诱导干细胞体外定向分化的方法与流程

本发明涉及干细胞技术领域，尤其涉及一种诱导干细胞体外定向分化的方法。

背景技术：

现有的诱导干细胞体外定向分化的技术主要有3种：条件诱导法、直接接触共培养法和Transwell膜非接触共培养法。其中，条件诱导法通过添加化学试剂对干细胞进行诱导，添加的化学试剂有一定的毒性，可使干细胞发生变异，增加临床应用的风险；直接接触共培养法直接将目的细胞和干细胞置于同一培养体系中而混合在一起，干细胞不能彻底和目的细胞分开，因此存在着干细胞分离纯化困难、干细胞纯度低、免疫安全性差、容易引起病毒传播等问题，不适合临床应用；Transwell膜非接触共培养法通过半透膜(具有通透性的膜)将目的细胞和干细胞隔开，两种细胞不直接接触，但是存在诱导效率低的问题。

技术实现要素：

本发明的主要目的在于提供一种诱导干细胞体外定向分化的方法，旨在克服现有的诱导干细胞体外定向分化的技术中存在的缺陷。

为实现上述目的，本发明提供一种诱导干细胞体外定向分化的方法，包括步骤如下：

获取干细胞；

获取目的细胞；

微囊化处理所述目的细胞，而获得微囊化目的细胞；

采用半透膜将所述干细胞和所述微囊化目的细胞间隔分离，而共培养所述干细胞和所述微囊化目的细胞，其中，所述半透膜具有直径为0.2～2.8μm的微孔。

优选地，所述目的细胞的数量与所述干细胞的数量比值为(2～5):1。

优选地，所述目的细胞的数量与所述干细胞的数量比值为3:1。

优选地，所述半透膜为聚酯膜，其中，所述微孔的直径为2μm。

优选地，所述采用半透膜将所述干细胞和所述微囊化目的细胞间隔分离的过程中，所述半透膜将所述微囊化目的细胞和所述干细胞上下层间隔分离，其中，所述微囊化目的细胞位于所述半透膜的上方，所述干细胞位于所述半透膜的下方。

优选地，所述干细胞为脂肪干细胞。

优选地，所述目的细胞为软骨细胞。

优选地，所述微囊化目的细胞的微囊为海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊。

优选地，所述微囊化目的细胞的直径为450～650μm。

优选地，所述微囊化目的细胞的直径为500μm。

本发明技术方案，通过将目的细胞微囊化而获得微囊化目的细胞，并采用半透膜将微囊化目的细胞和干细胞间隔分离，而实现微囊化目的细胞和干细胞的共培养，显著提高了干细胞的增殖率，成功地诱导了干细胞向目的细胞分化，且诱导效果优于现有的Transwell膜分离共培养法。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的内容获得其他的附图。

图1为本发明实施例1、对比例1和对比例2中脂肪干细胞的细胞增殖率的MTT法检测结果统计图；

图2为本发明实施例1、对比例1和对比例2中脂肪干细胞的甲苯胺蓝染色结果示意图；

图3为本发明实施例1、对比例1和对比例2中脂肪干细胞的番红花O染色结果示意图；

图4为本发明实施例1、对比例1和对比例2中脂肪干细胞的糖胺聚糖检测结果统计图；

图5为本发明实施例1、对比例1和对比例2中脂肪干细胞的II型胶原蛋白质量浓度的Elisa定量检测结果统计图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供一种诱导干细胞体外定向分化的方法，该诱导干细胞体外定向分化的方法包括步骤如下：

S1、获取干细胞；

S2、获取目的细胞；

S3、微囊化处理该目的细胞，而获得微囊化目的细胞；

S4、采用半透膜将该干细胞和该微囊化目的细胞间隔分离，而共培养该干细胞和该微囊化目的细胞，其中，该半透膜具有直径为0.2～2.8μm的微孔。

本发明诱导干细胞体外定向分化的方法，通过将目的细胞微囊化而获得微囊化目的细胞，并采用半透膜将微囊化目的细胞和干细胞间隔分离，而实现微囊化目的细胞和干细胞的共培养，由于微囊的半透性可使目的细胞分泌的多种诱导因子通过囊壁，并通过半透膜而作用于干细胞，同时囊壁和半透膜又阻止了大分子免疫球蛋白的通过，实现了目的细胞和干细胞的免疫隔离，降低了干细胞增殖过程中所受的毒性，提高了安全性。因此，该方法显著提高了干细胞的增殖率，成功地诱导了干细胞向目的细胞分化，且诱导效果优于现有的Transwell膜分离共培养法。

