技术领域本发明涉及一种表达脯氨酸氨肽酶的重组毕赤酵母及其构建方法，属于生物工程技术及基因工程领域。
背景技术：
脯氨酸氨肽酶作为一种外切型蛋白酶，在食品、医药和化工等多种领域都有很重要的应用。可用于去除蛋白水解液中的苦味、蛋白质的深度水解、生物活性肽的制备及重组蛋白固定剂或蛋白序列测定所需的工具酶等，在食品、医药保健与化工行业应用前景广阔。米曲霉是一种广泛用于生产的发酵工业菌，其表达的脯氨酸氨肽酶具有良好的理化性质。但由于其表达量低，蛋白稳定性差，且纯化步骤繁琐，很难满足市场需求。目前对脯氨酸氨肽酶的异源表达研究主要集中于大肠杆菌等原核宿主，尽管提高了重组蛋白的表达量，但又存在以下缺点：1)不易分泌表达、易形成包涵体；2)产内毒素具有安全隐患，不适用于食品酶的生产；3)包含有目的基因的质粒易丢失，生产中需要添加大量抗生素，破坏了生态环境。因此，构建一株能高效稳定表达、遗传背景清晰且利于纯化的氨肽酶重组菌具有重要意义。
技术实现要素：
本发明要解决的第一个技术问题是提供一株重组表达脯氨酸氨肽酶的毕赤酵母工程菌。所述毕赤酵母工程菌是以毕赤酵母GS115为表达宿主，以pPIC9K为表达载体，表达了核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的脯氨酸氨肽酶基因。所述SEQIDNO.2所示的脯氨酸氨肽酶基因，是对来自米曲霉的脯氨酸氨肽酶基因(SEQIDNO.1)进行优化后得到的。本发明要解决的第二个技术问题是提供一种构建所述毕赤酵母工程菌的方法，主要包括以下步骤：(1)设计引物扩增SEQIDNO.2所示的目的基因；扩增得到的氨肽酶基因编码的氨肽酶的N-端含有组氨酸标签；(2)将PCR产物连接到表达载体pPIC9K上，获得重组质粒；(3)测序正确的重组载体用PmeI进行单酶切，经酶切线性化之后，同毕赤酵母感受态细胞混匀，进行电击转化，筛选获取重组毕赤酵母。本发明还提供一种应用所述毕赤酵母工程菌发酵生产脯氨酸氨肽酶的方法，主要包括以下步骤：①挑取YPD平板上活化的菌落于25mLBMGY培养基中，30℃、230rpm培养20h；②将培养液置于无菌离心管中离心收集沉淀，将沉淀重溶于25mLBMMY培养基中30℃培养168h，每隔24h向培养液中添加终浓度0.5％的甲醇进行甲醇诱导；③将获得的发酵液，离心收集上清，即为氨肽酶胞外粗酶液，菌体沉淀稀释一定倍数后超声破碎，破碎液离心后即得胞内粗酶液。本发明对氨肽酶基因进行了优化，并首次在毕赤酵母中成功表达了重组脯氨酸氨肽酶。相比表达未经优化的氨肽酶基因的重组毕赤酵母，胞外酶活提高到1.66倍，胞内酶活提高到2.1倍。与该基因在原核宿主大肠杆菌中的胞内表达不同，脯氨酸氨肽酶在重组毕赤酵母中得到了部分分泌表达，且经过摇瓶初步优化后发酵液上清中的酶活为5.6U/mL，胞内酶活为61.26U/mL。本发明方法简单有效，构建的重组毕赤酵母能高效表达脯氨酸氨肽酶，且重组蛋白包含组氨酸标签，利于后期重组蛋白的纯化以及为进一步研究脯氨酸氨肽酶的特性、结构等提供所需蛋白。附图说明图1脯氨酸氨肽酶(pap)重组子的PCR验证(M：Marker，1-5：目的基因)图2重组质粒pPIC9K-pap的双酶切验证。(M：Marker，1-3：pPIC9K-pap重组质粒的双酶切，P：pPIC9K质粒)图3重组质粒pPIC9K-pap结构示意图图4重组脯氨酸氨肽酶的SDS-PAGE分析(M：标准蛋白Marker，1：P.pastorisGS115/pPIC9K-pap细胞沉淀破碎上清，2:目的蛋白)图5重组毕赤酵母的生长曲线图6诱导起始时间对脯氨酸氨肽酶产酶的影响图7甲醇浓度对酵母产脯氨酸氨肽酶的影响具体实施方式所用培养基：LB(g/L)：胰蛋白胨10，酵母膏5，NaCl10，pH7.0；YPD(g/L)：蛋白胨20，葡萄糖20，琼脂20；MD(g/L)：葡萄糖20，琼脂20，YNB13.4，生物素0.4；MM(g/L)：甲醇5mL/L，琼脂20，YNB13.4，生物素0.4；BMGY(g/L):蛋白胨20，甘油10，酵母膏10，YNB13.4，生物素0.4，100mM磷酸盐缓冲液pH6.0：BMMY(g/L):蛋白胨20，甲醇10，酵母膏10，YNB13.4，生物素0.4，100mM磷酸盐缓冲液pH6.0；T4DNA连接酶、限制性内切酶BglΙI、EcoRI、NotΙ和SalI以及共用Buffer购自宝生物工程(大连)有限公司。