再添加到每个纠错循环的反应混合物中。在每个循环期间将通常无需再添加热稳定连接酶，只要保持温度低于其变性点即可。本发明的代表性工作流程陈述在图36中。在此工作流程中，将三种核酸区段(称为“亚片段”)汇集并且使用酶t7核酸内切酶i(“t7ni”)进行纠错(第2行)。随后通过pcr组装三种核酸区段(第3行)并接着进行第二轮纠错(第4行)。在另一轮pcr(第5行)之后，接着筛选所得核酸分子得到那些全长核酸分子(第7行)。这些核酸分子可随后通过例如测序筛选剩余错误。图36工作流程的第一变化形式概述在图42左侧工作流程中。在此实施例中，汇集亚片段(第1行)并且用核酸外切酶(例如，核酸外切酶i；第2a行)处理，随后对其进行双重纠错方法(第2b和4行)。核酸外切酶消除遗留在pcr反应产物中的单链引物分子，其可干扰后续pcr反应(第3行)并且生成非特异性扩增产物。在工作流程的第二变化形式中，第一纠错步骤可使用不止一种核酸内切酶，如t7ni与resi组合(图42，右侧工作流程，第2b行)。任选地，工作流程可在区段组装pcr(第3行)之后包含第三纠错步骤以消除剩余错配。可以使用错配结合蛋白(如muts)进行这类第三纠错步骤(第4行)。所属领域的技术人员应理解，可以应用第一、第二和/或第三以及可能其它纠错循环的各种次序和组合以进一步降低经组装的核酸分子的错误率。图37示出了在纠错前后化学合成的核酸分子中核苷酸序列错误的单独频率和比较频率。从数据可以看出，插入和缺失通过t7核酸内切酶i介导的纠错有效地去除。图38示出了在两轮纠错之后剩余的错误(总错误百分比)。约63％的剩余错误是转换并且约30％的剩余错误是颠换。因此，93％的剩余错误是转换和颠换。另外，如图37中可见，经纠错的核酸分子似乎具有比未纠正的化学合成的核酸分子更多的c转换。如实例9中所解释，这可能由在pcr期间发生的取代导致。本发明因此提供用于从核酸分子去除插入缺失的方法。在许多情况下，这类方法使得插入缺失减少超过95％。在一些情况下，从经纠错的核酸分子去除所有插入缺失。去除插入缺失是重要的，因为这类改变具有相当大的可能性不利地影响核酸分子的功能。当插入缺失存在于核酸分子的蛋白质编码区内时，结果通常是移码。本发明因此包括用于从核酸分子去除插入缺失的方法，其中去除大于90％(例如，约90％至约99.9％、约93％至约99.9％、约95％至约99.9％、约98％至约99.9％、约95％至约99％等)的插入缺失。本发明还提供用于从核酸分子去除所有类型的错误的方法。从图37中所示的数据可以看出，转换率从约101ppm降低到约41ppm，颠换从约114ppm降低到约20ppm，因此，总取代从约215ppm降低到约61ppm(减少72％)。本发明还提供用于去除核酸分子中的错误的方法，使得在化学合成期间引入的所有错误的大于95％、大于97％、大于98％、大于99％、大于99.5％或大于99.8％消除。换句话说，错误可以数种方式引入到作为本发明主题的核酸分子中。一种方式是通过在寡核苷酸化学合成期间发生的合成错误(化学合成错误)。另一种方式是通过聚合酶链反应(pcr)方法。一种减少非化学合成错误的方式是通过限制在化学合成之后对核酸分子进行的错误引入操作的数目。另外，在一些情况下，可以在寡核苷酸的化学合成期间去除错误并且可能在稍后的方法中引入额外错误。使用可能在pcr期间引入到核酸分子中的错误为例，多种方法可用于减少这类错误。已知聚合酶错误强烈取决于所复制分子的核苷酸序列。另外，pcr使用的轮次越多，引入错误的可能性越大。另外，已显示不同聚合酶具有不同错误率(参见例如mcinerney等人，“在利用dna聚合酶的聚合酶链反应期间的错误率比较(errorratecomparisonduringpolymerasechainreactionbydnapolymerase)”，《国际分子生物学(molecularbiologyinternational)》，第2014卷，文章编号287430)。因此，聚合酶引入的错误可以通过以下数种方法减少，包括(1)减少或消除聚合酶介导的应用步骤，(2)选择所用聚合酶和(3)调整所扩增的序列。已针对聚合酶错误率进行多个研究。一个这类研究陈述在mcinerney等人，《国际分子生物学》，第2014卷，文章编号287430中。在这一研究中，发现以下错误率：taq聚合酶(fermentas)-3.0×10-5、5.6×10-5(两次实验)；accuprimetm-taq(lifetechnologiescorp.)-1.0×10-5；kodhotstart(novagen)-7.6×10-6；经克隆的pfu聚合酶(agilent)-2.8×10-6；hotstart(finnzymes)-2.6×10-6和pwo聚合酶(roche)-2.4×10-6。因此，mcinerney等人估计所测试的酶的错误率介于约1.0×10-5至约7.6×10-6范围内。应注意，accuprime-taq是酶混合物，其中一种酶是重组taqdna聚合酶并且另一种是火球菌属(pyrococcusspecies)gb-d聚合酶。火球菌属gb-d聚合酶是具有3′→5′核酸外切酶活性的校正酶。此酶与taqdna聚合酶的混合物被认为增加保真度。mcinerney等人，国际分子生物学，第2014卷，文章编号287430还陈述了由聚合酶引入错误的类型。插入缺失的数目低到使其数目在统计学上没有意义。因此，对于所测试的所有聚合酶，看似是总数的如下：155个转换、9个颠换和4个插入缺失。因此，插入缺失似乎易于通过本发明的方法去除并且可以相对低的频率引入到经聚合酶扩增的核酸分子中。本发明因此包括用于生成紧密匹配预定核苷酸序列的核酸分子的方法。这些方法可采用以下中的一个或多个：高保真度核酸合成、纠正在合成方法期间引入到核酸分子中的错误、使被设计成具有预定核苷酸序列的核酸分子所经历的pcr轮次数减到最少、使用高保真度聚合酶和/或聚合酶混合物、在核酸分子生成中的一个或多个步骤使用一种或多种纠错方法以及在生成核酸分子的方法后期使用一种或多种纠错方法(例如，去除聚合酶引入的错误和限制新的聚合酶引入的错误的数目)。本发明还包括如下方法，其中扩增反应的总数小于二十个(例如，约4个至约20个、约6个至约20个、约8个至约20个、约10个至约20个、约12个至约20个、约14个至约20个等)。本发明另外包括如下方法，其中在纠错(其包括与纠错方法相关联的扩增，即“纠错”)之后的扩增反应总数小于十个(例如，约0个至约10个、约1个至约10个、约2个至约10个、约4个至约10个、约5个至约20个、约11个至约5个等)。另一种用于从化学合成的核酸分子去除错误的方法是通过选择具有正确核苷酸序列的核酸分子。这可以通过选择单个核酸分子进行扩增，随后对扩增产物进行测序以确定是否存在任何错误来进行。因此，本发明还包括用于减少序列错误的选择方法。用于核酸分子扩增和序列验证的方法陈述在美国专利第8,173,368号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。类似方法陈述在matzas等人，《自然·生物技术(naturebiotechnology)》，28：1291-1294(2010)中。可以通过多种方式选择经序列验证的核酸分子，包括如本文别处所述的使用激光脉冲的方法。根据本发明的这一方面的方法可包括以下步骤：(a)提供经合成具有相同核苷酸序列的核酸分子混合物，(b)分离混合物中的核酸分子，使得扩增产生来源于单个起始核酸分子的子代核酸分子，(c)对步骤(b)中生成的大于一个经扩增的核酸分子进行测序，和(d)从步骤(c)中经测序的核酸分子鉴别至少一个具有所期望序列的单独核酸。步骤(d)中所鉴别的核酸分子可随后用作组装方法中的一个核酸分子，如本文别处所述。本发明还包括用于分离不具有所期望序列(例如，具有“错误”)的核酸分子群体中所存在的具有所期望核苷酸序列的核酸分子的组合物和方法。这可以使用以物理方式使含有错误的核酸分子与具有“正确”核苷酸序列的核酸分子分离的方法来进行。本发明另外包括不对核酸分子进行活体外扩增步骤或可引入错误的其它步骤的组合物和方法。因此，作为例如纠错方法的一部分，可以物理方式使具有正确序列的核酸分子与那些不具有正确序列的核酸分子分离。一种这样做的方式涉及使用结合含有错配的核酸分子的试剂。举例来说，已显示结合含有错配的双链核酸分子的蛋白质是大肠杆菌muts(wagner等人，《核酸研究》，23：3944-3948(1995))。wan等人，《核酸研究》，42：e102(2014)证实化学合成的含有错误的核酸分子可保留在固定muts的纤维素柱上，而不含有错误的核酸分子并未如此保留。本发明因此包括如下方法以及相关联的组合物，其中使核酸分子变性，随后再退火，接着分离经再退火的含有错配的核酸分子。在一些方面，所用错配结合蛋白是muts(例如，大肠杆菌muts)。另外，错配修复结合蛋白的混合物可用于本发明的实践中。已发现，不同错配修复结合蛋白具有相对于其所结合的错配类型不同的活性。举例来说，已显示水生栖热菌(thermusaquaticus)muts有效去除插入/缺失错误，但是在去除取代错误方面不如大肠杆菌muts有效。另外，显示出两种muts同源物的组合进一步提高在去除取代和插入/缺失错误方面的纠错效率，并且还减少偏向结合的影响。本发明因此包括两种或更多种(例如，约两种至约十种、约三种至约十种、约四种至约十种、约两种至约五种、约三种至约五种、约四种至约六种、约三种至约七种等)错配修复结合蛋白的混合物。本发明另外包括使用多轮(例如，约两轮至约十轮、约三轮至约十轮、约四轮至约十轮、约两轮至约五轮、约三轮至约五轮、约四轮至约六轮、约三轮至约七轮等)使用错配修复结合蛋白的纠错。这些轮纠错中的一个或多个可采用两种或更多种错配修复结合蛋白的使用。或者，在第一轮纠错中可使用单个错配修复结合蛋白，而在第二轮纠错中可使用相同或另一种错配结合蛋白。出于说明的目的使用图36中陈述的工作流程，可以在一个或多个步骤去除含有错误的核酸分子。举例来说，可以在图36步骤1和2之间去除“错配的”核酸分子。这将导致“预选的”核酸分子群体用错配修复核酸内切酶的处理。另外，可以合并两个纠错，如这两个。举例来说，可以使核酸分子变性，随后再退火，接着经由与固定的muts结合而去除具有错配的核酸分子，然后在无中间变性和再退火步骤的情况下，使通过muts结合未分离的核酸分子与错配修复核酸内切酶接触。虽然不希望受理论束缚，但是据相信核酸分子的扩增将错误引入到所扩增的分子中。一种避免引入扩增介导的错误和/或去除这类错误的方式是通过在已进行大部分或所有扩增步骤之后选择具有正确序列的核酸分子。出于说明的目的再次使用图36中陈述的工作流程，可以在步骤5之后使具有错配的核酸分子与那些无错配的核酸分子分离。或者，可以在步骤3之后去除含有错配的分子，如图42中右侧工作流程所示。具有错配的核酸分子可以通过与错配粘合剂以多种方式结合而与那些无错配的核酸分子分离。举例来说，核酸分子的混合物(一些具有错配)可以(1)穿过含有所结合的错配结合蛋白的管柱或(2)与结合错配结合蛋白的表面(例如，珠粒(如磁性珠粒)、板表面等)接触。示例性格式和相关联的方法涉及使用结合错配结合蛋白的珠粒的那些。举例来说，可以使核酸分子溶液与结合错配结合蛋白的珠粒接触。结合到错配结合蛋白的核酸分子随后被连接到表面并且不易于从溶液去除或转移。在图39中陈述的特定格式中，结合有错配结合蛋白的珠粒可以在允许具有错配的核酸分子结合到错配结合蛋白的条件下(例如，5mmmgcl2、100mmkcl、20mmtris-hcl(ph7.6)、1mmdtt，25℃持续10分钟)被置于具有溶液中存在核酸分子的容器(例如，多孔板的孔)中。流体可随后在不转移珠粒和/或错配的核酸分子的情况下被转移到另一容器(例如，多孔板的孔)。多种方法可用于转移含有核酸分子的流体。举例来说，可使用微量移液管。另外，例如在移液期间或在以另外的方式移出有待转移的流体时，可以使用磁场将结合错配的核酸分子的磁珠固持在适当位置。作为另一个实例，可以将固体物品(例如，玻璃或金属棒)引入到含有有待转移的核酸的第一容器中，随后将固体物品浸入第二容器中所存在的流体中。粘附到固体物品的流体和与固体物品缔合的核酸分子将从第一容器转移到第二容器中。还可采用声学流体转移(描述在本文别处)。声学液体转移可用于将流体从一个容器(例如，图39中的1号孔和/或2号孔)的表面(其中珠粒位于第一容器的底部)转移到第二容器(例如，图39中的3号孔)。因此，珠粒所结合的含有错配的核酸分子将不会非常接近于所转移的流体。在不施加磁场将涂布有错配结合蛋白的珠粒固持在适当位置的情况下，可能需要调节孔中珠粒的浓度，使得珠粒将不会连同预定体积的所转移的液体一起转移。有待转移液体的孔中珠粒的浓度越低，可以转移更多体积而不从孔中共同转移未固定的珠粒。举例来说，在约100μg/μl至约1mg/μl范围内的珠粒浓度可用于通过声学流体转移从多孔板的孔中转移约0.1μl至约5μl包含经纠错的核酸分子的液体。同时，珠粒的浓度应足够高以确保珠粒上将提供足够量的muts以便高效捕获样品中含有错配的核酸分子。对于含有错配的片段长度为约300至500bp的实例，可使用浓度等于约0.5至约2μg/μlmuts蛋白质的浓度的珠粒(如磁性错配结合珠粒(m2b2)，magdetecttm；unitedstatesbiological，salem，ma；以10mg/ml的储备溶液提供)。另外，珠粒可以与尚未结合到珠粒的含有核酸分子的溶液分离。这使得含有错配的核酸分子与那些不含有错配的核酸分子分离。在一些实施例中，在如上所述使用一种或多种核酸内切酶进行纠错步骤之后，可以使用某些蛋白质(如muts)的错配结合特性去除仍含有错误的核酸分子。因此，去除错误的方法可包含(i)基于核酸内切酶的修复和(ii)错配结合蛋白介导性去除含有错误的核酸分子的组合。在一些工作流程中，步骤(i)后面可以是步骤(ii)，如图42右侧流程图所示。在其它实施例中，步骤(ii)后面可以是步骤(i)。步骤(i)可以例如利用t7ni来进行并且步骤(ii)可以利用muts来进行。在一些情况下，步骤(i)和(ii)的组合可使得整体错误率降低1.5倍至3倍、3倍至20倍(例如，约4倍至约20倍、约5倍至约20倍、约7倍至约20倍、约10倍至约20倍、约12倍至约20倍、约4倍至约17倍、约4倍至约15倍、约8倍至约15倍等)。本发明因此包括与具有所期望序列的核酸分子较少的组合物相比，用于制备具有所期望序列的核酸分子数目增加的组合物的方法。这可以通过使不具有所期望序列的核酸分子隔离，随后将这些核酸分子与具有所期望序列的核酸分子分离来进行。另外，具有所期望序列的核酸分子可以是最终产物或可以与其它核酸分子(例如，其它化学合成的核酸分子或载体)组合。一旦已获得具有所期望序列的核酸分子，它们可以用一定的方式处理以限制可被引入到其中的改变的数目。举例来说，核酸分子可经设计以使其在引入到细胞(例如，酵母细胞)中后被组装和或扩增。细胞内组装和扩增利用细胞机制和伴随的纠错方法，所述纠错方法可用于降低引入到核酸分子中的新错误的数目。在特定实施例中，本发明包括用于寡核苷酸产生、组装和纠错的组合物和方法以及由寡核苷酸完全或部分组装的核酸分子。举例来说，本发明的方法包括(1)化学合成多个寡核苷酸，(2)部分组装所述多个寡核苷酸以形成两个或更多个部分组装的核酸分子，(3)对所述两个或更多个部分组装的核酸分子中的每一个进行一轮或多轮纠错，(4)组装步骤(3)中生成的两个或更多个经纠错的部分组装的核酸分子以形成较大核酸分子，和(6)对步骤(5)中生成的所述较大核酸分子进行一轮或多轮纠错，其中纠错方法是通过使核酸分子变性和再退火，接着使经再退火的核酸分子与(a)错配修复核酸内切酶在适合于含有错配的核酸分子裂解的条件下、(b)错配修复结合蛋白在隔离含有错配的核酸分子的条件下、或(c)(a)和(b)同时或在不同步骤中接触来进行。另外，当使用错配核酸内切酶进行纠错时，反应混合物可能存在一种或多种连接酶(如taq连接酶)。这在错配核酸内切酶具有切口酶活性时尤其合乎需要。可以省略一种或多种连接酶，但是这样可能导致核酸分子的产率下降，尤其在核酸内切酶消化之后使用扩增步骤时。根据本文所描述的各种实施例，计算机可读介质可以编码有用于以下的处理器可执行指令：(a)提供经合成具有相同核苷酸序列的核酸分子混合物，(b)分离混合物中的核酸分子，使得扩增产生来源于单个起始核酸分子的子代核酸分子，(c)对步骤(b)中生成的大于一个经扩增的核酸分子进行测序，和(d)从步骤(c)中经测序的核酸分子鉴别至少一个具有所期望序列的单独核酸。步骤(d)中所鉴别的核酸分子可随后用作组装方法中的一个核酸分子，如本文别处所述。在各种实施例中，计算机可读介质可被包括在系统中，所述系统用于通过选择具有正确核苷酸序列的核酸分子减少化学合成的核酸分子的错误。可以多种方式提及核酸分子中的序列错误。举例来说，存在与合成核酸分子相关联的错误率、与在纠错和/或选择之后的核酸分子相关联的错误率以及与最终产物核酸分子相关联的错误率(例如，(1)已针对正确序列加以选择的合成核酸分子或(2)经组装的化学合成核酸分子的错误率)。这些错误可来自化学合成方法、组装方法和/或扩增方法。可以通过如选择具有正确序列的核酸分子、纠错和/或改进型化学合成方法等方法去除或预防错误。在一些情况下，本发明的方法将组合错误去除方法和预防方法以产生具有相对少数目错误的核酸分子。因此，通过本发明方法产生的经组装的核酸分子可具有约1/2,000个碱基至约1/30,000个碱基、约1/4,000个碱基至约1/30,000个碱基、约1/8,000个碱基至约1/30,000个碱基、约1/10,000个碱基至约1/30,000个碱基、约1/15,000个碱基至约1/30,000个碱基、约1/10,000个碱基至约1/20,000个碱基等的错误率。适用于本发明方法的一些纠错方法如下。2μl核酸(～150ng)与1μl10×分析缓冲液(tris200mm、kcl250mm、mgcl2200mm、nad5mm、x-1000.1％，ph8.3+/-0.05，在室温下)和5μl水混合。随后如下使核酸变性并再退火：98℃持续2分钟，4℃持续5分钟，37℃持续5分钟，随后维持在4℃下。1μlt7n1/tth连接酶混合物(1782μl储存缓冲液(tris10mm、edta0.1mm、kcl50mm、x-1000.15％、bsa0.2μg/ml、丙三醇50％，ph7.4+/-0.05，在4℃下)、12μlt7n1(1∶150)(储备液0.92mg总蛋白质/ml)(在稀释之后6.1ng总蛋白质/μl)和6μltth连接酶(1∶300)(储备液1mg总蛋白质/ml)(在稀释之后3.3ng总蛋白质/ul)。混合物中所包括的酶的量和比例是通过在surveyor分析法(transgenomicinc.)的情形下使用错配底物进行滴定来测定。正确的量和比例是分解50％模板的量和比例，将1μlcelii(transgenomicinc.，surveyor试剂盒组分“surveyor核酸酶s”)添加到核酸中并混合。