用于干扰素治疗慢性乙型肝炎早期病毒学反应的预测模型及检测试剂盒的制作方法

本发明属医学分子生物学技术领域，涉及干扰素治疗慢性乙型肝炎的疗效预测，具体涉及血浆mirna联合alt表达水平预测干扰素治疗慢乙肝早期病毒学反应，还涉及检测血浆mirna水平的方法和试剂盒。

背景技术：

现有技术公开了乙型肝炎病毒（hbv）感染是一个重要的全球健康问题。研究显示，hbv感染能引起多种慢性肝脏疾病，包括无症状慢性hbv携带感染、慢性肝炎甚至进展为肝纤维化、肝衰竭以及肝癌。调查显示，在亚洲，成年hbv感染者中5%-10%发展成为慢性乙型肝炎，每年有超过50万中国人死于hbv相关的肝脏疾病。业内认为，hbv感染是一个复杂的疾病进程涉及到肝细胞、hbv以及免疫系统的相互作用，其慢性化的准确机制仍不是很清楚，因此，抗病毒治疗的主要目的是希望能够清除或长期地抑制病毒复制，从而降低或减缓肝脏疾病的进程。针对慢性乙型肝炎现有的治疗选择包括核苷类似物(nucs)和聚乙二醇干扰素a-2a(peg-ifn)，其中，核苷类似物的抗病毒作用主要体现在抑制病毒聚合酶活性，实践显示，核苷类似物在慢乙肝患者的长期治疗中可以有效地维持对hbv复制水平的抑制，但是长期使用核苷类似物可能出现抗病毒耐药，停药后容易出现复发；peg-ifn是治疗慢乙肝的重要一线药物，特别是对于hbeag阳性的病人，能够促使其中30-40%的病人实现hbeag血清学转化，但是，仍然有多数患者接受peg-ifn治疗后的结局并不理想（近70%患者对治疗无应答），而且ifn治疗往往会带来如流感样症状、白细胞及血小板减少等副作用；因此，为了提高干扰素治疗的整体应答率以及减少不良反应的出现，在慢乙肝病人接受干扰素治疗前，筛选出有可能受益于该治疗的病人显得尤为重要。研究表明在hbeag阳性及阴性病人中，一些病毒和宿主特性可能与治疗反应性相关，然而，只有部分病人对peg-ifn的治疗反应变异性可以被这些特性解释，治疗效果可能也由肝内其他因素决定。已经有若干研究致力于明确抗病毒反应与聚乙二醇干扰素(peg-ifn)疗效的相关性，有报道称，对于hbeag阳性的慢乙肝病人而言，低基线hbvdna、高基线alt水平与干扰素治疗的良好结局有着独立相关性；此外，肝内基因hla-dpb1、serpin-e1联合hbeag状态、hbv基因型、hbsag基线水平形成的多参数模型能够正确区分90%的病人，其中hla-dpb1、serpin-e1可以作为独立的预测因子；这些研究提示某些细胞因子或临床指标可能可以作为预测干扰素疗效的指标，但是目前仍然存在包括预测准确度低、病例数不足、预测参数繁多等若干问题，这方面仍然有很多工作值得深入。

目前已知的与治疗疗效相关的因素有：1.治疗前alt水平，2.治疗前hbvdna水平,3.治疗前hbsag水平，4.性别，5.肝脏组织学状态，6.治疗过程中hbsag滴度动态变化等等；然而，目前相关指标的预测能力尚有限，急需一种能在血液中方便检测到的，有较高预测准确度的分子标志物及预测模型。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，提供一种能在血液中方便检测到的，有较高预测准确度的分子标志物及预测模型；尤其涉及血浆mirna联合alt表达水平预测干扰素治疗慢乙肝早期病毒学反应，及检测血浆mirna水平的方法和试剂盒。

本发明提供了用于预测干扰素治疗慢性乙型肝炎早期病毒学反应的预测因子及其预测模型，其包括：两种血浆mirna以及alt；同时提供了相应的、高效的检测血浆mirna表达水平的方法。本发明通过将血浆中mirna表达水平和血浆中alt水平进行统计学分析,代入预测公式后进行类别判断,用于临床判断干扰素治疗慢性乙型肝炎的早期疗效；与现有技术相比，本发明的预测因子及其预测模型具有芯片筛选的基础并且在两个独立的慢乙肝病人样本群中得到了验证，有助于慢性乙肝患者个体化治疗的开展，提高干扰素治疗慢性乙型肝炎完全应答的比例、并最终降低治疗费用。