脯氨酸氨肽酶酶活测定方法：以L-脯氨酸-对硝基苯胺为底物，加入2mLpH7.5的Tris-HCl缓冲液，1mL稀释适当倍数的酶液和1mL底物(2mM)，50℃反应10min，在405nm处测定吸光值，计算酶活力。脯氨酸氨肽酶酶活定义：在一定条件下，每分钟分解L-脯氨酸-对硝基苯胺产生1μM的对硝基苯胺所需要的酶量，即为一个酶活单位。(其中Abs为405nm处吸光值)实施例1表达脯氨酸氨肽酶的重组毕赤酵母的构建方法。为实现脯氨酸氨肽酶基因在毕赤酵母中的表达，根据脯氨酸氨肽酶基因设计引物。上游引物P1：5＇-CCGGAATTCATGGCTGCCAAACTAGTAGAC-3＇(下划线表示EcoRΙ酶切位点)；下游引物P2：5＇-ATAGTTTAGCGGCCGCCTAATCAATAGAGTCG-3＇(下划线表示NotΙ酶切位点)；以包含脯氨酸氨肽酶基因的pET-28a-pap质粒为模板，该质粒的构建方法记载于专利号为ZL201310656778.3、发明名称为“一株生产脯氨酸氨肽酶的基因工程菌及其构建方法”的专利中。P1及P2为引物扩增目的基因。PCR体系为(50μL)：PrimerSTAR酶25μL；pET-28a-pap质粒1μL；P11μL；P21μL；ddH2O22μL。PCR条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s；72℃后延伸5min；33个循环。将扩增获得的目的基因与质粒pPIC9K用EcoRI及NotI双酶切，双酶切体系如下：双酶切体系(50μL)体系：目的基因/质粒16μL，限制酶各2μL，双蒸水10μL，10×H、BSABuffer各5μL。37℃双酶切反应5h，琼脂糖凝胶电泳35min后，胶回收目的条带。将双酶切后的目的基因与载体按摩尔质量比8:1的比率混合，16℃过夜并转化E.coliJM109。涂布于含氨苄抗性(100μg/mL)的LB培养基中培养12-16h。挑取3株菌进行PCR扩增及双酶切验证，验证正确的进行序列测定，测序正确的即为重组载体pPIC9K-pap。毕赤酵母感受态细胞的制作：(1)挑取毕赤酵母GS115单菌落接种到5mLYPD试管培养过夜(10h)；(2)以1％接种量接到50mLYPD三角摇瓶中，30℃培养过夜，至OD600达到2.0左右(12h)；(3)取50mL灭菌的离心管，每个离心管中装入25mL菌液，置于冰上半小时；(4)4℃，4000rpm离心6min，用50mL预冷的无菌水悬浮；(5)4℃，4000rpm离心6min，用25mL预冷的无菌水悬浮；(6)按步骤(5)，离心6min，用10mL预冷的山梨醇洗涤；(7)将沉淀重悬于80μL山梨醇以得到感受态细胞。取上述感受态细胞与PmeI线性化处理的pPIC9K-pap混合，于1500V，400Ω，25/50μF，4-6ms条件下进行电转，将电转液涂布于MD平板上，30℃培养2-4d，待转化子长出后，挑取单菌落分别点样到MM及MD平板上，30℃培养2d，其中在MD平板上正常生长但是在MM平板上生长较慢的即为含有目的基因的重组毕赤酵母。实施例2重组毕赤酵母表达脯氨酸氨肽酶的方法挑取活化后的重组毕赤酵母菌落于25mL/250mL的BMGY培养基中，230rpm、30℃，培养20h，而后将培养液5000rpm离心5min收集菌体，用BMMY重悬菌体并置于25/50mL的三角瓶中，230rpm、25℃培养120h，中间每隔24h添加终浓度0.5％的甲醇诱导并取200μL发酵液检测酶活。将获得的发酵液，10000rpm离心5min，上清即为氨肽酶胞外粗酶液，菌体沉淀稀释一定倍数后超声破碎30min，10000rpm离心5min后即得胞内粗酶液。破碎条件为6mm探头功率400W，工作10s，间歇10s。测得胞外酶活为0.93U/mL，胞内酶活为4.21U/mL。实施例3重组脯氨酸氨肽酶的基因优化及组氨酸标签的添加(1优化后的基因序列测序后插入pPIC9K载体。将该载体线性化后电转化到至GS115中诱导检测酶活，构建方法参照实施例1，表达方法参照实施例2。