在一些实施例中，反应混合物可在10μl总体积中包含2μl核酸、1μltaq连接酶neb40单位、1μlt7e1neb10单位、1μl10×taq连接酶缓冲液。混合物随后在不加热盖罩的情况下在45℃下保温20分钟。随后将2μl经纠错的样品转移到pcr混合物并且进行pcr。纯化pcr产物并且将等分试样克隆到zero-blunttopo载体中用于测序。在第二轮纠错之后，使用purelinkpcr柱纯化试剂盒纯化所得pcr产物并随后如上所述进行纠错。对于第三轮纠错，将所得pcr产物纯化并再次进行纠错。将所得pcr产物纯化用于后续克隆和测序。大核酸分子相对易碎且因此易于剪切。一种用于稳定这类分子的方法是通过将其维持在细胞内。因此，在一些方面，本发明涉及在宿主细胞中组装和/或维持大核酸分子。已知进行同源重组相当高效的一群生物体是酵母。因此，本发明实践中所用的宿主细胞可以是酵母细胞(例如，酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)、毕赤酵母(pichia)、巴斯德酵母(pastoris)等)。酵母宿主由于其独特的遗传操纵工具集而特别适合于操纵供体基因组材料。酵母细胞的天然能力和数十年的研究已创建了用于在酵母中操纵dna的丰富工具集。这些优势在所属领域中是众所周知的。举例来说，酵母使用其丰富的遗传系统可以通过同源重组(一种不被许多易于获得的生物体享有的能力)组装和重新组装核苷酸序列。酵母细胞可用于克隆不能在其它生物体中克隆的大块dna，例如整个细胞、细胞器和病毒基因组。因此，在一些实施例中，本发明采用酵母遗传学的巨大能力，通过使用酵母作为宿主细胞进行组装和维持而生成大核酸分子(例如，合成的基因组)。酵母的接合能力有利于修改基因组和其它大核酸。酵母重组机器，在酵母接合期间被激活时，可用于生成文库，例如含有经克隆基因组或核酸的变异体的组合文库。举例来说，已构建数种不同细菌的酵母人工染色体(yac)文库(azevedo等人，《美国国家科学院院刊(pnasusa)》90，6047(1993)；heuer等人，《电泳》19，486(1998)；kuspa等人，《美国国家科学院院刊》86，8917(1989))。可以使用通用遗传密码在酵母中克隆大原核dna区段。毒性基因表达通常并不是在酵母中克隆核酸的障碍。举例来说，使用细菌和古细菌基因组的研究表明，因为真核生物使用与这些细菌不同的蛋白质表达机器，所以由克隆基因组表达的蛋白质对酵母宿主的损害风险极小。因此，本发明另外包括用于生成核酸分子(例如，合成的基因组)的方法，所述核酸分子在引入到非酵母细胞(例如，细菌细胞)中时赋予毒性表型。核酸分子可以由天然或合成片段连同酵母载体一起组装而成，随后转化到酵母细胞中或同时共转化到酵母细胞中。可以通过将这些基因组或已视需要经任选地操纵的其它核酸分子转移到相容的受体细胞中来创建新的生物体。因此，一个实施例提供合适的技术用于将基因组和其它核酸分子转移到酵母宿主细胞中，在宿主细胞内修改基因组同时维持其稳定性和完整性，以及将经克隆和操纵的基因组从酵母宿主细胞移植回到更紧密地类似于原始供体(例如，获得核苷酸序列的生物体)的受体细胞中，如此进行创建。用于在酵母细胞中组装核酸分子的可商购产品是高阶遗传组装系统(lifetechnology，目录号a13286)。这是一种用于将多达10个dna片段(总计多达110千碱基长度)同时无缝组装到载体中的试剂盒。所述系统使用酵母高效接受和重组dna片段的能力。这极大地减少了dna的活体外操作并且消除对酶促处理(如限制性和连接)的需要，同时允许dna序列精确融合。试剂盒含有用于转化和从酵母纯化的材料，包括酵母选择性培养基和用于质粒扩增正确克隆株的感受态大肠杆菌。核酸分子的组装和维持将通常涉及核酸分子的生成或插入到细胞中，所述含有核酸分子如一个或多个复制起点(例如，在不同细胞类型中起作用的两个复制起点)和一个或选择标记(例如，一个或多个阳性选择标记和/或多个阴性选择标记中的一个)等元件。引入到细胞中用于组装的核酸分子将通常具有某些特征以使其以特定次序组装。一个特征是在所组装的核酸分子之间的末端序列同源性。经组装的核酸分子可以引入到位于细胞的其它核酸分子中(例如，病毒基因组、核基因组、细胞器基因组、细菌染色体等)。在此类情况下，如复制起点、着丝粒等功能元件将一般存在于位于细胞内的其它核酸分子中。因此，本发明在某种程度上提供与核酸分子的组装和所得组装件插入到其它核酸分子中相关的组合物和方法。在一些情况下，可以采用经部分和完全组装的核酸分子的基于标准连接酶的接合。举例来说，经完全组装的核酸分子可以使用接近于其末端的限制酶位点生成。这些核酸分子可随后用一种更合适的限制酶处理以生成例如一个或两个“粘性末端”。这些粘性末端分子可随后通过标准限制酶-连接酶方法引入到载体中。在惰性核酸分子仅具有一个粘性末端的情况下，可使用连接酶进行“非粘性”端的钝端连接。经组装的核酸分子还可包括赋予所期望特性的功能元件(例如，复制起点、可选标记等)。在许多情况下，经组装的核酸分子将由多个单独的核酸区段与一个作为载体(例如，线性载体)的区段组装而成。出于说明的目的使用图8的示意图，此方法可以通过将多个(例如，两个、三个、五个、八个、十个、十五个、二十个、三十个等)期望组装的“重叠”核酸片段连同宿主载体一起共转化到宿主细胞中来进行。在此情况下，每个片段含有与引入到宿主细胞中的其它核酸区段的区同源的两个区。核酸区段之后例如通过经由同源区的同源重组转化到宿主细胞中。在图8所示的实例中，结果是经组装的闭合环状核酸分子。在图8所示的说明性实例的一种变化形式中，环状细菌基因组的重叠片段连同线性酵母载体一起被共转化到酵母宿主细胞中。同样，酵母载体在其末端含有部分细菌基因组的同源区。在将基因组片段和酵母宿主载体引入到宿主细胞中后，片段和载体重组，由此接合基因组片段和宿主载体。图8中所示的方法部分依赖于选择可复制的闭合环状核酸分子的组装件。类似选择机制陈述在美国专利公开第2004/0219516a1号中(参见例如本申请的图20)，其公开内容以引用的方式并入本文中。当然，利用本发明方法组装的核酸分子不必总是生成闭合环状核酸分子。可以通过本发明方法生成的其它核酸分子包括线性质粒(例如，可以线性形式复制的质粒)和染色体。图8中所示类型的活体内组装系统可以由两个核心组分构成：(1)用于组装的核酸区段和(2)合适的宿主细胞。在某些实施例中，所需功能元件(例如，复制起点、可选标记等)未呈现在用于组装的核酸区段中，载体可以作为额外核酸区段而被包括。有待组装的片段将一般含有在其末端重叠的序列。在一个实施例中，重叠序列大致10bp；在其它实施例中，重叠序列可以是15、25、50、60、70、80或100个碱基对等(例如，约10个至约120个、约15个至约120个、约20个至约120个、约25个至约120个、约30个至约120个、约40个至约120个、约10个至约40个、约15个至约50个、约40个至约80个、约60个至约90个、约20个至约50个等碱基对)。为了避免错误组装，片段当中的个别重叠序列应不重复或紧密匹配。由于同源重组不需要参与的核酸分子或区之间的100％序列一致性，所以每一端应足够不同以防止错误组装。另外，打算彼此进行同源重组的末端应共有至少90％、93％、95％或98％序列一致性。在活体内组装方法中，使用标准转染技术将所有有待组装的片段的混合物用于转染宿主重组和组装细胞。混合物中的片段分子的数目比有待转染的培养物中细胞数目的比率应足够高，以允许至少一些细胞接受比混合物中存在的不同片段更多的片段分子。因此，在大多数情况下，转染效率越高，存在的细胞数目将越大，所述细胞含有形成最终所期望的经组装的核酸分子所需的所有核酸区段。沿着这些路线的技术参数陈述在美国专利公开第2009/0275086a1号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。接合不共有末端序列同源性的双链核酸分子的组装方法的一个实例在图5中示出。在此实施例中，使用单链“拼接核酸分子”将两个双链片段引入到线性载体中。在某种意义上，这是五个核酸区段的组装，其中一个区段是载体，两个区段是两个拼接核酸分子，并且最后两个区段是标记为片段1和片段2的区段。除了有助于其它核酸分子接合之外，拼接核酸分子将短的插入物(例如，九个碱基对)引入到经组装的核酸分子中。含有这些特征的可商购的产品是高阶遗传组装系统(lifetechnology，目录号a13286)。除了本文所描述的其它方法以外，组装方法可以是小型化和/或自动化的。实际上，在许多情况下，当所组装和/或引入到载体中的核酸分子是以较低总数存在时，小型化将是所期望的。用于组装和如将核酸分子插入到载体中等方法的一种可实现微混合的方式是通过电润湿，如本文别处所述。在一些工作流程中，混合核苷酸序列不同的寡核苷酸并组装。举例来说，微孔板的孔可含有有待组装的寡核苷酸混合物并且来自这些孔中的每一个的流体可以被移出混合在组装腔室(例如，微孔板的孔)中。在许多情况下，所采用的流体量将太少而不方便移液(例如，在纳升范围中)。一种用于转移流体的方式是使用声能。声能液体转移的一种形式称为声学液滴喷射。声学液滴喷射使用超声脉冲移动小体积(例如，纳升或皮升)的流体(通常)而不与流体本身进行实体接触。此技术通过将声能集中到流体样品中以便喷射小到皮升的液滴而起作用。已显示声学液滴喷射技术不显著损坏生物分子，并且因此可用于转移蛋白质、高分子量dna和活细胞而无明显的损坏或成活力损失。此技术往往与具有平坦底部的流体容器一起效果最佳。在声能液体转移方法中，声波将液滴从源位置(例如，微孔板的孔)喷射到源位置上方的表面(例如，另一微孔板的孔)上。声能液体转移系统(例如，声学液滴喷射系统)可从labcyteinc.购得(加利福尼亚州森尼韦尔(sunnyvale，ca)，94089)。与声能液体转移相关的技术陈述在美国专利第6,612,686号中。本发明因此还包括一种用于由寡核苷酸组装核酸分子的方法，所述方法包含：(a)合成寡核苷酸；(b)将合成的寡核苷酸收集在两个或更多个初级反应容器(例如，孔或微孔板)中；(c)在两个或更多个初级反应容器中进行第一聚合酶链反应(pcr)(或pcr反应系列)或其它基于热循环的方法以生成两个或更多个核酸分子子组合件；(d)(例如，通过声能液体转移)将流体从两个或更多个初级反应容器中的每一个转移到一个或多个次级反应容器；以及(e)在一个或多个次级反应容器中进行第二聚合酶链反应或其它基于热循环的方法以生成核酸分子。出于说明的目的，三十个具有40个核苷酸的寡核苷酸各自可以在上述步骤(a)中生成。这三十寡核苷酸中的各十五个可以转移到两个不同初级反应容器，以通过例如第一pcr反应(步骤(c))生成两种具有700个碱基对的双链子组合件。含有这两种子组合件的流体可随后通过声能液体转移而转移到次级反应容器中，随后进行例如第二pcr反应(步骤(e))以生成1360个碱基对长度的核酸分子。本发明因此包括使用声能液体转移将流体从一个位置移动到另一个的工作流程。这些流体可含有例如单个寡核苷酸、寡核苷酸混合物、经部分组装的核酸分子等。上文例示的工作流程对于许多其它复杂的分子生物学工作流程来说的典型的，其整合了以下步骤：(1)第一液体操作步骤以组合一种或多种分子和一种或多种试剂，(2)第一热保温或热循环反应以组装、扩增或修改分子，(3)第二液体操作步骤以组合从步骤(2)获得的经组装、经修改或经扩增的分子并视需要添加其它试剂，以及任选地(4)第二热保温或热循环反应以进一步处理经组合、经组装或经修改的分子。在某些情况下，液体操作和热保温的交替步骤可以重复一次或数次。在由较短单链核酸分子组装较大双链核酸分子的一实施例中，这类工作流程可包含以下步骤：(1)液体操作以使多个单链核酸分子与一种或多种酶和扩增试剂组合，(2)第一热循环反应以将单链核酸分子酶促组装成双链亚片段，(3)第二液体操作步骤以组合从步骤(2)获得的各种亚片段并添加用于纠错和扩增的试剂，(4)包含纠错和亚片段组装步骤的第二热保温，并且任选地其中步骤(3)和/或(4)重复至少一次。在将要转移小体积的工作流程中，可以使用如上所述的声学液体能量转移进行一个或多个液体操作步骤。市售声学液体能量转移平台(如液体处理器，labcyteinc.，加利福尼亚州森尼韦尔)通常使用的反应容器或多孔板类型可具有与用于热循环的反应容器或多孔板类型不同的规格。举例来说，标准pcr循环仪中所用的多孔板可能需要具有高电导率的薄壁，而声学液体能量转移可能需要具有相当低电导率的平底多孔板。因此，液体操作(使用声学液体能量转移)和热循环的交替步骤无法在相同类型的反应容器或多孔板中进行。一旦液体已通过声学喷射从“源板”转移到“目标板”，反应混合物就需要从目标板转移到另一类型的容器或板，因为平底目标板与常规pcr循环仪并不相容。这类常规工作流程在图49(左侧流程图)中示出。本发明人已发现，当将平底目标板用于如实例12b中所述被配置成在平坦热块下操作的平板式循环仪(如proflextmpcr系统，马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司(thermofisherscientific，walthamma))时，可避免这类从目标容器或板到热循环相容的容器或板的额外液体转移。如图49右侧流程图中所示的这类改进型工作流程，允许使用一种类型的反应容器或板(例如，平底384或1536孔板)进行声学液体转移和后续热保温，从而节省时间、材料和试剂。这类改进型配置可以应用于使用液体操作和热保温的后续或交替步骤的任何工作流程，包括任何类型的组装反应、基于传统限制性/连接的克隆、纠错、用于毛细管电泳测序的样品制备反应、乳液pcr等。这类工作流程的可扩展性通常受并行地单独操作大数目或体积的样品的能力限制。另外，这类工作流程通常由于典型液体操作溶液的操作体积而具有成本限制。如上所述，提供的溶液使得使用者能够将液体操作和热保温/循环高效组合在微量兼容性自动化格式中，由此提供改进这些工作流程的重要机会。图16是用于处理本发明的核酸分子的一个仪器实施例的框图。在此图左上方的是载体油储槽1600和从次储槽输送油的管道1601。载体油输送经过一系列含有试剂的额外储槽1602。环状结构表示个别试剂储槽。示例性试剂是核酸分子、pcr酶、引物和载体以及例如其它模块3相关组分。试剂将通常呈在油障壁之间输送的水性小泡形式。由载体油输送的试剂随后输送到发生混合的混合腔室1603。试剂随后移动到数字pcr台1604上。管道1601行进在发生变性的加热块1605与随后发生退火和pcr的冷却块1606之间。在第一时间之后，每次小泡行进至冷却块1606时，发生pcr扩增。在离开数字pcr台1604之后，小泡移动经过额外试剂储槽1607以便任选添加更多试剂(例如，缓冲剂、纠错组分等)，随后移动到另一任选的混合腔室1608上。小泡随后移动到任选的储存位置1609。在大于一种核酸分子将组装成较大分子的情况下，用于组装的个别核酸分子将通常在不同时间到达储存位置1609并且将需要隔离一段时间直到其它组分到达。核酸分子随后移动到另一数字pcr台1610并且再次在冷却块与加热块之间循环。纠错反应可发生在数字pcr台1610中。最后，将经组装的核酸分子输送到界面出口1611以便收集并且将废料(例如，载体油)收集在废料储槽1612中。图16中所呈现类型的系统可同时处理多个样品。这些样品可隔离在载体油之间并且经过串联系统。图16框图未示出计算机系统、光学组件、阀门和与系统自动化相关的其它组件。光学元件以及其它元件(例如，电学元件)可用于追踪试剂小泡和各种点在流动系统中的位置并鉴别。这些试剂小泡将一般含有预定序列的核酸分子。因此，本发明包括用于同时处理(例如，依序处理)多个样品的方法模块4在分离和处理之后，可以使用本文所描述或所属领域中已知的方法将经组装对核酸分子另外移植到受体细胞中。可使用的方法包括原生质体和原生质球融合、接合转移(例如，细菌接合)、病毒感染、电穿孔和仙台病毒介导的细胞融合。因此，本发明包括用于将合成和/或组装的核酸分子转移到细胞的方法。一种用于生成酵母原生质体融合物的方法陈述在nakazawa和iwano，使用抗药性标记和报告基因在酿酒酵母中高效选择通过原生质体融合的杂交体(efficientselectionofhybridsbyprotoplastfusionusingdrugresistancemarkersandreportergenesinsaccharomycescerevisiae)，《生物科学与生物工程杂志(j.biosci.bioeng.)》98：353-358(2004)中。另外，已开发出用于原核细胞和真核细胞融合的方法。(参见例如gyuris和duda，通过细菌小细胞原生质体融合高效转化酿酒酵母(high-efficiencytransformationofsaccharomycescerevisiaecellsbybacterialminicellprotoplastfusion)，《分子细胞生物学(mol.cell.biol.)》6：3295-3297(1986)。如这些方法可用于本发明的实践中以便在细胞之间转移核酸分子而不使核酸分子暴露到细胞外环境。可使用的其它方法包括天然感受态、基因枪、电穿孔、杆状病毒介导的转导和iii型分泌系统。示例性移植方案描述在pct公开案wo2011/109031中。一种用于将来自供体的支原体基因组移植到支原体受体的方法是由lartigue等人，细菌中的基因组移植：将一物种变成另一物种(genometransplantationinbacteria：changingonespeciestoanother)，《科学(science)》317：632(2007)描述。此研究涉及使用聚乙二醇介导的转化通过裸dna形式的基因组移植而将细菌细胞的基因组用另一物种的基因组完全替换。所得受体细胞与供体菌株表型相同。这类方法可用于将通过本发明方法构建的经组装的核酸分子转移到受体细胞。受体细胞通常将基于其支持经组装的核酸分子的基因表达的能力来加以选择。举例来说，在细菌基因组已组装在具有合适遗传操纵系统的真核宿主细胞(例如，酵母)中之后，随后可能必需或期望将基因组移植回到细菌受体细胞中。翻译和转录中的差异以及不同的密码子使用在其它因素当中尤其可防止供体基因产物在宿主细胞内表达。受体细胞因此可以属于与供体细胞或生物体相同的物种或类似的物种。在许多情况下，受体细胞将属于与供体相同的目或界。然而，在需要在不相关细胞类型中表达的情况下，初始基因设计可包括密码子和序列优化策略以允许在不同受体细胞中表达。额外应用如所属领域的技术人员应了解，核酸分子以微量数量(例如，飞摩尔至纳摩尔数量，如约0.001飞摩尔至约1.0纳摩尔、约0.01飞摩尔至约1.0纳摩尔、约0.1飞摩尔至约1.0纳摩尔、约0.001飞摩尔至约0.1纳摩尔、约0.001飞摩尔至约0.01纳摩尔、约0.001飞摩尔至约0.001纳摩尔、约1.0飞摩尔至约1.0纳摩尔、约1.0飞摩尔至约0.1纳摩尔、约1.0飞摩尔至约0.01纳摩尔、约1.0飞摩尔至约0.001纳摩尔、约10飞摩尔至约1.0纳摩尔、约10飞摩尔至约0.001纳摩尔、约20飞摩尔至约1.0纳摩尔、约100飞摩尔至约1.0纳摩尔、约500飞摩尔至约1.0纳摩尔、约1纳摩尔至约800纳摩尔、约40纳摩尔至约800纳摩尔、约100纳摩尔至约800纳摩尔、约200纳摩尔至约800纳摩尔、约500纳摩尔至约800纳摩尔、约100纳摩尔至约1,000纳摩尔等)产生。