本发明基于现有技术的基础，micrornas（mirnas）是一类非编码小分子rna（19-23个核苷酸），又称小rna（mirna）。小rna存在于各类组织中，可以调节体内约30%的基因表达。它们可以靶向目标mrna通过与特异性靶mrna的3’翻译末端进行核苷酸配对来促进其降解或抑制翻译，从而参与到很多细胞活动中包括细胞分化、增殖、凋亡等。mirna是由长前体rna进行转录产生，并被drosha（一种核酸酶）预处理后通过exportin-5介导的出核过程转运到细胞浆。mirna进一步被dicer酶剪切，最后形成17-24个核苷酸的成熟mirna，并与risc复合体结合，执行基因沉默功能。有研究公开了在人类血浆和血清中存在mirnas并且具有高度稳定性和rna酶抵抗性，这为mirnas作为分子标记物提供了可能性。

具体的，本发明提供了一种预测干扰素治疗慢性乙型肝炎早期病毒学反应的预测模型，该预测模型包括三种预测因子：两种血浆mirnas以及alt。

并且，基于该预测模型本发明提供了一种预测干扰素治疗慢性乙型肝炎疗效的试剂盒，该试剂盒中含有针对两种血浆mirna的特异性探针核苷酸。

同时，本发明提供了一种预测干扰素治疗慢性乙型肝炎早期病毒学反应的预测公式，即检测两种血浆mirna以及alt在干扰素使用前的血浆、血清样品中的表达水平，将样品中预测因子的表达水平利用统计学方法分析并对干扰素疗效进行预测。

本发明中，所述mirnas中至少一种的表达水平高于或者低于已知的标准水平。

进一步，本发明提供了一种预测干扰素治疗慢性乙型肝炎早期病毒学应答的方法，该方法包括：（1）血浆、血清样本总rna的抽提，（2）总rna样本采用特异性mirnas逆转录引物进行逆转录以获得cdna，（3）采用特异性mirnas前向pcr引物以及通用反向引物进行qrt-pcr反应以获得两种血浆mirnas的表达水平，（4）慢乙肝病人接受干扰素治疗前，两种血浆mirnas的表达水平联合alt水平，利用统计学方法进行分析，用于预测干扰素治疗慢乙肝病人的早期病毒学反应。

本发明中，所述的统计方法分析样品中预测因子的表达水平与标准水平差异的显著性，包括下列各项中的一个或者几个：（1）采用mannwhitneytest比较并筛选出有统计学差异的血浆mirnas；（2）将有统计学差异的并进过筛选的mirnas以及重要的临床指标放入二元logistic回归中建立预测模型并获得相应的预测公式，同时得到相应的roc曲线和预测准确度；（3）在另一个独立的样本群中，将预测因子的表达水平代入已建立好的预测公式中计算出相应概率值（p值），并进一步得到相应的roc曲线和预测准确度。

本发明中，利用本发明提供的两种血浆mirnas联合alt的表达谱分析了75例接受干扰素治疗的hbv患者样本，其预测准确度为87.4%，敏感度和特异度分别为80.6%、83.3%。本发明进一步在另外37例接受干扰素治疗的hbv患者中验证了此预测模型，并取得了81.6%的预测准确度，相应的敏感度和特异度分别为78.9%和94.4%。

本发明提供了一种预测模型，能够以较高准确度预测干扰素治疗慢性乙型肝炎的早期病毒学反应。与其他已知的与疗效相关因素相比，该预测模型是一个独立的预测因素，最终将有助于降低治疗费用并提高干扰素治疗慢性乙型肝炎完全应答的比例；本发明的相应的检测方法方便、快速、成本较低；本发明得相应检测试剂盒检测效率高效、成本低廉。