测得胞外酶活为1.55U/mL，提高到1.66倍，胞内酶活提高到2.1倍。(2)为了利于后期重组蛋白的提取纯化，以优化后的脯氨酸氨肽酶基因设计两对引物，分别在基因的N端和C端添加组氨酸标签。N端加组氨酸标签引物：上游引物P3：5＇-CCGGAATTCATGCATCATCATCATCATCATGCTGCCAAGCTTGT-3＇(下划线表示EcoRΙ酶切位点,虚线表示6×His序列)；下游引物P4：5＇-ATAGTTTAGCGGCCGCTTAATCAATACTGTCATCTCTC-3＇(下划线表示NotΙ酶切位点)；C端加组氨酸标签引物：上游引物P5：5＇-CCGGAATTCATGGCTGCCAAGCTTGTT-3＇(下划线表示EcoRΙ酶切位点)；下游引物P6：5＇-ATAGTTTAGCGGCCGCTTAATGATGATGATGATGATGATCAATACTGTCATCTCTC-3＇(下划线表示NotΙ酶切位点，虚线表示6×His反向互补序列)。分别以P3、P4和P5、P6为引物，以包含有优化后氨肽酶序列的重组质粒为模板进行PCR，连接pPIC9K后进行测序。提取测序成功的质粒，分别用BglII和SalI进行线性化，构建Muts和Mut+的重组子。挑取重组子在遗传霉素终浓度为2mg/mL的YPD平板上筛选，挑取生长较好的进行甲醇诱导培养，检测酶活。构建方法参照实施例1，表达方法参照实施例2。结果表明C端加6×His标签的菌株胞内外均无酶活，N端添加6×His标签的菌株胞内外酶活均与之前相近，N端的组氨酸标签对重组菌产氨肽酶无影响，在C端的6×His会抑制重组氨肽酶的表达。此外，甲醇利用快型Mut+的重组子在诱导96小时后，其胞内外酶活比Muts型高35％，胞外酶活比Muts型高25％，因此选择Mut+的重组菌株作为后期研究的发酵菌株。实施例4重组毕赤酵母的摇瓶发酵条件优化：(1)诱导甲醇浓度：重组毕赤酵母转接入BMMY培养液后，每隔24h加入一定浓度的甲醇进行诱导，浓度选择1.0％，1.2％，1.4％，1.6％，1.8％，2.0％，定期取样进行氨肽酶酶活的测定。(2)转接时间：将重组毕赤酵母接种于BMGY，分别培养12h、14h、16h、18h、20h然后转接至BMMY培养基中，230r·min-1、30℃恒温摇床进行发酵培养，定期加甲醇诱导并取样测发酵液酶活。(3)诱导起始pH：将重组毕赤酵母分别转接于用10mol·L-1KOH和纯H3PO4(均过滤除菌)调配的pH值为5.0、6.0、7.0、8.0的BMMY培养基，230r·min-1、30℃恒温摇床进行发酵培养，定期加甲醇诱导并取样测发酵液酶活。(4)诱导温度：酵母菌可在20-30℃的温度范围内生长，其中30℃为最适生长温度，而诱导期较低的温度可能有助于外源蛋白表达量的提高。故生长期选择温度30℃，而诱导期选择20℃、23℃、26℃、28℃和30℃几个不同温度梯度进行诱导表达。定期加甲醇诱导并取样测发酵液酶活。(5)山梨醇添加量：山梨醇作为一种非抑制碳源，不会抑制菌体对甲醇的利用，反而会有效缓解细胞大量表达外源蛋白时对自身所造成的代谢负担，同时也可以减少甲醇的毒害作用，提高转化效率。故诱导期在摇瓶培养基中添加不同初始浓度的山梨醇(3g·L-1、5g·L-1、7g·L-1、9g·L-1、11g·L-1)，考察其对氨肽酶酶活表达量的影响。经过对产氨肽酶重组菌的摇瓶优化，结果表明诱导起始时间及甲醇浓度对发酵产酶具有重大影响。如图5所示，重组菌在10-24h处于快速生长期，在BMGY培养基中培养18h后即可以保证积累足够的菌体又可以使重组菌具有良好的活性。经过优化后，重组毕赤酵母的最终表达条件为：挑取YPD平板上活化的单菌落于的25mLBMGY培养基(pH6.0)中，30℃、230rpm培养18h后，转接到pH为6.0的等体积BMMY培养基中，30℃培养144h，每隔24h向培养液中添加终浓度1.8％的甲醇进行甲醇诱导。经过摇瓶初步优化后脯氨酸氨肽酶表达量大幅度提高，发酵液上清中的酶活为5.6U/mL，胞内酶活为61.26U/mL。虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。