本发明可用于制备微阵列。这类微阵列可以多种方式生成，包括通过将核酸分子沉积在支撑物(例如，固体支撑物，如销售的平坦支撑物)上或通过直接在支撑物上合成核酸。在一个实施例中，图2a和2b中所示的板可经修改以使得基底/底部被设计用于在其表面上合成核酸。任选地，基底可构造成可去除的，从而产生例如平坦微阵列。在大多数这类情况中，图2a和2b中所示的珠粒将在核酸合成期间被省略。因此，本发明包括用于生成微阵列的方法。用于印刷微阵列的方法陈述在美国专利第5,807,522号和第7,211,148号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。这类方法可用于本发明实践中以例如通过沉积如本文所述产生的核酸分子而产生微阵列。本文所述方法的一个优势是其模块性。举例来说，形成不同较大核酸分子的子部分的核酸分子可在相同板上排列产生。因此，本发明的方法允许同时产生核酸分子，随后选择个别合成的核酸分子用于后续处理(例如，汇集、裂解脱保护和组装)。因此，本发明的方法包括那些同时产生(例如，化学合成)核酸分子，随后组装成两个或更多个(例如，两个至十个、三个至十个、四个至十个、五个至十个、两个至三十个、五个至三十个、十个至三十个、五个至五十个等)较大的核酸分子的方法。在某些实施例中，通过本发明方法合成的核酸分子或多个核酸分子可以是引物和/或探针。可例如使用如本文所述的固体支撑物微量产生引物和/或探针。引物引发可作为扩增反应的一部分的核酸延伸反应。探针用于检测目标核酸序列。因此，探针在检测方法中用于直接或间接检测目标核酸序列。引物和探针通常具有与目标核酸序列杂交或以其它方式结合于目标核酸序列的预定核苷酸序列。在示意性实施例中，探针包括标记，如荧光标记。举例来说，可以将控制机构连接到本发明的方法中所用的固体支撑物或固体支撑物阵列，其中目标核苷酸序列被输入到所述控制机构中。控制机构可用于指导添加核酸合成反应物的顺序，以便合成具有目标核苷酸序列的核酸分子。探针和引物由于与目标核酸序列享有序列一致性而与目标核酸序列杂交或以其它方式结合于目标核酸序列。举例来说，引子或探针可与目标核酸序列享有80、85、90、95、96、97、98、99、99.5或100％相连序列一致性。如所属领域中已知，引物和探针与其目标核酸序列在严格和通常高度严格条件下杂交。可以将标记附接到本发明的引物和/或探针的5′端核苷酸、3′端核苷酸或任何内部核苷酸。在某些说明性实施例中，标记是荧光团。大量荧光团是所属领域的技术人员已知的并且可以包括在本发明的方法和组合物中。参见例如cardullo等人，《美国科学院院报(proc.natl.acad.sci.usa)》85：8790-8794(1988)；dexter，d.l，《化学物理杂志(j.ofchemicalphysics)》21：836-850(1953)；hochstrasser等人，《生物物理化学(biophysicalchemistry)》45：133-141(1992)；selvin，r，《酶学方法(methodsinenzymology)》246：300-334(1995)；steinberg，i.，《生物化学年鉴(ann.rev.biochem)》，40：83-114(1971)；stryer，l.，《生物化学年鉴》，47：819-846(1978)；wang等人，《四面体快报(tetrahedronletters)》31：6493-6496(1990)；wang等人，《分析化学(anal.chem.)》67：1197-1203(1995)。举例来说，荧光团可以是biosearchblue、fam、tet、cal荧光染料、joe、vic、hex、quasar染料、cy染料、ned、tamra、rox、德克萨斯红或pulsar染料。这些染料和包括这些染料的核酸合成反应物可以从例如biosearchtechnologies，inc.、glenresearch或lifetechnologies购得。在说明性实施例中，通过本文所提供的方法合成的引物是pcr引物。在某些实施例中，引物在其5′端或3′端标记有标记。举例来说，引物可以是lux引物、scorpion引物、amplifluor引物和/或plexor引物。在某些实施例中，本发明提供一种用于合成多个引物和探针集合(例如，对)的方法。可以使用本文所述的板(例如，图2a和2b中所示的通用格式板)微量产生引物和探针集合(例如对)。引物和探针集合(例如，对)包括一个或多个引物引发延伸反应，产生核酸延伸产物，即引物和探针集合(例如，对)的一个或多个探针的目标核酸序列。换句话说，在引物和探针集合(例如，对)中，探针通常结合到由引物产生的扩增产物。在说明性实施例中，引物和探针集合(例如，对)包括一对pcr引物和结合到由使用所述引物对的扩增反应产生的扩增产物的探针。举例来说，引物和探针集合(例如，对)可包括两个pcr引物和一个5′核酸酶探针或一个分子信标探针，所述探针结合到在pcr反应中使用pcr引物产生的扩增产物。如上文所指出，本发明的方法可产生核酸分子阵列，所述核酸分子如引物、探针和/或引物和探针集合(例如，对)。举例来说，核酸分子可在位置阵列中合成，使得每个位置包括一个或多个核酸分子，如引物、探针和/或引物和探针集合(例如，对)。阵列可包括100、200、250、500、1000、10,000、100,000、1,000,000或10,000,000个/cm2密度的引物、探针以及引物和探针集合(例如，对)。使用本发明方法产生的核酸分子阵列中的核酸分子总数可包括例如100、200、250、500、1000、10,000、100,000、1,000,000、10,000,000、100,000,000、1，000,000,000或10,000,000,000个引物、探针和/或引物和探针集合(例如，对)。大于一种引物和探针集合(例如，对)可包括在阵列位置中，使得引物和探针集合(例如，对)被设计成进行多重反应，如多重pcr反应。本发明的探针可标记有单个染料，如单个荧光团。本发明的探针可以是fish探针。本发明的探针可以是扩增反应中所用的探针。举例来说，这些探针可以是双标记探针。在某些说明性实施例中，双标记探针包括作为供体-受体能量转移对的标记，如fret对。当供体(荧光团)是利用供体-受体能量转移的探针的一个组分时，优选地选择本发明的供体荧光部分和淬灭剂(受体)，使得供体和受体部分在供体部分被激发时展现供体-受体能量转移。在选择荧光团-淬灭剂对时应考虑的一个因素是它们之间的供体-受体能量转移效率。在许多情况下，供体部分与受体部分之间的fret效率为至少10％、至少50％或至少80％。fret的效率可易于使用本文所述和所属领域中已知的方法凭经验测试。在一些情况下，供体-受体对可包括荧光团和淬灭剂。淬灭剂可为深色淬灭剂。因此，本发明的探针可包括bhq染料或dq染料(epoch)作为淬灭剂。在其它实施例中，淬灭剂可以是dabcyl或tamra。使用本发明的方法和系统合成的引物和探针可包括可包括使核酸稳定杂交的部分(例如，嵌入剂、小沟结合部分、经稳定部分(例如，炔基部分和氟烷基部分)修饰的碱基)和构象稳定部分，如美国专利申请公开第2007/0059752号中所公开的那些，其公开内容以引用的方式并入本文中。引物和探针可包括嵌入剂，如吖啶。在其它实施例中，使用本发明的方法和系统合成的引物和探针可以是锁核酸(lna)探针或肽核酸(pna)探针。使用本发明的方法和系统合成的双标记探针可用于扩增反应中，如实时pcr反应。说明性实例中的双标记探针是水解探针，如5′核酸酶探针(参见例如livak等人，《pcr方法和应用(pcrmethodsappl.)》，4：357-562(1995)；和美国专利第5,538,848号)、分子信标(参见例如mhlanga，《方法(methods)》，25：463-472(2001))、scorpions(参见例如saha，《病毒学方法杂志(j.virol.methods)》，93：33-42(2001))或杂交探针(参见例如美国专利第7,670,832号)。在某些实施例中，本发明的引物和探针被用于数字扩增反应，如数字pcr反应。通过本发明方法合成的引物可以是5至50个核苷酸长度，通常是10至30个并且更通常是15至30个核苷酸长度。本发明的探针可以是5至100个、10至50个、10至30个或15至30个核苷酸长度。本发明的方法可以利用所属领域中已知用于合成核酸分子的一般化学物质和化学方法，所述核酸分子包括一个、两个或更多个标记，如荧光标记。举例来说，这类方法可利用经修饰以包括这类标记的亚磷酰胺和/或固体支撑物。示例性固体支撑物例如可包括经由连接基团结合到固体支撑物的至少一个淬灭剂。额外示例性实施例可利用固体支撑物或亚磷酰胺官能化部分使根据本发明用目标核酸分子合成的核酸分子的双重、三重或更高阶聚集(例如，杂交)稳定。在某些实施例中，本发明的引物和/或探针被用于实时pcr分析，如基因表达分析或基因分型分析，例如snp基因分型分析。可以使用本文所提供的方法生成浓度为例如1nm至1m、1mm至1m的探针。示例性浓度可以是100mm。可以冻干通过本文所提供的方法生成的探针和/或尤其引物。举例来说，1-1,000,000皮摩尔的引物可以在如管道或孔等反应容器中冻干或可以在位置阵列的一点上干燥。在一个实施例中，本发明提供一种用于核酸合成点方法，其包括在微孔内组合核酸合成反应物并且在微孔内生成核酸分子。微孔可以连接到控制器(如计算机处理器)，其中一种或多种核酸分子的核苷酸序列被输入到控制器中或以其它方式存在于控制器的计算机存储器中。控制器可以连接到或以其它方式与可以在广域网上提供的核酸分子设计和排序功能连通。举例来说，核酸分子设计和排序功能可以提供在互联网上。在某些实施例中，本发明的方法包括hplc-纯化步骤。另外，本发明的方法可以在经iso和/或gmp认证的条件下进行。在一些实施例中，使用微孔板进行核酸分子合成。本发明的方法和设备还可用于文库制备。这些文库可含有一个或多个点突变或高度趋异的分子(例如，编码具有不同功能活性的蛋白质的核酸分子)。沿着这些路线，本发明包括用于生成文库的方法，其中所有或一些文库成员是化学合成的并且因此不是由细胞核酸产生的。可通过本发明方法生成的文库类型包括cdna文库、基因组文库、组合文库、点突变文库和一个或多个这类文库的组合。如上文所指出，在一些实施例中，本发明包括使用生物信息学信息产生所生成的cdna文库等效物以及文库的方法。出于说明的目的使用图11中所示的示意图，可以根据本文所述的方法合成文库并且必要时组装。文库成员可以随后被插入到非文库核酸分子(例如，载体、细胞染色体等)中。可以通过多种方式促成插入，如连接(例如，“粘性末端”连接)。本发明包括用于生成文库的方法以及文库本身。这些文库中的一些属于难以或不可能通过标准文库产生方法产生的类型。一种这样的类型是部分cdna文库。部分cdna文库(也称为“cdna等效物”文库)可为通过以生物信息学方式选择特定cdna包括在文库中来生成。可随后合成核酸分子并且必要时组装形成文库。cdna文库通常含有相当于细胞内的rna转录物的dna分子。在许多情况下，这类文库偏向含有多聚腺苷酸尾部的转录物。这类文库中呈现的mrna通常含有多个与个别编码区对应的cdna。当基因组编码区的剪接变异体是通过剪接事件来生成时就是如此。本发明允许产生具有“排它性”代表的cdna文库(以及基因组文库)。举例来说，因为与排除相比核酸分子是被选择包括的，所以与以下对应的dna分子可从文库排除：核糖体rna、球蛋白rna、trna和指定mrna。因此，本发明包括用于产生具有成员偏向并包括排它性成员的cdna和基因组文库的方法以及文库本身。另外，本发明的文库包括含有指定核酸分子的那些。举例来说，本发明包括用于产生cdna文库的方法，所述文库含有通过标准方法生成的cdna文库中所呈现的成员子集。出于说明的目的，假定特定哺乳动物细胞类型具有平均15,000个包括剪接变异体的不同mrna转录物，并且有人试图使用含有125个cdna分子的cdna文库，所述cdna分子与对应于35种不同激酶的转录物的所有已知剪接变异体对应。在另一情况下，有人试图筛检编码相同野生型编码序列的变异体的核酸分子集合。出于说明的目的使用图12a，野生型cdna的氨基酸85至95和编码序列在图顶部示出。氨基酸88至91表示一个区，其被预测为是连接两个功能性结构域的柔性连接子。在此情况下，产生的核酸分子集合编码在位置88至91(连接子区)具有不同但是指定氨基酸的蛋白质。核酸分子集合，如图12a中所示的那些可以多种方式产生。一种方式将一般过度包含，因为将通常生成额外核酸分子。此方法采用“脏瓶”合成。为了生成变异体分子，如图12a中所示的那些，混合用于在特定位置添加碱基的试剂。因此，当将要在密码子88的第一和第二位置处添加碱基时，可使用用于添加c和g的试剂的混合物。可调节这些试剂的比率以有利于c或g添加，或可调节比率以便引入等量的c和g。在一部分群体中，还将生成密码子cgt(精氨酸)。可生成如图12a中所示的那些核酸分子集合的另一方法是通过合成个别变异体序列作为单独的核酸区段。这允许生成仅编码所期望的变异体群体成员的核酸分子(除合成错误以外)。本发明还包括与野生型分子相比密码子改变的个别核酸分子和核酸分子集合，以及用于产生这类分子的方法。在一些方面，生成密码子改变的文库，其中集合中的一些或所有(在许多情况下，所有或大部分)核酸分子与天然野生型编码序列相比密码子改变。这显示了本发明的方法优于标准文库构建方法的一个相当大的优势。在标准文库构建方法下，文库是由天然存在的核酸分子(例如，基因组dna、mrna等)构建而成。本发明的方法允许使用生物信息学信息高效构建文库。结果是所生成的任何集合中的个别核酸分子可用“定制的”核苷酸序列生成。出于说明的目的使用图12b，可以生成关于相同编码序列的含有不同密码子的核酸分子集合并随后筛选所期望的特征(例如，升高或降低的表达水平)。当蛋白质的过表达对于其中产生所述蛋白质的细胞或宿主生物体极度兴奋时，降低表达水平可能是所期望的。因此，密码子选择可用作表达调控机制。本发明的方法还可用于生成大量引物用于多重扩增(例如，pcr)。通常，这类引物长度将在15与100(例如，15至90、25至90、25至80、25至70、25至60、25至50、30至90、30至60等)个核苷酸之间。另外，引物还可含有条形码以给经扩增的核酸分子加标签，用于例如稍后鉴别以及在合成操作期间和之后追踪引物和引物对。在一些情况下，将生成500个至50,000个、1,000个至50,000个、2,000个至50,000个、5,000个至50,000个、5,000个至40,000个、5,000个至30,000个、5,000个至100,000个、5,000个至300,000个、5,000个至500,000个、5,000个至1,000,000个、5,000个至5,000,000个、10,000个至100,000个、10,000个至500,000个、10,000个至800,000个、20,000个至100,000个、20,000个至500,000个等引物对。本发明包括制备可用于方法中的引物，如生命技术公司的ampliseqtm产品(参见例如目录号4472395)。如这样的产品采用多重pcr扩增特定核酸分子。经扩增的核酸分子可随后用于下游方法(如测序)以鉴别起始样品中所存在的核酸。在一些情况下，经修饰的核酸碱基和/或通常与dna无关的天然碱基(例如，脱氧尿苷)以合成方式并入到引物序列中作为“第五(或更大)瓶”，从而将特定特性赋予个别引物和/或引物集以便于扩增产物在测序之前的下游处理，或以条形码的方式进一步赋予个别引物和/或引物集的编码以有助于和解决通常来自样品混合物的复杂序列分析。本发明因此提供用于产生引物池的方法以及引物池本身。引物池可用于扩增rna和/或dna群体或亚群。举例来说，可以产生引物池以允许扩增代表细胞的整个核基因组、单个核染色体、一套核基因或区(例如，一套染色体基因座)、线粒体基因组或叶绿体基因组以及其组合的基因组dna。本发明因此包括用于特定应用(例如，上文刚刚陈述的应用)的引物的生物信息学设计。本发明还提供用于产生引物池以扩增特定rna群体的方法。在本发明的一个实施例中，引物池被设计成扩增由细胞产生的所有mrna分子或mrna分子亚群(例如，编码激酶、磷酸酶等的mrna)，但是任选地不扩增其它rna分子(例如，trna、rrna、hnrna等)。这类引物池可随后用于表达分析(例如，测量在各种条件下的表达水平)。可以使用例如微阵列或测序平台进行表达分析。本发明因此包括表达分析方法。在一些实施例中，这类方法包括一个或多个以下步骤：(a)以生物信息学方式设计引物池，(b)合成引物池的引物对，(c)使引物池与来源于细胞的含有核酸(例如，mrna)的样品接触，(d)扩增样品中与引物对对应的核酸分子以及(e)分析所得经扩增的核酸分子。在许多表达分析应用中期望减少或消除与rdna对应的核酸分子，因为许多样品中富含rrna。其它rrna扩增减少方法陈述在美国专利公开第2008/0187969号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。本发明还包括上文用于额外应用的变化形式，如鉴别基因组核酸中的突变的多重方法。因此，本发明另外包括用于鉴别突变(包括癌症筛检)的方法和组合物。本发明包括用于产生各种数目的引物(在许多情况下，引物对)的方法。可以通过本发明的方法以单独实体形式和/或在混合群体中制备的引物数目介于5至500,000、500至500,000、1,000至500,000、5,000至500,000、10,000至500,000、20,000至500,000、30,000至500,000、5,000至250,000、5,000至100,000、5至5,000、5至50,000、5,000至800,000、5,000至1,000,000、5,000至2,000,000、10,000至2,000,000、20,000至1,000,000、30,000至2,000,000等范围内。本发明因此提供用于快速设计、配置和合成所定义的引物集的方法，所述引物集用于特异性测定用于广泛多种分析、样品集和实验设计的区域的遗传组成和表征。本发明的这一方面是结合本文所述的核酸分子合成方法使用生物信息学的部分结果。具体来说，已对相当多基因组的全序列进行测序。此序列信息与本文所述的核酸合成方法(以及其它方法)组合使得基因组和转录组分析更详实。如上文陈述的那些多重方法提供一种用于进行这类分析的方式。代表性实施例本发明的许多变化形式是可行的并且可以用于达成所期望的结果。