附图说明

图1.mir-22、mir-210以及alt在trainingphase中预测干扰素疗效的roc曲线。

图2.mir-22、mir-210以及alt在validationphase中预测干扰素疗效的roc曲线。

具体实施方式

实施例1：mirna表达谱的检测

实验材料：

本发明从112例接受聚乙二醇干扰素或普通干扰素治疗的慢性乙肝患者中获得血浆样本，112例入组的慢乙肝病人根据收取样本的时间前后划分为训练集和测试集，入组病人的基本临床数据如表1所示，其中平均病毒载量为7.15log10拷贝/毫升，入组排除标准：入组的hbv患者在开始治疗前6个月未接受核苷类似物或干扰素治疗，病毒载量在1×10⁴拷贝/毫升以上，表面抗原（hbsag）阳性持续大于6个月，肝脏谷丙转氨酶不正常(>1.0uln).进一步排除标准包括hiv、hcv或hev共感染，所有病人检测hbv表面抗原，e抗原（e601,rochemodularsystems），病毒载量通过定量pcr检测（匹基生物），早期应答定义为在治疗开始后12周hbvdna下降大于2log值，下降小于2log值定义为无应答；

实验方法：

1）血浆总rna抽提和特异性mirnas的逆转录

使用100µl血浆样本抽提总rna：将病人的血浆样本进行2000×g，4℃，20分钟离心，再进行10,000×g，4℃，30分钟离心，最后进行14,000×g，4℃，10分钟离心，以保证去除所有细胞碎片。取100μl经梯度离心后的血浆进行总rna抽提，然后加入500μltrizol-ls(invitrogen)，根据说明书进行rna抽提步骤。将抽提出来的rna用11μldepc水溶解，再加入5μldepc水溶解的特异性mirnas逆转录引物（锐博），轻轻混匀，70℃孵育10分钟，反应结束后加入4μl的逆转录体系（appliedbiosystems），包括2.5μl10*rtbuffer,1μlmutiscribe,0.25μldntp,0.25μlrnasin，进行逆转录反应（16℃，30分钟；42℃，1小时；85℃，5分钟）；

2）特异性mirnas的定量检测

本发明使用实时荧光定量pcr方法比较了112份血浆标本，通过该方法检测了15种血浆mirnas的表达水平，血浆样本总rna经过特异性逆转录引物逆转录成相应的cdna，再利用特异性的pcr前向引物以及通过反向引物进行定量pcr检测相应血浆mirnas的表达水平，根据治疗开始后hbvdna下降水平是否达到2log，所有入组病人划分为治疗有效组（earlyvirologicalresponsegroup）和治疗无效组（noresponsegroup），整理并比较15种血浆mirnas在两组中表达水平的差异性；

实验结果显示了对112例接受干扰素治疗的慢乙肝病人进行的mirna表达谱检测，其中

75例信息充分的病人入组为训练集（trainingphase），首先检测训练集中所有病人15种血浆mirnas的表达水平，采用一定的统计分析方法建立最优的预测模型并得到相应的预测公式，然后将训练集中生成的预测模型在37例慢乙肝病人组成的测试集（validationphase）中进行验证，解惑显示，两组病人的基本临床病毒学指标水平相似（如表1所示）：

其中：^amannwhitneytest^b.括号中为百分数.^cfisher’sexacttest.^d只统计了基因型b与c。

实施例2：统计分析及确立预测mirnas谱

试验方法：

trainingphase中mirnas表达谱检测：本研究在前期实验室工作的基础上进一步收集75例接受干扰素治疗的慢乙肝病人血浆样本，并采用定量pcr的方法检测mirnas芯片筛选出的11个mirnas中的10个以及文献报道对hbv复制有重要影响的5个，共15个血浆mirnas的表达水平，根据治疗开始后hbvdna下降水平是否达到2log，将trainingphase中所有病人划分为治疗有效组（earlyvirologicalresponsegroup，evr）和治疗无效组（noresponsegroup,nr），在evr和nr之间比较上述15个mirnas的表达水平以获得在两组中具有显著统计学差异的mirnas；

validationphase中mirnas表达谱检测：采用同样的方法在由37例慢乙肝病人血浆样本组成的另一个独立的cohort中继续检测上述15个血浆mirnas的表达水平，validationphase同样根据治疗开始后hbvdna下降水平是否达到2log划分为evr和nr两个组，将检测到的15个血浆mirnas的表达水平在两组中比较统计学差异，观察是否有与trainingphase中重合的在两组中有显著统计学差异的mirnas；