许多这类变化形式可能涉及设计特征。在一些情况下，这类设计特征可用于方便操作者和/或节省成本(例如，减少试剂使用)。图9示出了可用于本发明的特定实施例中的电线圈的一个实施例。这类线圈的许多变化形式，许多描述在本文别处，可与本发明一起使用。如图9中所示的电线圈可以设计成具有以下示例性结构操作参数：最大电流密度3amps/mm2、双层扁平线圈、电线横截面5×2μm、10匝、内径(di)～10μm、外径(da)～180μm以及电线长度～6mm。表11电流(a)磁场强度(a/m)(近似于短线圈)0.000036.314390318电流(μa)30磁通量密度(t)7.9349e-06图9和表11示出了可在晶片上堆积的扁平双层线圈的示例性规格。如图9中所示的线圈可经设计以便与合成平台中的每个孔接触。另外，磁场的生成可用于从合成位点(例如，孔)提升珠粒。示例性磁场强度/通量密度值在表11中示出。像comsol(www.comsol.com)的fem程序可用于计算特定系统和格式的参数。在本发明的各种方面中使用的电极中可用的数种材料和与这些材料相关联的特性陈述在表12中。电极材料的选择将由许多因素决定，包括成本和各种设计规格以及功率要求。表12材料比电阻((ω＊mm2)/m)线圈电阻(ω)dc功率(μw)电压(v)铜1.68e-0210.0680.0090610.000302铝2.65e-0215.90.014310.000477金2.21e-0213.2840.0119560.000399本发明的实践中所用的电极(例如，电线圈)将经设计以满足使用其的特定应用。举例来说，当使用电极生成ega时，其将一般考虑以下加以设计：(1)施加(例如，局部施加)足够电流以允许在指定时间段内生成有效量的ega，(2)与电流施加相关联的加热限制。因此，一般将需要限制所用电流量以在增加极小过电流的情况下达到局部ph1.0。表13提供在特定孔参数下实现这点的计算。另外，如下文所陈述，在孔中产生ph1将需要施加1μa电流约1秒。这在工作电极上产生1ma/mm2的电流密度。电极的形状可变化极大并且可以是如图9中所示的线圈、圆盘、薄膜等。另外，本发明实践中所用的电极可以由许多化合物构成，包括铂、钯、铜、金、铝、铌、氧化铌、钨、钛、钽、钼、镍、铂、银、锰、钕、碳和硅，以及含有一种或多种上述元素以及其它元素的合金材料或化合物材料。图10示出了本发明的一种示例性设备格式。此图示出了两个泵1000经由管道1001递送流体以及气体(适当时)到流体通道1002，其在顶部以板1007为界。递送到设备的流体经由排出通道1003移出到排出管道1004，其通向废料收集器1005。泵1000连接到流体储槽(未示出)或气体储槽(适当时)，并且控制装置(未示出)调控何种流体或气体被递送到设备。控制装置还调控流体或气体接触核酸合成“芯片”1006的时间长度。三个核酸合成“芯片”1006在图10中可见，搁置在电极1008上。流体和/或气体与芯片接触并且电流通过芯片上期望发生化学反应的特定位置。如本文别处所述，许多试剂和洗涤材料可用于本发明的实践中。在许多情况下，所用试剂和材料将是允许产生核酸分子的那些。下部电极1008，如图9中所示，覆盖设备的整个基底。不是必须如此，一个或多个电极可以与每个孔或不止一个孔的一端相关联。与此电极(图10中显示为下部电极1008)相对，将通常存在一个或多个第二电极(图10中未示出)，允许电流流过整个芯片或流过芯片的孔。在许多情况下，这些第二电极将定位在芯片的个别孔上方，允许引导电流通过个别孔(参见图2a和2b)。流体通道1002可在表面层中形成，如孔。表面层可由聚合材料、无机材料或其组合形成。举例来说，表面层可由聚合材料形成。示例性聚合材料包括丙烯酸、含氟聚合物、乙烯乙酸乙烯酯(eva)或其任何组合。在一实例中，聚合材料是含氟聚合物。示例性含氟聚合物包括聚偏二氟乙烯(pvdf)、聚氟乙烯(pvf)、氟化乙烯丙烯(fep)共聚物、乙烯氯三氟乙烯(ectfe)共聚物、四氟乙烯、六氟丙烯和偏二氟乙烯的共聚物(thv)、四氟乙烯和全氟甲基乙烯基醚的共聚物(pfa或mfa)、在主链中具有氟化氧杂环戊烷的含氟聚合物、全氟醚或其任何组合。具体来说，含氟聚合物可以是在主链中具有氟化氧杂环戊烷的含氟聚合物，例如cytop。另外，聚合物涂层可以是无定形的，展现极小或无结晶度。在另一实例中，表面层由无机绝缘体形成。举例来说，无机绝缘体可包括硅、铝、铪、钽、锆或其任何组合的氧化物，可包括四原硅酸盐，可包括硅的氮化物，或可包括其任何组合。在一实例中，无机绝缘体可包括硅的氧化物。在另一实例中，无机绝缘体包括硅的氮化物。在某些实施例中，用于合成核酸的示例性微芯片是包含多个孔，如约20,000至约40,000个孔、或约35,000个孔、或35,440个孔的微芯片(例如，cmos芯片)。每个孔可以可操作方式连接到至少一个电极，并且每个孔被配置成容纳单分散珠粒，如直径范围介于约30μm至约40μm的单分散聚苯乙烯珠粒，其中所述单分散珠粒可以预负载有通用连接基团，如unylinkertm，用于核酸分子的合成。微芯片可另外包含微流体通道用于引入和去除流体或气体，如试剂和废料。微芯片可另外以可操作方式连接到控制装置，其调控何种流体或气体被递送到设备并且持续多长时间，以及施加到个别电极的电流量和电流时间长度，所述电极可例如用于如本文所公开的电解和/或用于生成电生成酸或电生成碱。在某些实施例中，可以配置本文所公开的微芯片，使得从微芯片的多个孔选择的单分散珠粒可以一起汇集到合适收集容器(如1536微孔板)的所选孔中用于进一步处理和组装。来自此实施例的微芯片的单分散珠粒可以所属领域中已知的任何方式(包括本文所公开的方式)进行汇集。图23a和23b示出了根据本发明的核酸合成微芯片2300的实例。微芯片2300包括数层，每层具有特定目的，如下文所论述。作为一个实例，这些层的结果是在18mm×18mm方形芯片上可单独切换约35,000个电极。由于芯片的内置逻辑，所以仅必须与外部控制仪器(未示出)进行很少(10-20个)电连接。微芯片2300包括粘合于印刷电路板(“pcb”)2325并且可通过适当电连接(如引线键合2340)与其电连接的cmos芯片2320。举例来说，cmos芯片2320可使用常规板上芯片技术粘合于pcb2325，其中使用引线键合连接芯片的小接触垫，芯片可随后用粘合剂(如胶合剂)囊封。cmos芯片2320可具有电路包埋其中的硅基底以将外部生成的电信号引导到所期望的一个或多个电极。通过使用cmos设计，可对每个电极进行个别寻址。在cmos芯片2320与一层或多层孔材料2330之间形成电极2305，使得电极2305的中心部分暴露在微孔2310内以用于电化学方法，并且电极2305的边缘在一侧以cmos芯片2320为界并在另一侧由孔材料2330覆盖以防止电极2305因电化学方法而脱离。电极2305可由铂或所属领域中已知的其它类似导电材料制成。在电极2305由铂制成的实例中，铂厚度可在约10nm与500nm或约100nm与约300nm之间。可使用其它厚度的电极2305，取决于电极所用的特定材料、电化学方法所用的特定流体和微芯片2300的具体排列。可使用不同排列将电极4305的一个或多个金属层(如铂层4302)连接到cmos部分4303的顶部金属层。在一些情况下，电极4305可以排列在中心或经移位的位置(相对于孔的中心)，分别如图43a和43b所指示。在这些示例性实施例中，可以在cmos运行结束时打开cmos芯片4303的钝化层(连同键合垫)以接近cmos芯片4303的顶部金属层。在图43a中，铂直接沉积在钝化层的大开口上，从而在铂与cmos金属之间形成大面积接触。在某些情况下，开口的直径可大于具有孔壁面4302的孔4301的直径。举例来说，在提供40-μm孔的情况中，开口直径可以是至少45μm。钝化层和铂层中的开口的边缘可以由孔层覆盖或密封。对于某些应用，可使用经移位的配置，如图43b中所示的配置。在此配置中，铂与cmos金属之间的连接经侧向移位在孔层下方。这类排列可保护连接不被在微流体工作流程期间可接触孔层的反应性溶剂、洗涤剂或化学物质降解。在一些实施例中，电极可具有不止一个接头。举例来说，第二接头可距第一接头特定距离或与第一接头相对排列(例如，在铂垫的相对端，如图43c中所示)。在提供两个(或更多个)接头的设置中，可根据cmos部分中的电路一起使用所述接头。这类排列可以用于测定或测量对于芯片的功能性可能至关重要的某些参数，如在一个或多个接头之间是否存在完整电路。举例来说，图43c的排列可用于测量垫是否正确沉积和连接和/或铂层是否未受损以允许使用跨越孔底部的铂基底作为电流通道使电流在第一与第二接头之间通过。这类功能性测试可以在晶片级下进行以测定特定芯片是否符合特定应用(如用于寡核苷酸合成)所要求的预定义的质量准则。举例来说，可以设立这类测试以区分功能性电极与非功能性电极，其中可以在微流体工作流程中避开或排除具有非功能性电极的芯片位置。在某些实施例中，每个微孔2310可容纳多孔微珠粒2315。微芯片包含多个孔，如约20,000至约40,000个孔、或约35,000个孔、或35,440个孔。微孔2310的高度可为约50-100μm或50-60μm，并且宽度大小足以容纳约10μm至50μm、约20μm至50μm、约25μm至约40μm、约30μm至50μm、约25μm至50μm、约30μm至40μm或约35μm大小的微珠粒。在一个实施例中，孔材料2330可包括大高宽比光致抗蚀剂材料，如所属领域中已知的su-8(基于环氧树脂的抗蚀剂)和其变异体。su-8是可旋转或散布的厚度范围从低于约1μm至高于约300μm并且可用标准接触光刻处理的粘性聚合物。su-8耐本发明中所用的许多化学物质。还可使用以层压膜形式销售的其它大高宽比光致抗蚀剂，如tmmf(tok)和suex(djdevcorp)。孔材料2330的其它实例是玻璃、陶瓷和硅，其可提供比su-8材料更大的耐化学性并且可以用mems制造可利用的标准技术(如干式或湿式蚀刻)微机械处理，使得玻璃/硅为约25μm至100μm、约25μm至75μm、约30μm至60μm或约50μm并且粘合于cmos芯片或整个cmos晶片(例如8英寸格式)。流体封盖2335可在孔材料2330的顶表面上形成和/或由粘合材料(如使用聚合物，例如弹性体或粘合剂结构2345)以可去除方式粘合，以提供流室2350将合成化学物质尽可能均匀地分布于孔并提供用于电化学反应(ega和气泡生成)的反电极(“ce”)。在某些实施例中，流室可为约150μm至约250μm高，其产生约10μl至约30μl的腔室体积。在某些实施例中，腔室体积可为约10-100μl，包括例如约13μl、26μl或52μl。如上文关于电极2305所论述，ce可由铂制成并且可构造成能够目视检查芯片。流体封盖2335可略微大于cmos芯片2320以便与ce进行电连接。图24a、24b和24c说明图23b的流体封盖2335的三个实例，其以横截面形式示出。在图24a中所示的一个实例中，流体封盖2335可以是包含在聚合物层2405(例如弹性体)与玻璃层2415之间形成的电极2410(例如，由如铂等导电材料制成的第二电极)的可再用封盖。流体封盖2335可包括一个或多个流体通道2420。流体封盖2335可牢固地贴附于芯片2320上以提供紧密密封并提供流体递送到孔和从孔递送的流动路径。在图24b中所示的另一个实例中，流体封盖2335可以是包含在玻璃层2415的表面上形成并用粘合剂层2425粘合于芯片2320的电极2410(例如，由如铂等导电材料制成的第二电极)的永久玻璃封盖。流体封盖2335可包括一个或多个流体通道2420。同样，流体封盖2335可牢固地贴附于芯片2320上以提供紧密密封并提供流体递送到孔和从孔递送的流动路径。在图24c中所示的又一个实例中，流体封盖2335可以是包含在coc(环烯烃共聚物)层2430的表面上形成并用粘合剂层2425粘合于芯片2320的电极2410(例如，由如铂等导电材料制成的第二电极)的永久塑料封盖。流体封盖2335可包括一个或多个流体通道2420。同样，流体封盖2335可牢固地贴附于芯片2320上以提供紧密密封并提供流体递送到孔和从孔递送的流动路径。图24d示出了图24a、24b或24c的实例的俯视图，显示电连接2435、流体连接2440、密封2445、具有电极(即，铂电极)的流室2450可以本文所公开用芯片2320或其它控制器或计算机系统制造以有助于各种公开实例的实践。可在寡核苷酸合成系统中如何调控流体输送的另一个实例在图46中示出。所述系统可包含排列在固持器中的微流体芯片。芯片和/或固持器可排列在各种位置。在以下情况下，其中气体是在流体系统内被动生成(例如，通过溶剂脱气)或其中气体是在芯片的一个或多个孔内主动生成以如本文别处所述使合成珠粒从孔移位，芯片可在竖直位置使用以有助于从芯片去除生成的气体。此示例性系统中的芯片与寡核苷酸合成所需的试剂(如乙腈(acn)、活化剂(act)、亚磷酰胺(ami)、氧化剂(oxi)、封端试剂(capa和capb)和ega)流体连通。试剂可以储存在储槽中并且可排列在另外装备有压力和流量传感器、用于流体控制的调节器、阀门和歧管的试剂柜中。此系统中的流体输送可以是压力驱动的并且不包含死体积阀门的歧管(如美国专利第4,558,845号中所述，其公开内容以引用的方式并入本文中)可用于触发所选化学物质或溶剂进入到主要流体路径中。在图46的实例中，第一歧管可连接芯片与试剂储槽并且可另外连接芯片和试剂储槽以及废料收集器。第二歧管可连接芯片与气体储槽和废料收集器。两种可能的配置在图46中示出。在配置1中，阀门设定成允许第一歧管的洗涤和充装以及芯片的排流(使用例如气体或溶剂)，其中两个流动路径都与第一歧管的废料收集器连接。因此，第一歧管的洗涤和充装以及芯片的排流可同时进行。在配置2中，阀门设定成允许用合成试剂填充排空的芯片，其中所述流动路径与第二歧管的废料收集器连接。所属领域的技术人员应认识到，其它配置或阀门/歧管排列可用于在寡核苷酸合成期间填充和排放芯片。在芯片如图46中所示排列在竖直位置的情况下，其可通过使气体或溶剂沿从芯片的顶部入口/出口到芯片的底部入口/出口的方向清洗以经由芯片的底部入口/出口高效去除试剂或气体而排空或排流。因此，本发明可包含以下工作流程，其中微流体芯片在第一流动方向经由芯片的第一入口/出口用合成试剂填充并且在不同于第一流动方向的第二流动方向经由芯片的第二入口/出口洗涤或排空。适合于排空或清洗芯片的试剂可例如包含重气(如氩气)或某些低密度溶剂。合适溶剂的密度可低于所用合成试剂(如ami、act、oxi、capa、capb和/或ega)的密度。可用于清洗芯片的一种示例性溶剂是乙腈(acn)。具有类似特性的不同溶剂是所属领域的技术人员已知的并且可由所属领域的技术人员依据所用试剂和系统的流动配置而选择。在某些实施例中，系统可以装备有限流器装置(如毛细管)以允许控制液体或气体经过流体通道的流动速率。举例来说，虽然配置1中歧管的洗涤和充装可发生在至少约1ml/min的较高流动速率下，但是配置2的芯片填充应发生在小于1ml/min的流动速率下。芯片的完全排空和再充填使得流体极快交换，无需调节不同密度的流体。液体经由微流体合成芯片的流槽转移的流动速率在以下方面可能是至关重要的：(i)允许试剂在流槽内均匀分布并且在所有合成位置处的反应时间充足(假定在流槽的中间路径和边缘的流动速率不同)，(ii)当流体以高速度通过芯片时，避免芯片的一个或多个孔中所含的珠粒移位和(iii)在芯片上合成寡核苷酸所需的全部时间。在一示例性实施例中，用于经由微流体芯片的40-μl流槽转移液体的流动速率可以在约100μl/min至约1.5ml/min的范围内加以调节。在许多情况下，流速可能未超过预定值，因为较高速度可使来自应用较长时间的孔的珠粒移位。举例来说，在使用40-μl流槽的情况下，流速可能不超过2m/min。本发明的实践中所用的个别孔可以具有多种形状和大小。孔参数的一个实例陈述在表14中。当然，孔体积和其它因素将随着孔尺寸而改变。表14：示例性圆柱形孔参数表15表15示出了特定珠粒大小的一些珠粒参数和估计缓冲液体积以及浓度。在核酸分子产生步骤完成之后，可以收集含有核酸分子的衬底(例如，珠粒)，与合成衬底分离并且进一步处理。示例性工作流程是如下的工作流程：(1)用官能团制备珠粒，(2)使珠粒分批离线衍生形成具有预先合成的通用引物的酰胺，所述引物具有罕见ii型限制位点以便使合成的核酸分子酶促裂解离开珠粒，(3)将珠粒通过流动悬浮液装载至芯片中，重力或离心确保珠粒在孔中，(4)使所装载的珠粒与阳极物理接触或接近物理接触并在阳极和珠粒表面上生成ega以便脱保护，(5)进行如本文所述的合成步骤，(6)在合成之后，通过使电流反向实现从孔数字电喷射所期望的珠粒，作为替代方案，可以采用气泡喷射，(7)从芯片流出的液体收集所喷射的珠粒并汇集。图27提供核酸合成(模块1)与汇集、裂解和脱保护步骤(模块2)的实例工作流程图(“模块1/2工作流程”)。工作流程始于使用生物信息学告知关于合成核酸分子的决策2705。生物信息学是组合软件、计算机科学、统计学和数学以有助于理解、分析和操纵生物学数据的跨学科领域。关于核酸分子的合成，生物学数据可包括优化合成的核酸分子或基因产率和/或使合成的核酸分子或基因(或由此编码的蛋白质)在不同表达系统中的表达达到最大的信息。当设计核酸分子以优化产率或使表达达到最大时，可使用生物信息学例如1)调节密码子使用，2)去除不需要的重复序列，3)去除不需要的剪接序列，4)优化gc(鸟嘌呤/胞嘧啶)含量，5)避免rna分子中不需要的二级结构，6)去除不需要的限制酶识别序列，7)调节所合成的核酸分子的长度(因为序列长度增加，最终产率和序列保真度降低)，8)计算所关注的基因或其它核酸分子到较小重叠寡核苷酸的片段化，所述较小重叠寡核苷酸在微芯片上化学合成并稍后组装成所关注的基因或核酸，或9)设计所合成的核酸分子的末端序列以便于例如经由扩增反应组装核酸分子。生物信息学还可以定义规则以计算合成特定核酸分子的难度和使用此数据告知关于可以或无法合成何种序列的决策。可能需要例如使用生物信息学修改核酸分子中的一个或多个密码子序列以改善核酸序列的转译和针对特定表达系统优化的所得蛋白质的表达。已调节优化密码子序列的核酸序列与经密码子优化核酸序列所基于的未优化的亲本序列编码相同的蛋白质。举例来说，可以调节核酸序列的一个或多个密码子以优化在哺乳动物细胞(例如，cho细胞、人类细胞、小鼠细胞等)、细菌细胞(例如，大肠杆菌)、昆虫细胞、酵母细胞或植物细胞中的表达。可在本发明中用于优化序列设计的全面多参数方法的一个实例是美国专利公开第2007/0141557号中所描述的，所述专利公开内容以引用的方式并入本文中。因此，本发明在部分方面提供了用于包括组装和表达策略等下游应用的最优序列设计。模块1/2工作流程的下一步骤涉及合成准备2710，其是在实际核酸合成之前进行。举例来说，可以通过利用芯片中所存在的电解质测量每个电极的电流来测试用于合成核酸分子的微芯片的功能性。如果鉴别出任何非功能电极，它们被保存在文件中并在合成计划步骤中考虑它们的非功能性以去除具有一个或多个非功能电极的微芯片或确保与非功能电极相关联的任何孔将不用于合成步骤中。合成准备还涉及将足够数量的珠粒或其它衬底填充到微芯片中。为了使效率达到最大，优选地填充微芯片以接近容量，例如95％或更大。合成准备还可包括启动容纳合成步骤中所用试剂的仪器并检查和任选地再填充仪器中所储存的试剂。合成准备步骤2710的实例工作流程陈述在图28a、28b和28c中。模块1/2实例工作流程中的下一步骤是合成计划2715。作为合成计划步骤的一部分，将关于核酸分子已经由生物信息学鉴别为在微芯片上合成的较差选择的反馈发送到计算机化数据管理系统2720。在某些情况下，可能必需在不同合成平台上合成特定核酸分子，特别是对于难以在微芯片平台上合成或需要以较高浓度产生以获得足够产率全长核酸产物的核酸分子。gc含量增加的核酸可能更难以合成和/或需要以较高浓度合成。在某些情况下，当需要较高浓度的核酸分子时，将可能通过将核酸分子分配到合成微芯片的更多孔中，使得在合成步骤期间产生核酸分子的更多拷贝来增加核酸分子的浓度。因此，举例来说，鉴别为“容易”合成的核酸分子可以被分配到一定数目的孔中进行合成，例如5、6、7、8、9或10个，而“难”合成的核酸分子将被分配到比“容易”核酸分子更多的孔中。在一特定实施例中，“容易”核酸分子是在6个孔中合成，而“难”核酸分子是在14个孔中合成。将“难”核酸分子分配到比“容易”核酸分子更多的孔中将增加“难”核酸分子的合成量并且使得“难”和“容易”核酸分子在组装步骤(模块3)期间以大致相同的浓度存在。合成计划步骤2715的实例工作流程陈述在图29a中。接受合成核酸的请求2905。如果为了组装所请求的核酸所设计的片段与微芯片合成不相容2910，那么将关于核酸分子已鉴别为与在微芯片上合成不相容的反馈发送到计算机化数据管理系统2915。如果为了组装所请求的核酸所设计的片段与微芯片合成相容2910，那么计数准备合成的片段数目2920。接着运行演算法以计算每个核酸分子应合成的拷贝数2925。使用合成准备信息2930，确定是否存在足够数目的核酸分子填充微芯片2935。如上文所论述，这可取决于微芯片中的孔数。当然，可以在任何给定时间基于合成队列中的核酸分子数目调整微芯片中用于合成特定寡核苷酸序列的孔数。如果没有足够核酸分子填充芯片，那么有可能等待直到接受额外合成核酸的请求2940。或者，可使用具有较少孔的芯片或可以较大数量合成相同核酸分子以填充芯片。如果存在足够核酸分子填充微芯片，那么用于组装所请求的核酸的片段被分配到微芯片2945并创建工作列表2950。核酸分子随后被定位到微芯片上的个别孔2955。在所有核酸分子已被定位到微芯片上之后，可生成合成方案，其中鉴别每个酰胺循环需要激活的电极(以生成ega)或需要激活的光源(以生成pga)的位置2960。所述方案可以在计算机系统上并保存或储存在计算机系统上，在后续合成步骤期间用于引导核酸分子在微芯片上的合成。实例模块1/2工作流程中的下一步骤是在微芯片上合成核酸分子2725(与图1的模块1对应)。如本文所述，合成步骤将变化，但是在某些实施例中，多个核酸分子是在微芯片上合成的。此步骤包括反馈机制以收集和发送关于核酸分子合成失败的数据到计算机化数据管理系统2730。所收集的数据被存储在计算机系统2735中用于作出关于是否从获得数据的合成步骤继续或返回到合成准备步骤的决策(2740)。所收集的关于核酸分子合成失败的数据还可添加到生物信息学数据库中并用于帮助优化其它合成方法的产率。激活电极以产生ega或激活光源以生成pga允许所期望的酰胺选择性脱保护。以此方式，可以高度选择性方式进行酰胺的添加，使得仅经选择和激活的电极或光源分别生成ega或pga，使所期望的酰胺脱保护并且允许酰胺添加到附接于固体支撑物的核酸分子中。这也使得核酸分子可以高度自动化方式合成，而不需要将酰胺移液到多孔板的不同位置或孔中。在某些实施例中，酰胺和催化剂(如四唑或4，5二氰基咪唑)冲洗整个微芯片一次。某些孔含有酰胺和催化剂并不是关键，即使它们未标示成添加特定酰胺，因为只要孔中的电极或光源并未激活，将不形成ega或pga并且酰胺将不会添加到孔中附接到珠粒或其它合适衬底的核酸分子中。这与需要将酰胺移液到仅所期望的位置或孔中的其它方法形成鲜明对比。因此，举例来说，在合成步骤中，微芯片的孔用ega试剂(例如，含有氢醌或苯醌或其衍生物的溶液)或pga试剂填充。接着，仅在应添加第一酰胺(例如，腺苷)的孔中选择性生成ega(或pga)。ega(或pga)使孔中附接到珠粒或其它合适固体支撑物的末端核苷酸的暴露糖基脱保护。用合适试剂(例如，乙腈)洗涤微芯片，随后泵送封端剂(例如，乙酸酐或n-甲基咪唑)穿过微芯片以使任何未反应的末端核苷酸的脱保护糖基封端。在此之后是另一洗涤步骤，随后泵送氧化剂(例如，含碘试剂)穿过微芯片以使亚磷酸三酯氧化成更稳定的磷酸三酯。接着，再用合适试剂(例如，乙腈)洗涤微芯片，随后用ega或pga试剂填充微芯片的孔并再次开始相同循环用于下一个酰胺(例如，a、c、g、t或u)。按需要重复此循环，直到所有所期望的核酸分子已被合成并准备从珠粒或其它合适固体支撑物裂解。合成步骤的实例工作流程陈述在图30中。在微芯片上合成多个核酸分子3005。分析数据以确定是否在无任何错误的情况下完成合成步骤3010。如果是，那么微芯片准备进行汇集、裂解和脱保护步骤。如果不是，那么进一步分析微芯片以确定尽管存在错误，但每个片段是否已合成足够量的核酸分子3020。如果是，那么微芯片准备进行汇集、裂解和脱保护步骤。如果不是，那么将关于未合成或合成量不足够用于后续组装的核酸分子的数据发送到计算机化数据管理系统3025。所述数据可用于作出关于重新合成未合成或合成量不足够用于后续组装的核酸分子的决策。数据还可添加到生物信息学数据库中以有助于合成核酸分子的未来设计。在微芯片内部的个别固体支撑物(例如，珠粒)上合成核酸分子之后，核酸分子需要从微芯片移出并汇集用于进一步处理。实例模块1/2工作流程中的下一步骤是汇集固体支撑物(例如，珠粒)，从固体支撑物裂解核酸分子和使裂解的核酸分子脱保护2750(与图1中的模块2对应)。此步骤也具有反馈机制以收集和发送关于合成失败的核酸分子的数据到计算机化数据管理系统2755。所收集的数据被存储在计算机系统内并用于作出关于是否继续获得所述数据的汇集/裂解/脱保护步骤的决策。举例来说，如果在微芯片上具有足够时间和空间，那么可以中止汇集/裂解/脱保护步骤并使微芯片返回到合成准备步骤2710，其中计算机系统集成软件考虑合成失败的核酸分子并提出替代性合成策略2740。所收集的关于核酸分子合成失败的数据还可添加到生物信息学数据库中并用于帮助优化其它合成方法的产率。实例模块1/2工作流程中的最终步骤是将核酸分子转移到基因合成工作台2760。基因合成工作台可包括合成的核酸分子的扩增和组装、纠错和最后组装(与图1中的模块3对应)。在某些实施例中，将核酸分子转移到多孔板(例如，1536孔板)中的基因合成工作台。在基因合成工作台的不同步骤(例如，扩增、组装、纠错、最后组装)期间，不同溶液可以被添加到多孔板中并从多孔板去除。存在许多可用于转移小体积溶液的液体操作装置，包括(但不限于)基于蠕动泵的散装分配器、固定尖端转移装置、可变尖端转移装置、搅拌头转移装置、压电装置、基于电磁的装置和声学装置。使用这些不同液体操作装置，有可能精确转移小体积溶液，如约1-100μl、1μl至500nl或500nl或更小。在某些实施例中，多孔板可适合于声学液体操作，其提供小体积或液滴的准确精密转移。声学液体操作使用集中的声能脉冲将精确体积的液滴从来源(如多孔板)转移到任何目的地位置(其也可以是不同多孔板)。液滴的体积可小于或等于约10μl、1μl、500nl、100nl、50nl、10nl或1nl。声学液体操作无需使用可能导致交叉污染的移液管和一次性尖端。在声学液体操作下无任何东西物理接触流体，从而使交叉污染的风险减到最小或消除。所属领域的技术人员应认识到，各种实施例的操作可以按需要使用硬件、软件、固件或或其组合来实施。举例来说，可以在软件、固件或硬连线逻辑的控制下使用处理器或其它数字电路执行一些处理。(本文中的术语“逻辑”是指如所属领域的技术人员所公认的用以执行所阐述功能的固定硬件、可编程逻辑和/或其适当组合。)软件和固件可以存储在计算机可读介质上。如所属领域的技术人员所熟知，可以使用模拟电路来实施一些其它处理。另外，在本发明的实施例中可以采用存储器或其它存储装置以及通信组件。图15是说明根据各种实施例可以用于进行处理功能的计算机系统1500的框图，在所述计算机系统上可以使用热循环仪系统的实施例。计算机系统1500可包括一个或多个处理器或控制器，如处理器1504。处理器1504可以使用通用或专用处理引擎(如微处理器、控制器或其它控制逻辑)实施。在此实例中，处理器1504连接到总线1502或其它通信介质上。举例来说，处理器1504可以是电流控制器，如上文参照图2a和2b所述。另外，应了解，图15的计算系统1500可以用任意多种形式具体实施，如机架安装式计算机、大型主机、超级计算机、服务器、客户端、台式计算机、笔记本电脑、平板电脑、手持式计算装置(例如pda、蜂窝电话、智能手机、掌上电脑等)、集群网格(clustergrid)、上网本、嵌入系统或任何其它类型的可能期望或适合用于给定应用或环境的专用或通用计算装置。另外，计算系统1500可包括常规网络系统，其包括客户端/服务器环境和一个或多个数据库服务器，或与lis/lims基础设施整合。包括局域网(lan)或广域网(wan)并且包括无线和/或有线组件的多种常规网络系统是所属领域中已知的。另外，客户端/服务器环境、数据库服务器和网络在所属领域中是有据可查的。计算系统1500可包括用于传达信息的总线1502或其它通信机制、以及与总线1502耦合以用于处理信息的处理器1504。计算系统1500还包括存储器1506，其可为随机存取存储器(ram)或其它动态存储器，所述存储器与总线1502耦合以便存储待通过处理器1504执行的指令。存储器1506也可用于在执行待通过处理器1504执行的指令期间存储临时变量或其它中间信息。计算系统1500另外包括与总线1502耦合以存储用于处理器1504的静态信息和指令的只读存储器(rom)1508或其它静态存储装置。计算系统1500还可包括非瞬时性存储装置1510，如磁盘、光盘或固态驱动器(ssd)经提供且耦合于总线1502以用于存储信息和指令。存储装置1510可包括介质驱动器和可移动存储接口。介质驱动器可包括用以支持固定的或可移动的存储介质的驱动器或其它机制，如硬盘驱动器、软盘驱动器、磁带驱动器、光盘驱动器、cd或dvd驱动器(r或rw)、闪速驱动器、或其它可移动的或固定的介质驱动器。如这些实例所示，存储介质可包括其中尤其存储有计算机软件、指令或数据的计算机可读存储介质。在替代实施例中，存储装置1510可包括用于允许计算机程序或其它指令或数据加载到计算系统1500上的其它类似工具。此类工具可包括例如可移动存储单元和接口(如程序盒和盒式接口)、可移动存储器(例如，闪存存储器或其它可移动存储器模块)和存储器槽、以及允许软件和数据从存储装置1510传递到计算系统1500的其它可移动的存储单元和接口。计算系统1500还可包括通信接口1518。通信接口1518可用于允许软件和数据在计算系统1500与外部装置之间传送。通信接口1518的实例可包括调制解调器、网络接口(如以太网或其它nic卡)、通信端口(如usb端口、rs-232c串行端口)、pcmcia插槽和卡、蓝牙等。经由通信接口1518传送的软件和数据呈信号的形式，这些信号可以是能够通过通信接口1518接收的电子、电磁、光学或其它信号。这些信号可以经由信道通过通信接口1518传输和接收，所述信道如无线介质、电线或电缆、光纤、或其它通信介质。信道的一些实例包括电话线、蜂窝电话链路、rf链路、网络接口、局域网或广域网以及其它通信信道。计算系统1500可以经由总线1502耦合到显示器1512，如阴极射线管(crt)或液晶显示器(lcd)，以用于向计算机用户显示信息。包括字母数字和其它按键的输入装置1514耦合到总线1502以用于例如将信息和命令选择传送到处理器1504。输入装置还可以是配置有触摸屏输入功能的显示器，如lcd显示器。另一类型的用户输入装置为光标控制器1516，如鼠标、轨迹球或光标方向键，其用于传达方向信息和命令选择到处理器1504和控制显示器1512上的光标移动。这一输入装置通常具有在两个轴(第一轴(例如，x)和第二轴(例如，y))上的两个自由度，其允许所述装置指定平面中的位置。计算系统1500提供数据处理并且提供此类数据的置信级。与本发明教示的实施例的某些实现方式一致，计算系统1500提供回应于执行存储器1506中所含的一个或多个序列的一个或多个指令的处理器1504的数据处理和置信度值。此类指令可以从另一计算机可读介质(如存储装置1510)读取到存储器1506中。存储器1506中含有的指令序列的执行使得处理器1504能执行本文所描述的处理状态。或者，可以使用硬连线电路代替或结合软件指令来实施本发明教示的实施例。因此，本发明教示的实施例的实现方式不限于硬件电路和软件的任何特定组合。如本文所用的术语“计算机可读介质”和“计算机程序产品”一般是指参与向处理器1504提供用于执行的一个或多个序列或一个或多个指令的任何介质。此类指令一般称为“计算机程序代码”(其可以呈计算机程序或其它分组的形式来分组)，当经执行时使得计算系统1500能够表现本发明的实施例的特征或功能。这些和其它形式的计算机可读介质可以采用许多形式，包括(但不限于)非易失性介质、易失性介质以及传输介质。非易失性介质包括例如固态盘、光盘或磁盘，如存储装置1510。易失性媒体包括动态存储器，如存储器1506。传输介质包括同轴电缆、铜线和光纤，包括包含总线1502的电线。计算机可读介质的常见形式包括例如软盘、软磁盘、硬盘、磁带或任何其它磁性介质、cd-rom、任何其它光学介质、穿孔卡片、纸带、具有孔洞图案的任何其它物理介质、ram、prom和eprom、flash-eeprom、任何其它存储器芯片或盒带、如下文所描述的载波，或计算机可以从中进行读取的任何其它介质。各种形式的计算机可读介质可以参与将一个或多个指令的一个或多个序列载送到处理器1504以便执行。举例来说，指令可以首先承载在远程计算机的磁盘上。远程计算机可以将指令加载到其动态存储器中，并使用调制解调器经由电话线发送指令。计算系统1500本地的调制解调器可以接收电话线上的数据并使用红外发射器将数据转换成红外信号。耦合到总线1502的红外检测器可接收红外信号中所载送的数据且将数据置放于总线1502上。总线1502将数据载送到存储器1506，处理器1504从所述存储器检索并执行指令。由存储器1506接收的指令可任选地在通过处理器1504执行之前或之后存储在存储装置1510上。应了解，为清楚起见，以上描述已经参考不同功能单元和处理器描述了本发明的实施例。然而，将显而易见的是，在不偏离本发明的情况下可以使用在不同功能单元、处理器或域之间的任何适合的功能分布。举例来说，将通过分开的处理器或控制器实现的所图示功能可以通过同一处理器或控制器实现。因此，对特定功能单元的提及仅被视为提及用于提供所描述功能的适合装置，而非指示严格的逻辑或物理结构或组织。实例实例1a：含有胺官能团的交联多孔聚苯乙烯粒子，32μm，4摩尔％氨基苯乙烯.通过使用ultra混合器将1,380g水、179g己二酸双(2-乙基己基)酯、230g丙酮和7g十二烷基硫酸钠(sds)乳化5分钟，并在两阶段mantongaulin均质机中(第一阶段在400kg/cm3下并且第二阶段在100kg/cm3下)均质化5-8分钟。在均质化之后，向275g乳液中馈入粒径是5μm的单分散寡聚苯乙烯粒子的种子悬浮液。使用75g含有7g寡聚粒子和68g水的种子悬浮液。在45℃下搅拌1天后，向59.5g含有经活化的种子粒子的种子悬浮液中馈入1,467.4g含有1,063.9g水、1.6gmethoceltmk-100(陶氏化学公司(dowchemicalco.))、0.6g十二烷基硫酸钠(sds)、56.5g二乙烯基苯(dvb)(即，80重量％dvb、20重量％乙基乙烯基苯和dvb生产中的其它副产物)、66.9g苯乙烯、5.3g氨基苯乙烯、190.9g甲苯、74.6g庚烷和7.1g2，2′-偶氮双(2-甲基丁腈)的乳液。通过使用ultra混合器将混合物乳化5分钟并第一阶段在400kg/cm2下且第二阶段在100kg/cm2下均质化16-20分钟。在27℃下膨胀1小时后，将476.5g水和3.2gmethoceltmk-100馈入反应器中。随后使分散液在60℃下聚合1小时且在70℃下聚合10小时，从而产生直径是32μm的粒子的悬浮液。通过浮选使粒子与液相分离并排出液相。随后使用2升2g/lsds溶液(水溶液)通过搅拌30分钟清洁粒子，接着浮选并且去除液体。这样重复最少两次。随后添加甲醇(2升)并搅拌粒子悬浮液30分钟，接着沉降。去除清液层并添加新鲜甲醇，且重复洗涤最少两次。最后，将粒子排出并经由100μm筛布筛分。在beckmancoultermultisizertm4上通过库尔特计数器原理测量分散于含有1％nacl和0.01％synperonictma11的电解质水溶液中的粒子的粒径。实例1b：含有官能团的交联多孔聚苯乙烯粒子，32μm，11摩尔％氨基苯乙烯.通过使用ultra混合器将1,380g水、179g己二酸双(2-乙基己基)酯、230g丙酮和7g十二烷基硫酸钠(sds)乳化5分钟，并在两阶段mantongaulin均质机中(第一阶段在400kg/cm3下并且第二阶段在100kg/cm3下)均质化5-8分钟。在均质化之后，向275g乳液中馈入粒径是5μm的单分散寡聚苯乙烯粒子的种子悬浮液。使用75g含有7g寡聚粒子和68g水的种子悬浮液。在45℃下搅拌1天后，向59.5g含有经活化的种子粒子的种子悬浮液中馈入1,453.3g含有986.7g水、1.6gmethoceltmk-100(陶氏化学公司)、0.6g十二烷基硫酸钠(sds)、56.3g二乙烯基苯(dvb)(即，80重量％dvb、20重量％乙基乙烯基苯和dvb生产中的其它副产物)、58.4g苯乙烯、15.1g氨基苯乙烯、190.4g甲苯、74.4g庚烷和7.1g2，2′-偶氮双(2-甲基丁腈)的乳液。通过使用混合器将混合物乳化5分钟并第一阶段在400kg/cm2下且第二阶段在100kg/cm2下均质化16-20分钟。在27℃下膨胀1小时后，将476.5g水和3.2gmethoceltmk-100馈入反应器中。随后使分散液在60℃下聚合1小时且在70℃下聚合10小时，从而产生具有32μm直径的粒子的悬浮液。通过浮选使粒子与液相分离并排出液相。随后使用2升2g/lsds溶液(水溶液)通过搅拌30分钟清洁粒子，接着浮选并且去除液体。这样重复最少两次。随后添加甲醇(2升)并搅拌粒子悬浮液30分钟，接着沉降。去除清液层并添加新鲜甲醇，且重复洗涤最少两次。最后，将粒子排出并经由100μm筛布筛分。