结果显示，

寻找干扰素治疗效果相关mirna谱

本发明首先在75例慢乙肝病人中对治疗前15种血浆mirna表达谱采用定量pcr的方法进行检测以及mannwhitneytest的方法在evr和nr组之间进行统计学差异比较（如表2所示），实验结果表明8个血浆mirnas在evr和nr组之间存在显著的统计学差异，包括mir-22、mir-106b、mir-210、mir-638、mir-1224、mir-1260a、mir-1281、mir-4284。

继而，本发明使用同样的定量pcr方法在37例慢乙肝病人的血浆样本中检测上述15种mirnas的表达趋势并比较它们在evr和nr组之间的统计学差异（如表3所示），结果所示，mir-22、mir-210、mir-1224在evr和nr组中存在显著的统计学差异，所述3个mirnas在trainingphase中的evr和nr之间具有显著的统计学差异；

本发明实验结果表明：mir-22、mir-210以及mir-1224在trainingphase和validationphase中均在evr和nr之间具有显著的统计学，说明所述的3个血浆mirnas具有较好的区分干扰素治疗慢乙肝病人疗效的作用。

表2.trainingphase中15种血浆mirnas的基线表达水平

表3.validationphase中15种血浆mirnas的基线表达水平

实施例3建立干扰素治疗慢乙肝病人疗效预测模型

重要预测因子的筛选：在trainingphase和validationphase两个独立的cohorts中，mir-22、mir-210以及mir-1224在evr组的表达水平都高于nr组，此外，在两个phases的所有相关临床病毒学指标中，alt的表达水平在evr组也都显著高于nr组，因此3种血浆mirnas以及alt均有可能可以用于区分干扰素治疗慢乙肝病人的疗效；基于目前的研究表明mir-22和mir-210在hbv的复制以及hcc的进展中扮演了一定的作用，也有研究表明这两种mirnas在癌症以及免疫调节方面同样扮演了重要的角色，有关mir-1224功能的研究报道尚少见，而且此项mirnas的检测ct值在33左右，所以本实验中将mir-1224排除，在后续的预测模型建立中不予考虑；最终，本实验筛选出mir-22、mir-210以及alt作为重要预测因子，进一步用于建立干扰素治疗慢乙肝病人疗效预测模型；

建立trainingphase中预测模型：本发明进一步运用二元logistic回归分析评价mir-22、mir-210与alt联合是否可以作为预测模型，从而为干扰素治疗慢乙肝病人疗效提供较好的预测准确度；将75例慢乙肝病人相应的mir-22、mir-210与alt的表达水平输入spss软件，获得预测公式：logit(p)=-14.856+0.012*alt-0.519*mir-22+3.831*mir-210，以及相关的概率值（p值），然后采用受试者工作特征曲线（receiveroperatingcharacteristiccurve，roc）分析该预测模型以及相应p值预测干扰素治疗慢乙肝病人疗效的准确度，如图1所示：mir-22、mir-210联合alt在trainingphase中的曲线下面积（theareaunderthecurve，auc）为0.874，表明该预测模型的预测准确度为0.874，95%可信区间为0.795-0.953，敏感度为80.6%，特异度为83.3%，结果表明该预测模型在trainingphase中具有较好的预测准确度；

validationphase中预测模型的验证：本发明在另外一个独立的cohort中进一步验证在trainingphase中建立的预测模型以及得到的预测公式，将37例接受干扰素治疗的慢乙肝病人相应的mir-22、mir-210以及alt的水平代入上述预测公式，并且进一步计算出相对应的p值，再利用p值构建roc曲线图，如图2所示：mir-22、mir-210联合alt在validationphase中的预测准确度为0.816,95%可信区间为0.662-0.970，敏感度为78.9%，特异度为94.4%，结果表明，由mir-22、mir-210联合alt组成的预测模型在validationphase中同样具有较好的预测准确度。

本发明的实验结果表明，血浆来源mir-22、mir-210联合alt组成的预测模型在预测干扰素治疗慢乙肝病人早期病毒学应答中具有良好的预测准确度，该预测模型较简易、检测手段方便快速、预测准确度较高，有助于为临床慢乙肝病人的指导用药提供一定的方向性，从而降低治疗费用并提高干扰素治疗慢性乙型肝炎完全应答的比例。