在beckmancoultermultisizertm4上通过库尔特计数器原理测量分散于含有1％nacl和0.01％synperonictma11的电解质水溶液中的粒子的粒径。实例2：unylinkertm与胺官能化粒子的结合将含有24g实例1中所述粒子的406g甲苯馈入到装备有搅拌器和加热夹套的反应器中。在搅拌下，添加1.8gn，n′-二异丙基碳化二亚胺(dic)。在5分钟之后，还引入溶解于50g甲苯中的5.6gunylinkertm(chemgenes，马萨诸塞州威明顿(wilmington，ma))丁二酸三乙铵盐并且在25℃下搅拌反应物20小时。在完成后，使粒子沉降并去除清液层。在此之后添加0.5升甲苯并搅拌悬浮液30分钟。重复此洗涤方法两次且随后使用0.5升四氢呋喃(thf)代替甲苯再洗涤三次。根据以下方案通过使用三氯乙酸裂解unylinkertm的dmt保护基和利用紫外-可见光谱法的后续分析确认粒子的连接基团负载量在15-100μmol/g范围内：在玻璃小瓶中称取10-20mg干燥粒子。添加2ml含3w％三氯乙酸(tca)的二氯甲烷(dcm)且轻轻地振荡小瓶5分钟。将200μl溶液转移到含有1.8ml含0.1m对甲苯磺酸的乙腈的2ml小瓶中。将2ml小瓶振荡10秒且离心以沉降聚合物。将100μl转移到含有900μl含0.1m对甲苯磺酸的乙腈的新的2ml小瓶中。在吸收池中在498nm波长下测量uv吸光度并根据下文所述的方法确认每克粒子的unylinkertm负载量是53μmol。其中l是以μmol/g为单位的负载量，a是在498nm下的吸光度，l是以cm为单位的池长度，ε＝68,700l/(mol*cm)并且m是以mg为单位的样品质量。实例3：unylinkertm官能化粒子的封端使四氢呋喃(thf)中的24g如实例2中所述含有unylinkertm的粒子沉降并通过抽吸去除尽可能多的溶剂。添加480gcapb并使粒子再悬浮。随后将溶液馈入装备有搅拌器和冷凝器的玻璃夹套反应器中并在搅拌下添加480gcapa。将反应物加热至60℃并在所述温度下保持4小时。当完成时，使聚合物沉降并去除清液层。在此之后添加0.5升四氢呋喃(thf)并搅拌30分钟。重复洗涤方法三次且随后使用0.5升甲醇代替thf再洗涤四次。在最终洗涤完成后，将粒子再悬浮于0.5升thf中且在旋转蒸发器上真空浓缩。实例4：在微流体芯片上同时合成10种不同寡核苷酸在流动池中组装微流体合成芯片并连接到abi392dna合成仪(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技应用生物系统公司(appliedbiosystems，thermofisherscientificinc.))充当试剂歧管。玻璃限流器被10cm长peektm管道(0.006″×1/16，idexhealth&science，华盛顿州奥克港(oakharbor，wa))替换以将最大流动速率调节到大致900μl/min。根据实例1至3制备的装载有32μm多孔聚苯乙烯珠粒(60μmol/gunylinkertm，70％孔隙率，马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司)的微流体合成芯片被用于使用本文所述的方法同时合成10种不同的寡核苷酸序列(表16)。将微流体合成芯片的合成位置分成10个区域。使用微流体合成芯片底层上的数个铂电极电子连接所述区域以将10个区域连接成可个别寻址的工作电极束。铂反电极被附接到封盖，从而覆盖合成腔室的上侧。abi392dna合成仪的继电器1被连接到scb-68a连接器块(nationalinstrumentscorp.，德克萨斯州奥斯汀(austin，tx))。将scb-68a连接器块另外连接到微流体合成芯片的工作电极束。关闭abi392上的继电器1触发在不同合成位置的电化学酸生成。使用labview(nationalinstrumentscorp.，德克萨斯州奥斯汀)控制不同合成位置上的序列。在微流体合成芯片的区域1上合成odn1。在微流体合成芯片的区域2上合成odn2。在微流体合成芯片的区域3上合成odn3。在微流体合成芯片的区域4上合成odn4。在微流体合成芯片的区域5上合成odn5。在微流体合成芯片的区域6上合成odn6。在微流体合成芯片的区域7上合成odn7。在微流体合成芯片的区域8上合成odn8。在微流体合成芯片的区域9上合成odn9，并且在微流体合成芯片的区域10上合成odn10。如本文别处所述使用标准化学方法(偶合、封端和氧化)进行合成，解封闭除外，它是根据表17中的方案通过电化学生成酸而达成。以下试剂被用于dna合成：乙腈(无水用于dna合成，fisherbioreagents)、二氰基咪唑作为活化剂(sigmaaldrich)、dmt-da(bz)亚磷酰胺(sigmaaldrich)、dmt-dg(ib)亚磷酰胺(sigmaaldrich)、dmt-dc(bz)亚磷酰胺(sigmaaldrich)、dmt-dt亚磷酰胺(sigmaaldrich)、capa(sigmaaldrich)、capb(sigmaaldrich)、氧化剂0.1m(sigmaaldrich)。用于电化学酸生成的混合物连同合适的电化学条件先前描述在别处(maurerk，cooperj，caraballom，crye，j，suciud，等人(2006)电化学生成酸和其容放于100微米反应区域用于产生dna微阵列.《公共科学图书馆期刊》1(1)：e34.doi：10.1371/journal.pone.0000034)。表17在寡核苷酸合成之后，用电解质溶液(0.7m对甲苯磺酸四乙铵、50％水、30％甲醇、20％乙腈)冲洗微流体芯片。使用珠粒下的电极作为阳极，通过施加7.5v到相关合成位置汇集与一种寡核苷酸序列对应的珠粒。这允许在具有特定寡核苷酸序列的珠粒下电化学产生气泡。那些气泡将具有一种特定寡核苷酸序列的珠粒提升到合成位置之外。那些珠粒被冲洗到微流体芯片之外并收集在过滤器中。重复此程序，直到具有odn1至odn10的珠粒被收集在10个不同的过滤器中。使用氨气(2巴，2小时)裂解寡核苷酸，洗脱在水中(参见图22)并使用rphplc分析。实例5：40聚体测试寡核苷酸的合成使用示例性合成芯片合成40聚体测试寡核苷酸。预负载有dg(80μmol/g)的35μm珠粒被用于具有55μm深孔与38μm直径的合成芯片(su8)中并且pt电极在孔底部。在合成芯片的孔中使用含1m氢醌、0.01m苯醌和0.25m对甲苯磺酸四乙铵的80％乙腈和20％甲醇的混合物生成ega。为了生成酸，在0.3μa电流限度下向所期望的孔施加6.5v持续3秒。使用ega去除dmt保护基，随后将下一个酰胺添加到附接于珠粒的生长核酸分子中。重复此方法，直到已在珠粒上合成所期望的40聚体寡核苷酸。接着，在合成芯片中使用甲胺水溶液和氨水的1∶1混合物裂解寡核苷酸并脱保护。将寡核苷酸真空干燥，溶解于水中并在未经进一步纯化的情况下注射在逆相hplc上。用于hplc的缓冲液是0.1m乙酸正己铵/10％(体积)乙腈和0.1m乙酸正己铵/50％(体积)乙腈。hplc柱装有聚苯乙烯。使用ega在微芯片上合成的40聚体测试寡核苷酸的色谱图显示在图34中。x轴示出了滞留时间(分钟)并且y轴示出了在260nm下的uv信号强度(mau)。实例6：使用电解从合成芯片选择性移出珠粒使用通过电解生成的气泡从示例性多孔合成微芯片选择性移出珠粒。图33a、33b和33c示出了描绘根据本发明的示例性实施例的珠粒移出方法的时间系列影像。如图33a中所示，35μm聚苯乙烯珠粒被装载在由su8抗蚀剂制成的55μm深的孔中，如3310所标示，而一些孔保持空载(即，无珠粒)，如3305所标示。虽然图33a中未示出，但是结合图18以及24a、24b和24c所说明和描述，电极位于每个孔的底部。如图33c中所示，封盖中的反电极3325与每个孔底部的电极结合使用以产生电位，使得溶剂电解并生成气泡，如本文所论述。如图33b中所示，在所选孔中施加电压使得所选孔中的溶剂(例如，乙腈、氢醌、苯醌和对甲苯磺酸四乙铵)电解，继而产生气泡3315，其以毫秒膨胀并提升珠粒到孔顶部，在此流体流输送珠粒远离孔。因此，这个实例证实了使用溶剂电解从合成微芯片的孔选择性移出珠粒。在应用洗涤步骤之后，孔可以再次使用。在第一气体生成脉冲未移出珠粒的情况下，可跟随更多气体生成循环。实例7：使用电解从合成芯片选择性移出珠粒如实例1至4中所述产生的珠粒负载有包含荧光标记碱基的寡核苷酸并且被填充到微流体芯片的孔中，使得所有孔的～99％被占据(图44，画面a)。(不是所有的孔都可见于图44画面a至d的显微图像，因为流体封盖中存在反电极(铂条))。适合于电解的溶液(0.7m对甲苯磺酸四乙铵(teapts)、50％h2o、30％meoh、20％乙腈(acn))随后以500μl/min的流动速率冲洗整个芯片并且将8.5v的电压施加于具有100个电极(10乘10)的子集5秒。所施加的电压导致所选孔内的电解(图44画面b)，从孔中移出珠粒。将珠粒以500μl/min的流动速率冲洗到芯片之外。随后使用相同参数对电极的另一子集重复所述方法(图44，画面c和d)。通过图44画面a至d所说明的方法，耗时少于30秒。此实例证实通过使用本文所述的方法在相应电极处诱导电解可以从预先选择的孔中高效移出珠粒。实例8：使用目筛穿刺收集装置收集珠粒具有25,000个孔的合成微芯片用以不同方式标记的珠粒填充，所述孔与不同电极相关联(例如，经cy3标记的珠粒装载到电极1的孔中，经cy5标记的珠粒装载到电极2的孔中等)。在此实例中，2,500个孔以束状连接到一个工作电极。合成微芯片的出口连接到针并且合成芯片的入口连接到切换阀，所述切换阀连接到提升缓冲液(包含(i)选自由以下组成的群组的挥发性化合物：碳酸氢铵、甲酸盐、乙酸盐、经取代的铵盐，如乙酸三乙铵；和(ii)溶剂，如水、乙腈、四氢呋喃(thf)或醇)和用于洗涤的乙腈。将合成微芯片和针置于可移动的z工作台上，而多孔收集板组装件在可沿x-y方向移动的板上。多孔收集板组装件包括未经修改的1536环烯烃共聚物(coc)板、由peek(聚醚醚酮)制成的流体渗透微目筛和去除孔底部的经修改的1536coc板。经修改的板用于夹紧未经修改的板顶部的目筛。为了开始将珠粒转移到多孔收集板组装件中，将针刺穿微目筛层到底板(未经修改)的第一孔中。提升溶剂冲洗整个芯片和针，并且激活电极1(经cy3标记的珠粒)以通过电解从所选孔移出珠粒。在3个脉冲之后，切换阀门并冲洗乙腈以洗涤芯片和多孔收集板组装件的第一孔。随后停止流动，将针移动到多孔收集板组装件的第二孔并对电极2(经cy5标记的珠粒)重复所述方法。对数个电极重复此方法，同时始终交替珠粒。在选择性转移珠粒之后，将多孔收集板组装件离心、干燥、拆分并在荧光显微镜下研究。可发现多孔收集板组装件的底板(未经修改)的大部分孔很少乃至没有交叉污染，同时几乎所有珠粒从芯片转移到多孔收集板组装件的孔(即，针或管道中无珠粒损失)。实例9：纠错方法将所关注序列分成至多1.2kbp长度的亚片段(图36第1行)，分别与相邻载体或亚片段具有30bp同源区。再将亚片段序列分成较短寡核苷酸。使用pcr由寡核苷酸组装亚片段。使用尺寸排阻纯化方法(来自颇尔生命科学公司(palllifesciences)的具有omega30kmwco的acropreptm高级过滤板)纯化这些线性dna片段或任何其它pcr产物。关于一种片段的纠错(图36第2行)，使10mmtris-c1中所含的10-30ng纯化的pcr产物变性并再退火以形成异源双螺旋体(98℃，2分钟；4℃，5分钟；37℃，5分钟；随后4℃)。在较长片段(例如，大于1.1kbp长度的片段)的情况下，如先前所述将亚片段(每个亚片段15-45ng)汇集、变性并再退火。添加t7核酸内切酶i(40u)和taq连接酶(1u)并纠错(45℃，20分钟)。扩增消化混合物中所存在的核酸(98℃，2分钟；包括以下三个保温步骤的15个循环：98℃，20秒；65℃-57,5℃，30秒；72℃，90秒；25℃)并添加末端引物以选择和扩增全长片段(图36第3行)(98℃，20秒；58℃，30秒；72℃，90秒(前三个步骤20个循环)；72℃，5分钟；4℃)。为了进一步提高片段的正确性，进行第二轮纠错(图36第4行)。简单来说，将第一轮纠错的pcr产物(图36中称为第3次pcr)使用如上所述的尺寸排阻纯化方法从溶液中再次纯化。使用含50-120ng纯化的pcr产物的10mmtris-cl生成异源双螺旋体(98℃，2分钟；4℃，5分钟；37℃，5分钟；4℃)，添加酶(40ut7核酸内切酶i和1utaq连接酶)并在45℃下保温20分钟。为了生成全长片段(图36第5行)，进行另一轮扩增(95℃，4分钟；95℃，30秒；70-43℃*，30秒(*每个循环递减-0.9℃)；72℃，6分钟(后三个步骤30个循环)；4℃)。在用载体直接组装的情况下，在pcr扩增步骤中添加与片段末端含有29bp同源区的线性化质粒。之后，经由(i)琼脂糖凝胶上的大小检查(针对线性片段)或(ii)菌落pcr(针对克隆片段)进行全长片段的筛选(图36第7行)。最后，经由sanger和下一代测序进一步分析全长片段以验证序列正确性(图36第9行)。用于片段组装的寡核苷酸具有特定固有比率的错误，即插入、缺失和取代。在取代的情况下，区分转换和颠换。在对寡核苷酸合成仪上使用标准亚磷酰胺化学方法产生的未处理寡核苷酸的总共九百万个碱基对进行测序的研究中，测定出每个位置平均错误频率(错误率)是692ppm(1445bp中1个错误)。最常见的错误类型是单个核苷酸缺失，其中a、c、g和t位置具有相等频率(参见图37)。下一个最常见的错误类型是单个核苷酸插入。最不常见的错误类型是单个核苷酸取代。在如上所述使用t7核酸内切酶i的两轮纠错之后，包括所有类型错误的平均总错误率达到66ppm(15,132bp中1个错误，分析了来自9个片段的三千五百万个碱基对)。92％的剩余错误是取代并且仅8％是插入或缺失。关于特定错误类型，主要发现的是转换(62％)，更精确地说主要是g和c，较不常发现的是a和t转换。这可以通过g脱氨基变成与t配对的黄嘌呤，最终导致g-c→a-t转换来解释。另外，所发现的30％的错误是颠换，主要影响通常占有c和g的位置。其余错误是缺失(5％)和插入(3％)。综合起来，在两轮纠错之后，缺失和插入相当好地通过t7核酸内切酶i识别和消除，留下取代作为主要剩余错误类型，其中所有取代的74％影响g/c位置。另外，在如上文所陈述制备的经纠错的核酸分子中，转换∶颠换的比率为约2∶1(图38)。对于通过pcr引入的取代，此分布是典型的。对于未进行纠错的寡核苷酸，转换：颠换的统计学比率通常为约1∶2。另外，通过上述纠错方案缺失和插入几乎完全消除，并且在两轮纠错之后a和c转换实际增加(参见图38)。基于此，可以推断在纠错期间t7核酸内切酶i不大可能特异性错过这些g/c取代，而实际上它们是在t7核酸内切酶i处理后通过pcr步骤引入的。实例10：使用芯片合成的寡核苷酸组装lacz基因如实例4中所述在微流体合成芯片上同时合成并且含有互补末端重叠序列以允许如图4中所示基于pcr组装的寡核苷酸ogn1-ogn10被用于构建251-bplacz基因。使用96孔板读取器(tecangroupltd.，瑞士门内多夫(maennedorf，switzerland))测定所有寡核苷酸的浓度并且每个寡核苷酸以0.15μm的平均浓度用于寡核苷酸组装反应。寡核苷酸组装是以1.23μl的反应体积(pcr预混液：0.2mmdntp(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司)、1utruescripttm聚合酶(panbiotech，德国艾登巴赫(aidenbach，germany))、60mmtris-hcl、6mm(nh4)2so4、10mmkcl和2mmmgso4)在384孔板(enduraplatetm光学384孔，马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司)中，使用proflextm热循环仪(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司)使用根据表18的循环条件来进行。寡核苷酸组装pcr后是第二pcr反应，其在末端引物存在下进行以扩增经组装的全长基因。此扩增反应是以10μl的反应体积在384孔板的相同孔中，通过添加truescripttmpcr预混液和0.8μm正向(5′-atgaccatgattacgccaagcttgg-3′)和反向(5′-attgtactgagagtgcaccatatgc-3′)引物使用如表19中所规定的循环条件来进行。在第二pcr之后，将完全反应混合物转移到384孔ldvlabcyte板(labcyteinc.，加利福尼亚州森尼韦尔)。通过使用(labcyteinc.，加利福尼亚州森尼韦尔)将0.0396μlpcr产物从此板转移到新的384孔enduraplatetm中，添加0.132u核酸外切酶i(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司)并在37℃下保温15分钟以从pcr产物去除可能干扰下游反应的过量引物和任何外来单链dna。在核酸外切酶i处理后，根据表20中指出的条件使纯化的dna片段变性并再杂交以使核酸外切酶i失活并允许在序列错误位点处形成错配以便后续纠错。变性-再杂交的dna随后与ampligasepuffer、0.04μl(0.4u)t7核酸内切酶i(neb)和0.04μl(1.6u)taq连接酶(neb)以0.4μl的体积混合并使混合物在45℃下保温20分钟以便纠错。在纠错之后，通过将pcr预混液添加到纠错混合物而在相同384孔中进行融合pcr反应(第3pcr；图36或42)。融合pcr混合物含有：0.16u聚合酶(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司)、200μmdntp、0.25μm正向和反向引物、25mmtaps-hcl(在25℃下ph9.3)、50mmkcl、2mmmgcl2、1mmβ-巯基乙醇。根据表21中指出的方案循环反应。功能性lacz基因的成功组装是通过蓝白筛选来证明。出于此目的，将经组装的基因经由无缝克隆而克隆到hindiii/ndei-cutpuc19载体中并转化到大肠杆菌中。实例11：使用经碱涂布的清除剂珠粒保护非活性合成位点不被质子污染在孔底部具有铂电极的微流体芯片的40-μm孔装载有32-μm多孔聚苯乙烯珠粒(“合成支撑物”；dgs80，通用电气医疗集团(gehealthcare))。使用如实例5中所陈述的条件经由电化学反应生成质子以去除核酸分子上的临时dmt保护基。在第一设置中，将第一电极在10秒延时下激活三次以在相应孔中产生电化学酸(图48a)。合成孔变红，因为释放的dmt阳离子具有明显的红色。然而，在此设置中，具有无源电极的相邻孔也略微变红，因为不存在可防止生成的质子扩散到相邻孔的质子清除剂。如在一个活性和一个非活性合成孔(如左侧显微镜照片所示)中所测量，颜色强度随时间推移的变化由右侧标绘图表示。在第二设置中，各自含有合成支撑物的合成孔用经碱性胺基涂布的较小珠粒(7μm，nucleogen60-7deae，machereynagel)填充(如由图48b的显微镜影像的不规则孔结构和相应标绘曲线的背景噪声反映出)。电极在10秒延时下激活三次。如在先前实验中，具有有源电极的孔变红表明存在清除剂珠粒并不妨碍dmt保护基的高效去除。然而，相比于第一设置，具有无源电极的孔未显示颜色变化，如由右侧标绘图所反映。这清楚地表明，所用固体质子清除剂珠粒能够保护相邻非活性位点不被质子污染而不损害活性位点处的脱保护效率。实例12a：在384孔板格式中包含交替的液体操作和pcr循环步骤的基因片段组装工作流程此实例描述了使用一种类型的多孔板进行交替的液体操作和热保温步骤由寡核苷酸组装经纠错的基因片段的微量工作流程。对于亚片段组装pcr(第一pcr)，使用纳米分配器(multidroptmcombinl试剂分配器，马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默科技公司)将1μl包含pcr缓冲液、dntp和聚合酶的pcr预混液预先分配到384孔板(enduraplatetm光学384孔；马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技)的孔中。使用labcyte液体处理器(labcyteinc.，加利福尼亚州森尼韦尔)将0.25μl在芯片上合成汇集的寡核苷酸混合物(包含重叠互补末端并合起来表示基因亚片段)添加到384孔板中。随后将384孔板放置到proflextmpcr循环仪(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技)并使反应混合物循环。对于扩增pcr(第二pcr)，第一pcr产物使用补充1.75μl包含正向和反向引物的混合物并使用纳米分配器补充7μl包含缓冲液、dntp和聚合酶的pcr预混液。随后将384孔板放置于proflextm循环仪中并在末端引物的存在下扩增亚片段。随后使用tecan液体处理器(tecangroupltd.，瑞士门内多夫)将10μl第二pcr产物转移到384孔ldvlabcyte板(labcyteinc.，加利福尼亚州森尼韦尔)。对于第一纯化步骤，使用将0.04μl第二pcr产物和0.1μl核酸外切酶i(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司)转移到另一个384孔microampendura板中，并在proflextm384孔循环仪中培育混合物以去除残余引物并使得亚片段解链和再退火。随后使用将0.2μl包含ampligase缓冲液、t7ni和taq连接酶的纠错酶混合物添加到再退火的亚片段中并在proflextm循环仪中进一步培育以在第一纠错步骤中去除错配。随后使用纳米分配器将9.1μlpcr预混液添加到第一纠错产物中，并使用将0.5μl包含正向和反向引物的混合物添加到384孔板中。随后在proflextm循环仪中进行融合pcr(第三pcr)以将经纠错的亚片段组装成全长片段。对于第二纯化步骤，使用tecan液体处理器将10μl第三pcr产物转移到384孔ldvlabcyte板。随后使用将0.8μl第三pcr产物和0.35μl核酸外切酶i转移到96孔板(superplatepcr板，96孔，马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技)，并在eppendorfpcr循环仪(mastercyclerpros，德国汉堡的艾本德股份公司(eppendorfag，hamburg，germany))中培育混合物以去除残余引物并使得亚片段解链和再退火。随后使用以1μl包含ampligase缓冲液、t7ni和taq连接酶的纠错混合物补充经纯化的再退火片段，并在eppendorfpcr循环仪中进一步培育反应混合物以在第二纠错步骤中去除错配。随后使用纳米分配器将45.5μl预混液(newenglandbiolabs，马萨诸塞州伊普威治(ipswich，ma))添加到96孔板中，并将反应混合物转移到eppendorfpcr循环仪以便在末端引物存在下进行另一融合pcr(第四pcr)扩增全长片段。或者，经组装片段的大小为至多1kb或约1kb，可在线性化目标载体存在下进行第四pcr以使得片段经由重叠互补末端在融合pcr反应中直接插入到目标载体中。含有插入片段的所得载体可随后转化到感受态大肠杆菌中。实例12b：在1536孔板格式中包含交替的液体操作和pcr循环步骤的基因亚片段组装工作流程此实例描述了使用一种类型的多孔板进行交替的液体操作和热保温步骤由寡核苷酸组装经纠错的基因片段的微量工作流程。对于亚片段组装pcr(第一pcr)，使用纳米分配器(multidroptmcombinl试剂分配器，马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默科技公司)将2μl包含pcr缓冲液、dntp和聚合酶的pcr预混液预先分配到1536平底孔板(1536ldv板，labcyteinc.，加利福尼亚州森尼韦尔)的孔中。使用labcyte液体处理器(labcyteinc.，加利福尼亚州森尼韦尔)将0.5μl在芯片上合成汇集的寡核苷酸混合物(包含重叠互补末端并合起来表示基因亚片段)添加到1536孔板中。随后将1536孔板放置到包含平底热块的proflextmpcr循环仪(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技)中并使反应混合物循环3小时。对于扩增pcr(第二pcr)，使用labcyte将0.4μl第一pcr产物和0.5μl包含正向和反向引物的混合物转移到另一个1536孔板中，并使用纳米分配器将2μl包含缓冲液、dntp和聚合酶的pcr预混液添加到1536孔板中。随后将1536孔板放置于proflextm循环仪中并在末端引物的存在下扩增亚片段。对于第一纯化步骤，使用labcyte将0.25μl第二pcr产物和0.6μl核酸外切酶i(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司)转移到另一个1536孔板中，并在proflextm循环仪中培育混合物以去除残余引物。经纯化的亚片段随后补充有0.25μlampligase缓冲液并在proflextm循环仪中培育以使得亚片段解链和再退火，随后使用将1.5μl包含t7ni和taq连接酶的纠错酶混合物添加到经再退火的亚片段中并在proflextm循环仪中进一步培育以便在第一纠错步骤中去除错配。使用纳米分配器将2.75μlpcr预混液预先分配到另一个1536孔板中，并使用将0.15μl第一纠错产物和0.15μl包含正向和反向引物的混合物添加到1536孔板中。随后在proflextm循环仪中进行融合pcr(第三pcr)以扩增经纠错的全长亚片段。对于第二纯化步骤，使用将0.4μl第三pcr产物和1.1μl核酸外切酶i转移到另一个1536孔板中并在proflextm循环仪中培育混合物以去除残余引物。经纯化的亚片段随后补充有0.45μlampligase缓冲液并在proflextm循环仪中培育以使得亚片段解链和再退火，随后使用将1.8μl纠错酶混合物添加到经再退火的亚片段中并在proflextm循环仪中进一步培育以便在第二纠错步骤中去除错配。随后使用将2.5μl第二纠错产物转移到96孔板(superplatepcr板，96孔，马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技)，并使用纳米分配器添加45μl预混液(newenglandbiolabs，马萨诸塞州伊普威治)。在15个循环之后，向融合pcr混合物中添加2.5μl正向和反向引物的混合物。最后，将96孔板转移到eppendorfpcr循环仪(mastercyclertmpros，德国汉堡的艾本德股份公司)进行另一融合pcr(第四pcr)以再组装和扩增全长亚片段。本说明书中提及的所有公开案、专利和专利申请指示所属领域的技术人员的技术水平并以引用的方式并入本文中，其程度如同指示每一个别公开案、专利或专利申请专门且个别地以引用的方式并入。虽然如此描述了本发明，但是所属领域的技术人员应认识到可以多种方式改变本发明。这类变化不应视为脱离本发明的精神和范围，并且所属领域的技术人员将清楚的是所有此类修改打算包括在随附权利要求书的范围内。本发明进一步由以下条款表示：1.一种用于从合成核酸分子的微芯片的经流体填充的孔移出珠粒的方法，其中核酸分子附接到所述珠粒，所述方法包含：在排列于所述经流体填充的孔的底部的第一电极与第二电极之间提供电压，其中所述电压足以致使所述经流体填充的孔中的流体进行电解，在所述流体中产生一个或多个气泡以连同所述珠粒一起上升到所述经流体填充的孔的顶部。2.根据条款1所述的方法，其另外包含用珠粒收集装置收集已上升到所述经流体填充的孔的顶部的珠粒。3.根据条款1或2所述的方法，其另外包含将所收集的珠粒转移到第一多孔收集板的孔中。4.根据条款1-3中任一项所述的方法，其中所述流体包含水性或非水性缓冲溶液。5.根据条款1-4中任一项所述的方法，其中所述流体包含水、nacl水溶液、甲醇、乙腈、氢醌、苯醌和net4ptso。6.根据条款1-5中任一项所述的方法，其中所述第一电极是由铂构成并且所述电压为约0.1至约100伏。7.根据条款1-6中任一项所述的方法，其中所述第二电极排列在所述第一电极上方。8.根据条款1-7中任一项所述的方法，其中所述微芯片包含封盖，其可经操作以在所述微芯片的顶表面上形成并且可经操作以提供经所述孔的流体流动路径。9.根据条款1-8中任一项所述的方法，其中所述第二电极是在所述封盖中形成。10.根据条款1-9中任一项所述的方法，其中所述微芯片的每个孔可由控制器个别寻址。11.根据条款1-10中任一项所述的方法，其中所述微芯片是互补金属氧化物半导体(“cmos”)芯片。12.根据条款1-11中任一项所述的方法，其中所述珠粒是由以下各物构成：合成聚合物、经改性的天然存在的聚合物、玻璃、受控微孔玻璃、磁性受控微孔玻璃、磁性珠粒、陶瓷或一种或多种金属。13.根据条款1-12中任一项所述的方法，其另外包含用珠粒收集装置收集已上升到所述经流体填充的孔的顶部的珠粒，其中所述珠粒收集装置与所述流体流动路径流体连通并且包含使得所述珠粒沿第一方向移动的第一通道和使得流体沿不同于所述第一方向的第二方向移动的第二通道。14.根据条款2-13中任一项所述的方法，其中所述珠粒收集装置包含可由控制器控制的声学模块以促进所述第一通道中的珠粒、所述第二通道中的流体或这两者的移动。15.根据条款2-14中任一项所述的方法，其中所述第一多孔收集板包含多个孔结构和在所述多个孔结构的顶表面上或在所述多个孔结构内形成的流体渗透结构。16.根据条款3-15中任一项所述的方法，其中所述第一多孔收集板包含多个孔结构并且另外包含第二多孔收集板，其中所述第二多孔收集板包含多个孔结构和在所述多个孔结构的底表面上形成的流体渗透结构，其中所述第二多孔收集板置于所述第一多孔收集板的顶部上以使得所述第二多孔收集板的多个孔结构与所述第一多孔收集板的多个孔结构对准。17.根据条款2-16中任一项所述的方法，其中所述珠粒收集装置包含针结构，其可经操作以1)通过穿刺所述流体渗透结构而将来自所述核酸分子合成微芯片的珠粒放置于所述第一多孔收集板的孔中，和/或2)从所述第一多孔收集板中放置所述珠粒的孔去除流体。18.根据条款17所述的方法，其中所述针结构包含第一管腔，其可经操作以通过穿刺所述流体渗透结构而将来自所述核酸分子合成微芯片的珠粒放置于所述第一多孔收集板的孔中；和第二管腔，其可经操作以从所述第一多孔收集板中放置所述珠粒的孔去除流体。19.根据条款3-18中任一项所述的方法，其另外包含以一个或多个自由度移动所述珠粒收集装置，将所述珠粒收集装置中收集的珠粒递送到所述第一多孔收集板的多个孔中。20.根据条款3-19中任一项所述的方法，其中所述微芯片经编程以从所述微芯片中所关注的特定孔提取所述珠粒并且经由所述珠粒收集装置将所述珠粒递送到所述第一多孔收集板的多个孔的可寻址的孔中。21.根据条款3-20中任一项所述的方法，其中所述第一多孔收集板的每个孔的总体积在1与25μl之间。22.一种用于合成核酸分子的系统，所述系统包含：微芯片，包含上面形成的多个孔结构，所述多个孔结构的每个孔大小设定成容纳用于合成核酸分子的珠粒，其中每个孔中已形成在孔底部可由控制器单独控制的第一电极；和封盖构件，排列在所述微芯片的顶部上并包含其中形成的流体通道以提供所述珠粒的流体路径，其中所述封盖构件包含第二电极，其中所述控制器可经操作以在所述第一电极与所述第二电极之间提供电压，所述电压足以致使孔中的流体进行电解，在所述流体中产生一个或多个气泡以连同所述珠粒一起上升到孔顶部。23.根据条款22所述的系统，其另外包含珠粒收集装置，可经操作以收集从所述孔移出的珠粒。24.根据条款22或23所述的系统，其另外包含第一多孔收集板，可经操作以接收从所述珠粒收集装置收集的珠粒。25.根据条款22-24中任一项所述的系统，其中所述流体包含水性或非水性缓冲溶液。26.根据条款22-25中任一项所述的系统，其中所述流体包含水、nacl水溶液、甲醇、乙腈、氢醌、苯醌和net4ptso。27.根据条款22-26中任一项所述的系统，其中所述第一电极是由铂构成并且所述电压为约0.1至约100伏。28.根据条款22-27中任一项所述的系统，其中所述第二电极排列在所述第一电极上方。29.根据条款22-28中任一项所述的系统，其中所述微芯片的每个孔的深度在约40与约60μm之间。30.根据条款22-29中任一项所述的系统，其中所述微芯片是互补金属氧化物半导体(“cmos”)芯片。31.根据条款22-30中任一项所述的系统，其中所述珠粒是由以下各物构成：合成聚合物、经改性的天然存在的聚合物、玻璃、受控微孔玻璃、磁性受控微孔玻璃、磁性珠粒、陶瓷或一种或多种金属。32.根据条款23-31中任一项所述的系统，其中所述珠粒收集装置与所述流体路径流体连通并且包含使得所述珠粒沿第一方向移动的第一通道和使得流体沿不同于所述第一方向的第二方向移动的第二通道。33.根据条款23-32中任一项所述的系统，其中所述珠粒收集装置包含可由控制器控制的声学模块以促进所述第一通道中的珠粒、所述第二通道中的流体或这两者的移动。34.根据条款24-33中任一项所述的系统，其中所述第一多孔收集板包含具有多个孔结构和在所述多个孔结构的顶表面上或在所述多个孔结构内形成的流体渗透结构的板。35.根据条款24-34中任一项所述的系统，其中所述第一多孔收集板包含多个孔结构并且另外包含第二多孔收集板，其中所述第二多孔收集板包含多个孔结构和在所述多个孔结构的底表面上形成的流体渗透结构，其中所述第二多孔收集板置于所述第一多孔收集板的顶部上以使得所述第二多孔收集板的多个孔结构与所述第一多孔收集板的多个孔结构对准。36.根据条款23-35中任一项所述的系统，其中所述珠粒收集装置包含针结构，其可经操作以1)通过穿刺所述流体渗透结构而将来自所述核酸分子合成微芯片的珠粒放置于所述第一多孔收集板的孔中，和2)从放置所述珠粒的孔去除流体。37.根据条款36所述的系统，其中所述针结构包含第一管腔，其可经操作以通过穿刺所述流体渗透结构而将来自所述核酸分子合成微芯片的珠粒放置于所述第一多孔收集板的孔中；和第二管腔，其可经操作以从放置所述珠粒的孔去除流体。38.根据条款23-37中任一项所述的系统，其另外包含控制器，可经操作以一个或多个自由度移动所述珠粒收集装置，将所述珠粒收集装置中收集的珠粒递送到所述第一多孔收集板的多个孔中。39.根据条款23-38中任一项所述的系统，其中所述微芯片经编程以从所述微芯片中所关注的特定孔提取所述珠粒并且经由所述珠粒收集装置将所述珠粒递送到所述第一多孔收集板的多个孔的可寻址的孔中。40.根据条款24-39中任一项所述的系统，其中所述第一多孔收集板的每个孔的总体积在1μl与25μl之间。41.一种非瞬时性计算机可读存储介质，其经通过处理器可执行的指令编码，用于从合成核酸分子的微芯片的经流体填充的孔移出珠粒，其中核酸分子附接到所述珠粒，所述指令包含用于以下的指令：在排列于所述经流体填充的孔的底部的第一电极与第二电极之间提供电压，其中所述电压足以致使所述经流体填充的孔中的流体进行电解，在所述流体中产生一个或多个气泡以连同所述珠粒一起上升到所述经流体填充的孔的顶部。42.一种用于从合成核酸分子的微芯片的经流体填充的孔移出珠粒的系统，其中核酸分子附接到所述珠粒，所述系统包含：处理器；和经处理器可执行指令编码的存储器，所述指令用于：在排列于所述经流体填充的孔的底部的第一电极与第二电极之间提供电压，其中所述电压足以致使所述经流体填充的孔中的流体进行电解，在所述流体中产生一个或多个气泡以连同所述珠粒一起上升到所述经流体填充的孔的顶部。43.一种用于从具有多个经流体填充的孔的用于合成核酸分子的微芯片选择性移出一个或多个珠粒的方法，其中所述多个孔中的每一个包含在孔底部形成的电极并且所述一个或多个珠粒中的每个珠粒占据所述微芯片上的单个孔，所述方法包含：鉴别含有有待从所述微芯片移出的一个或多个珠粒的一个或多个孔；在已鉴别的一个或多个孔中的第一电极与第二电极之间提供电压，其中所述电压足以致使所述一个或多个经流体填充的孔中的流体进行电解并在所述流体中产生一个或多个气泡以连同所述一个或多个孔内所含的一个或多个珠粒一起上升到所述一个或多个经流体填充的孔的顶部；用珠粒收集装置收集已上升到所述一个或多个经流体填充的孔的顶部的一个或多个珠粒；以及将所收集的一个或多个珠粒转移到多孔收集板的一个或多个孔中。44.一种用于合成核酸分子的系统，所述系统包含：微芯片，包含上面形成的多个孔结构，所述多个孔结构的每个孔大小设定成容纳用于合成核酸分子的单分散珠粒，其中每个孔中已形成在孔底部可由控制器单独控制的第一电极，并且其中所述单分散珠粒的直径比每个孔的直径小约5％至约20％；和封盖构件，排列在所述微芯片的顶部上并包含其中形成的流体通道以提供所述珠粒的流体路径，其中所述封盖构件包含第二电极，其中所述控制器可经操作以在所述第一电极与所述第二电极之间提供电压，所述电压足以致使孔中的流体进行电解，在所述流体中产生一个或多个气泡以连同所述珠粒一起上升到孔顶部。45.根据条款44所述的系统，其中所述单分散珠粒的直径变化小于10％。46.根据条款44或45所述的系统，其中所述单分散珠粒比每个孔的直径小约12.5％。47.根据条款44-46中任一项所述的系统，其中所述单分散珠粒的直径为约35μm，每个孔的直径为约40μl，并且每个孔的深度为约55μl。48.根据条款44-47中任一项所述的系统，其中所述单分散珠粒的寡核苷酸合成衬底的连接基团负载能力在30至100μmol/g范围内。49.根据条款44-48中任一项所述的系统，其另外包含珠粒收集装置，可经操作以收集从所述微芯片的孔移出的单分散珠粒。50.根据条款44-49中任一项所述的系统，其另外包含第一多孔收集板，可经操作以接收从所述珠粒收集装置收集的单分散珠粒。51.一种用于无模板引导的核酸分子合成的多孔板，所述板包含：位于所述板的多个孔的每一个中的珠粒和存在于所述多个孔的一个或多个孔中的光生酸，其中所述珠粒直径在1.0μm与100μm之间。52.根据条款51所述的多孔板，其中所述板中的孔数在10与2,000,000之间。53.根据条款51或52所述的多孔板，其中每个孔的总体积在6.3×10-6μl与6.3×10-4μl之间。54.根据条款51-53中任一项所述的多孔板，其中每个孔可操作地连接到光源。55.根据条款51-54中任一项所述的多孔板，其中所述板的孔连接到一个或多个微流体通道用于引入和去除试剂。56.一种用于生成经组装的核酸分子的方法，所述方法包含：a)合成多个核酸分子，其中每个核酸分子是以约50飞摩尔至约15,000飞摩尔的平均量在板孔中制备，其中所述孔可操作地连接到光源用于产生光生酸；b)组合(a)中生成的核酸分子以产生池；c)接合(b)中所形成的池中所存在的一些或全部核酸分子以形成多个较大核酸分子；d)从(c)中所形成的多个较大核酸分子排除含有序列错误的核酸分子以产生经纠错的核酸分子池；和e)组装所述经纠错的核酸分子池中的核酸分子以形成所述经组装的核酸分子。57.根据条款56所述的方法，其中(c)中的接合是通过聚合酶链反应和/或连接酶介导。58.根据条款56或57所述的方法，其中所述经组装的核酸分子是由至少五个核酸分子构成。59.根据条款56-58中任一项所述的方法，其中所述经组装的核酸分子是由五个至五千个核酸分子构成。60.根据条款56-59中任一项所述的方法，其中所述经组装的核酸分子为至少20千碱基。61.根据条款56-60中任一项所述的方法，其中所述经组装的核酸分子在10千碱基与1巨碱基之间。62.根据条款56-61中任一项所述的方法，其中所述经组装的核酸分子是闭合环状的。63.根据条款62所述的方法，其中所述经组装的核酸分子是质粒。64.根据条款56-63中任一项所述的方法，其中两个或更多个经组装的核酸分子是同时形成的。65.根据条款56-64中任一项所述的方法，其中在所述经纠错的核酸分子池中组装所述核酸分子发生在真菌细胞中。66.根据条款56-65中任一项所述的方法，其中在(c)或(e)中的任一个或两个中生成的经组装的核酸分子被组装和引入到克隆载体中。67.根据条款56-66中任一项所述的方法，其中所述板的孔包含至少一种质子载体以减少暴露于所述光生酸的核酸分子的降解。68.根据条款67所述的方法，其中所述至少一种质子载体选自2-氯-6-甲基吡啶和二苯胺。69.一种非瞬时性计算机可读存储介质，其经通过处理器可执行的指令编码，用于生成经组装的核酸分子，所述指令包含用于以下的指令：a)合成多个核酸分子，其中每个核酸分子是以约50飞摩尔至约15，000飞摩尔的平均量在板孔中制备，其中所述孔可操作地连接到光源用于产生光生酸；b)组合(a)中生成的核酸分子以产生池；c)接合(b)中所形成的池中所存在的一些或全部核酸分子以形成多个较大核酸分子；d)从(c)中所形成的多个较大核酸分子排除含有序列错误的核酸分子以产生经纠错的核酸分子池；和e)组装所述经纠错的核酸分子池中的核酸分子以形成所述经组装的核酸分子。70.一种用于生成经组装的核酸分子的系统，所述系统包含：处理器；和经处理器可执行指令编码的存储器，所述指令用于：a)合成多个核酸分子，其中每个核酸分子是以约50飞摩尔至约15,000飞摩尔的平均量在板孔中制备，其中所述孔可操作地连接到光源用于产生光生酸；b)组合(a)中生成的核酸分子以产生池；c)接合(b)中所形成的池中所存在的一些或全部核酸分子以形成多个较大核酸分子；d)从(c)中所形成的多个较大核酸分子排除含有序列错误的核酸分子以产生经纠错的核酸分子池；和e)组装所述经纠错的核酸分子池中的核酸分子以形成所述经组装的核酸分子。71.一种用于生成经组装的核酸分子的方法，所述方法包含：a)合成多个核酸分子，其中每个核酸分子是以约50飞摩尔至约15,000飞摩尔的平均量在板孔中制备，其中所述孔包含至少一种酸用于所述核酸分子的脱保护和至少一种质子载体以减少暴露于所述至少一种酸的核酸分子的降解；b)组合(a)中生成的核酸分子以产生池；c)接合(b)中所形成的池中所存在的一些或全部核酸分子以形成多个较大核酸分子；d)从(c)中所形成的多个较大核酸分子排除含有序列错误的核酸分子以产生经纠错的核酸分子池；和e)组装所述经纠错的核酸分子池中的核酸分子以形成所述经组装的核酸分子。72.根据条款71所述的方法，其中所述至少一种质子载体选自2-氯-6-甲基吡啶和二苯胺。73.根据条款71或72所述的方法，其中所述至少一种酸选自电化学生成酸和光生酸。74.一种非瞬时性计算机可读存储介质，其经通过处理器可执行的指令编码，用于生成经组装的核酸分子，所述指令包含用于以下的指令：a)合成多个核酸分子，其中每个核酸分子是以约50飞摩尔至约15，000飞摩尔的平均量在板孔中制备，其中所述孔包含至少一种酸用于所述核酸分子的脱保护和至少一种质子载体以减少暴露于所述至少一种酸的核酸分子的降解；b)组合(a)中生成的核酸分子以产生池；c)接合(b)中所形成的池中所存在的一些或全部核酸分子以形成多个较大核酸分子；d)从(c)中所形成的多个较大核酸分子排除含有序列错误的核酸分子以产生经纠错的核酸分子池；和e)组装所述经纠错的核酸分子池中的核酸分子以形成所述经组装的核酸分子。75.一种用于生成经组装的核酸分子的系统，所述系统包含：处理器；和经处理器可执行指令编码的存储器，所述指令用于：a)合成多个核酸分子，其中每个核酸分子是以约50飞摩尔至约15,000飞摩尔的平均量在板孔中制备，其中所述孔包含至少一种酸用于所述核酸分子的脱保护和至少一种质子载体以减少暴露于所述至少一种酸的核酸分子的降解；b)组合(a)中生成的核酸分子以产生池；c)接合(b)中所形成的池中所存在的一些或全部核酸分子以形成多个较大核酸分子；d)从(c)中所形成的多个较大核酸分子排除含有序列错误的核酸分子以产生经纠错的核酸分子池；和e)组装所述经纠错的核酸分子池中的核酸分子以形成所述经组装的核酸分子。76.一种用于获取由碱可裂解的连接基团连接到固体支撑物的核酸的方法，所述方法包含：a)生成电化学生成碱；b)用所述电化学生成碱从所述固体支撑物裂解所述核酸；c)使所裂解的核酸与固相材料接触以使得核酸保留在所述固相材料上；和d)用从所述核酸去除保护基的试剂洗脱所述固相材料上的核酸，其中所述固体支撑物是直径范围介于约1.0μm至约100μm的珠粒，并且其中所述珠粒位于多孔板的多个孔的每一个中。77.根据条款76所述的方法，其中所述用于从所述核酸去除保护基的试剂是甲胺。78.根据条款76或77所述的方法，其中所述固体支撑物是直径范围介于约30μm至约40μm的珠粒。79.根据条款78所述的方法，其中所述珠粒处于多孔板的孔中，其中所述多孔板的每个孔的总体积范围介于约1×10-6μl至约1×10-4μl。80.根据条款79所述的方法，其中所述孔可操作地连接到至少一个电极。81.根据条款76-80中任一项所述的方法，其中所述电化学生成碱是由利用所述至少一个电极还原的偶氮甲烷生成的。82.根据条款76-80中任一项所述的方法，其另外在所裂解的核酸与所述固相材料接触之后包含至少一个水性洗涤步骤。83.根据条款82所述的方法，其另外在所述洗涤步骤之后包含至少一个干燥步骤。84.根据条款83所述的方法，其中所述至少一个干燥步骤是用氮气和空气中的至少一种来进行。85.根据条款76-84中任一项所述的方法，其中所述用于从所述核酸去除保护基的试剂的量在0.1与10μl之间。86.根据条款76-85中任一项所述的方法，其中所述固相材料装载到多孔板中，其中所述多孔板的每个孔的总体积范围介于0.1至25μl。87.一种非瞬时性计算机可读存储介质，其经通过处理器可执行的指令编码，用于获取由碱可裂解的连接基团连接到固体支撑物的核酸，所述指令包含用于以下的指令：a)生成电化学生成碱；b)用所述电化学生成碱从所述固体支撑物裂解所述核酸；c)使所裂解的核酸与固相材料接触以使得核酸保留在所述固相材料上；和d)用从所述核酸去除保护基的试剂洗脱所述固相材料上的核酸，其中所述固体支撑物是直径范围介于约1.0μm至约100μm的珠粒，并且其中所述珠粒位于多孔板的多个孔的每一个中。88.一种用于获取由碱可裂解的连接基团连接到固体支撑物的核酸的系统，所述系统包含：处理器；和经处理器可执行指令编码的存储器，所述指令用于：a)生成电化学生成碱；b)用所述电化学生成碱从所述固体支撑物裂解所述核酸；c)使所裂解的核酸与固相材料接触以使得核酸保留在所述固相材料上；和d)用从所述核酸去除保护基的试剂洗脱所述固相材料上的核酸，其中所述固体支撑物是直径范围介于约1.0μm至约100μm的珠粒，并且其中所述珠粒位于多孔板的多个孔的每一个中。89.一种用于从无引导的核酸分子合成多孔板或微阵列获取核酸分子的方法，所述方法包含：a)合成第一多个核酸分子，其中所述第一多个中的每个核酸分子被设计成具有已确定序列并以约10阿托摩尔至约1皮摩尔的平均量在第一多孔板的孔中制备；b)合成第二多个核酸分子，其中所述第二多个中的每个核酸分子被设计成与所述第一多个中的核酸分子互补并以约10阿托摩尔至约1皮摩尔的平均量在第二多孔板的孔中制备；c)使来自所述第一多孔板的第一多个核酸分子脱除保护基和裂解；d)使来自所述第二多孔板的第二多个核酸分子脱除保护基；e)使所述第一多个核酸分子与所述第二多个核酸分子在杂交条件下接触以生成杂交的核酸分子；f)通过向所述第二多孔板添加变性溶液而使所述杂交的核酸分子变性；和g)从所述第二多孔板获取所述变性的核酸分子。90.根据条款89所述的方法，其中所述变性溶液包含naｏh。91.根据条款89或90所述的方法，其另外在所述变性步骤之前包含洗涤步骤。92.一种非瞬时性计算机可读存储介质，其经通过处理器可执行的指令编码，用于从无引导的核酸分子合成多孔板获取核酸分子，所述指令包含用于以下的指令：a)合成第一多个核酸分子，其中所述第一多个中的每个核酸分子被设计成具有已确定序列并以约10阿托摩尔至约1皮摩尔的平均量在第一多孔板的孔中制备；b)合成第二多个核酸分子，其中所述第二多个中的每个核酸分子被设计成与所述第一多个中的核酸分子互补并以约10阿托摩尔至约1皮摩尔的平均量在第二多孔板的孔中制备；c)使来自所述第一多孔板的第一多个核酸分子脱除保护基和裂解；d)使来自所述第二多孔板的第二多个核酸分子脱除保护基；e)使所述第一多个核酸分子与所述第二多个核酸分子在杂交条件下接触以生成杂交的核酸分子；f)通过向所述第二多孔板添加变性溶液而使所述杂交的核酸分子变性；和g)从所述第二多孔板获取所述变性的核酸分子。93.一种用于从无引导的核酸分子合成多孔板获取核酸分子的系统，所述系统包含：处理器；和经处理器可执行指令编码的存储器，所述指令用于：a)合成第一多个核酸分子，其中所述第一多个中的每个核酸分子被设计成具有已确定序列并以约10阿托摩尔至约1皮摩尔的平均量在第一多孔板的孔中制备；b)合成第二多个核酸分子，其中所述第二多个中的每个核酸分子被设计成与所述第一多个中的核酸分子互补并以约10阿托摩尔至约1皮摩尔的平均量在第二多孔板的孔中制备；c)使来自所述第一多孔板的第一多个核酸分子脱除保护基和裂解；d)使来自所述第二多孔板的第二多个核酸分子脱除保护基；e)使所述第一多个核酸分子与所述第二多个核酸分子在杂交条件下接触以生成杂交的核酸分子；f)通过向所述第二多孔板添加变性溶液而使所述杂交的核酸分子变性；和g)从所述第二多孔板获取所述变性的核酸分子。94.一种浓缩在微芯片上合成的核酸分子的方法，所述方法包含：将第一体积流体中的一个或多个固体支撑物从所述微芯片上所形成的多个孔结构转移到第一多孔收集板的孔中的第二体积流体中，其中已在所述微芯片上合成的核酸附接到所述一个或多个固体支撑物，其中所述一个或多个固体支撑物使用珠粒收集装置转移，其中所述珠粒收集装置与所述微芯片和所述第一多孔收集板流体连接，其中所述第一多孔收集板包含多个孔和在所述多个孔的顶表面上或在所述多个孔内形成的流体渗透结构，任选地其中所述珠粒收集装置包含控制器，其可经操作以一个或多个自由度移动所述微流体装置，将所述一个或多个固体支撑物从所述微芯片递送到所述第一多孔收集板的孔中，并且其中所述第一多孔收集板的孔中的所述第二体积流体少于所述第一体积流体，从而浓缩在所述微芯片上合成的核酸分子。95.根据条款94所述的方法，其中所述浓缩包含使所述第一体积流体减少约10至约1.000倍。96.根据条款94或条款95所述的方法，其中所述一个或多个固体支撑物是直径范围介于约1.0μm至约100μm的珠粒。97.根据条款96所述的方法，其中所述珠粒是单分散的。98.根据条款94-97中任一项所述的方法，其中所述微芯片中多个孔结构的每个孔的总体积范围介于1×10-6μl至1×10-4μl。99.根据条款94-98中任一项所述的方法，其另外包含第二多孔收集板，其中所述第二多孔收集板包含多个孔结构和在所述多个孔结构的底表面上形成的流体渗透结构，其中所述第二多孔收集板置于所述第一多孔收集板的顶部上以使得所述第二多孔收集板的多个孔结构与所述第一多孔收集板的多个孔结构对准。100.根据条款94-99中任一项所述的方法，其另外在将所述一个或多个固体支撑物转移到所述流体渗透结构之后包含从所述一个或多个固体支撑物裂解所述核酸的步骤。101.根据条款100所述的方法，其另外包含将所述裂解的核酸洗脱到所述第一多孔收集板的孔中的步骤。102.根据条款94-101中任一项所述的方法，其另外包含穿刺所述流体渗透结构以将所述一个或多个固体支撑物递送到所述第一多孔收集板的孔中的步骤。103.根据条款102所述的方法，其中施加压力以穿刺所述流体渗透结构。104.根据条款94至103中任一项所述的方法，其中用于转移所述一个或多个固体支撑物的所述珠粒收集装置是微流体芯片。105.根据条款94至103中任一项所述的方法，其中所述珠粒收集装置包含针结构，其可经操作以1)通过穿刺所述流体渗透结构而将来自所述微芯片的一个或多个固体支撑物放置于所述第一多孔收集板的孔中，和/或2)从所述第一多孔收集板中放置所述一个或多个固体支撑物的孔去除流体。106.根据条款105所述的方法，其中所述针结构包含第一管腔，其可经操作以通过穿刺所述流体渗透结构而将来自所述微芯片的一个或多个固体支撑物放置于所述第一多孔收集板的孔中；和第二管腔，其可经操作以从所述第一多孔收集板中放置所述一个或多个固体支撑物的孔去除流体。107.根据条款94-106中任一项所述的方法，其中所述微芯片经编程以从所述微芯片中所关注的特定孔提取所述固体支撑物并且经由所述珠粒收集装置将所述固体支撑物转移到所述第一多孔收集板的多个孔的可寻址的孔中。108.根据条款94-107中任一项所述的方法，其中所述第一多孔收集板的每个孔的总体积在1与25μl之间。109.根据条款94-108中任一项所述的方法，其另外在将所述一个或多个固体支撑物转移到所述第一多孔收集板的孔中之前包含在所述微芯片上形成的所述多个孔结构的孔中，在所述固体支撑物上合成核酸的步骤。110.根据条款94-109中任一项所述的方法，其中每个孔中已形成在孔底部可由控制器单独控制的第一电极，其中所述微芯片另外包含封盖构件，其排列在所述微芯片的顶部上并包含其中形成的流体通道以提供所述固体支撑物的流体路径，其中所述封盖构件包含第二电极，并且其中所述控制器可经操作以在所述第一电极与所述第二电极之间提供电压，所述电压足以致使孔中的流体进行电解，在所述流体中产生一个或多个气泡以连同所述固体支撑物一起上升到孔顶部。111.一种非瞬时性计算机可读存储介质，其经通过处理器可执行的指令编码，用于浓缩在微芯片上合成的核酸分子，所述指令包含用于以下的指令：将第一体积流体中的一个或多个固体支撑物从所述微芯片上所形成的多个孔结构转移到第一多孔收集板的孔中的第二体积流体中，其中已在所述微芯片上合成的核酸附接到所述一个或多个固体支撑物，其中所述一个或多个固体支撑物使用珠粒收集装置转移，其中所述珠粒收集装置与所述微芯片和所述第一多孔收集板流体连接，其中所述第一多孔收集板包含多个孔和在所述多个孔的顶表面上或在所述多个孔内形成的流体渗透结构，其中所述珠粒收集装置包含控制器，其可经操作以一个或多个自由度移动所述珠粒收集装置，将所述一个或多个固体支撑物从所述微芯片递送到所述第一多孔收集板的孔中，并且其中所述第一多孔收集板的孔中的所述第二体积流体少于所述第一体积流体，从而浓缩在所述微芯片上合成的核酸分子。112.一种用于浓缩在微芯片上合成的核酸分子的系统，所述系统包含：处理器；和经处理器可执行指令编码的存储器，所述指令用于：将第一体积流体中的一个或多个珠粒从所述微芯片上所形成的多个孔结构转移到第一多孔收集板的孔中的第二体积流体中，其中已在所述微芯片上合成的核酸附接到所述一个或多个珠粒，珠粒收集装置用于转移所述一个或多个珠粒，其中所述珠粒收集装置与所述微芯片和第一多孔收集板流体连接，其中所述第一多孔收集板包含多个孔，任选地包含控制器，其可经操作以一个或多个自由度移动所述珠粒收集装置，将所述一个或多个固体支撑物从所述微芯片递送到所述第一多孔收集板的孔中。113.根据条款112所述的系统，其中所述珠粒收集装置是微流体芯片，其包含使得所述一个或多个珠粒沿第一方向移动的第一通道和使得流体沿不同于所述第一方向的第二方向移动的第二通道。114.根据条款113所述的系统，其中所述微流体芯片另外包含可由控制器控制的声学模块以促进所述第一通道中的珠粒、所述第二通道中的流体或这两者的移动。115.根据条款112所述的系统，其中所述珠粒收集装置包含针结构和相关联管道。116.根据条款115所述的系统，其中所述第一多孔收集板包含在所述多个孔的顶表面上或在所述多个孔内形成的流体渗透结构并且其中所述针结构包含第一管腔，其可经操作以通过穿刺所述流体渗透结构而将来自所述微芯片的一个或多个珠粒放置于所述第一多孔收集板的孔中；和第二管腔，其可经操作以从所述第一多孔收集板中放置所述一个或多个珠粒的孔去除流体。117.根据条款116所述的系统，其另外包含第二多孔收集板，其中所述第二多孔收集板包含多个孔结构和在所述多个孔结构的底表面上形成的流体渗透结构，其中所述第二多孔收集板置于所述第一多孔收集板的顶部上以使得所述第二多孔收集板的多个孔结构与所述第一多孔收集板的多个孔结构对准。118.一种用于35至200个碱基长度的寡核苷酸固相合成的单分散多孔珠粒，其中所述珠粒是用反应性基团涂布的聚苯乙烯珠粒并且其中所述珠粒包含：10至100μm的直径，其中变化系数小于10％；在100至500m2/g范围内的表面积；在约60％至约80％范围内的孔隙率；任选地约2％至约8％的胺含量；15μmol/g至100μmol/g的连接基团负载能力；任选地其中所述珠粒携载连接基团，并且其中所述连接基团是通用连接基团。当前第1页12