需要说明的是，该干细胞/目的细胞的获取可以采用离体组织分离培养获得，也可以通过商品化的产品获得。其中，干细胞必须具备分化为目的细胞的潜能，进而干细胞在目的细胞的诱导作用下定向向目标细胞分化；具体地，该干细胞可以是脂肪干细胞或者间充质干细胞，该目的细胞可以是成骨细胞，进而在成骨细胞的诱导作用下，该干细胞可以定向分化为成骨细胞，然而，干细胞和目的细胞不限于上述列举的具体情况。该半透膜具有通透性，其孔径在0.2～2.8μm时，可以保证小分子物质通过，且阻止大分子物质通过；该半透膜通常采用Transwell膜(Cornning公司生产)，其材质可以是聚碳酸酯或聚酯等等。目的细胞的微囊化由微囊发生器实现，形成的微囊可以是海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠(alginate-chitosan-alginate，ACA)微囊或者海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠(alginate-polylysine-alginate，APA)微囊；以海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊为例，微囊发生器制备微囊化目的细胞的过程如下：

将目的细胞与海藻酸钠溶液混合，并调整细胞浓度而获得细胞悬液；将该细胞悬液经微囊发生器的无菌注射泵滴入氯化钙溶液中钙化，得到海藻酸钙凝胶珠；将海藻酸钙凝胶珠与多聚赖氨酸反应成膜，轻微震荡形成非液化的海藻酸钠/多聚赖氨酸微囊膜；然后，用PBS缓冲液洗涤，以柠檬酸钠液化，再用PBS缓冲液洗涤，接着与海藻酸钠溶液反应，最后用PBS缓冲液洗涤，得到APA微囊化目的细胞。

进一步地，目的细胞的数量与干细胞的数量比值为(2～5)：1。

在该比值范围内，目的细胞可以分泌更多作用于干细胞的诱导因子，从而使干细胞向目的细胞分化的效果更好，获得更多的目的细胞。

进一步地，半透膜可以将干细胞和微囊化目的细胞左右间隔分离，也可以将干细胞和微囊化目的细胞上下间隔分离，优选地，半透膜将微囊化目的细胞和干细胞上下层间隔分离，其中，微囊化目的细胞位于半透膜的上方，干细胞位于半透膜的下方。

由于微囊化目的细胞位于干细胞的上层，因此，目的细胞分泌的诱导因子容易通过囊壁和半透膜，在半透膜的下侧集聚而作用于干细胞，有利于提高诱导效率。

进一步地，该微囊化目的细胞的直径为450～650μm。

在该直径范围内，微囊化目的细胞既可以包埋合适数量的细胞、为细胞提供足够的生存空间，有利于内部细胞的生长；又保证了微胶囊的比表面积，有利于目的细胞分泌的相关诱导因子的物质传递，且避免了微胶囊的机械强度的下降。

现通过实施例对本发明诱导干细胞体外定向分化的方法做进一步解释，以详细说明其技术方案及带来的技术效果。

实施例1

一、获取脂肪干细胞

(1)、原代细胞的获取及培养

a、准备：培养用品消毒后，安放在超净工作台内，进行紫外线消毒，同时进行洗手消毒等准备工作。

b、取材：取C57BL/6WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，然后，用PBS缓冲液洗去麻醉药及血液。

c、消化：将步骤b冲洗后的组织置于平皿中，并向平皿中加入20ml胶原酶(0.075％II型胶原酶)，再用移液管将平皿中的物质移至烧瓶中；然后，将烧瓶置于37℃水浴或恒温箱中30min，每隔5～10min振荡一次；30min后，向烧瓶中加入生理盐水终止胶原酶的消化。

d、离心和计数：将步骤c得到的消化产物加入离心管中，并标记离心管，平衡后，以1200g，1200r/min离心10min，去除离心管中的上清液及未消化的组织，用含体积分数为10％的FBS的DMEM培养液重悬细胞沉淀，并用0.16mol/l氯化氨溶液溶解剩余的红细胞，将收集的细胞悬液经200目铜网过滤，然后将过滤得到的细胞经1200r/min离心10min，得到单个核细胞。向单个核细胞中加入培养液而得到细胞悬液，吹打混匀后取样计数，根据计数结果调整细胞浓度为10⁴个/ml。

e、接种培养：每10cm²的培养瓶接种1ml步骤d制得的细胞悬液，再添加4ml的培养液，盖紧瓶塞。标上名称、组号和日期，在倒置相差显微镜下观察细胞分散情况后，置于37℃、5％CO₂孵箱中培养。

(2)、原代细胞的传代培养

a、取一瓶步骤(1)制得的培养瓶在倒置相差显微镜下观察，当培养瓶中的细胞长成致密的单层时，即可进行传代。

b、将培养瓶带入超净工作台，倒去细胞培养液，吸取2ml～3ml PBS缓冲液加入培养瓶中，轻轻振荡后倾去，可重复进行一次。

c、向培养瓶中加入5～8滴0.25％的胰蛋白酶(Trypsin)和适量0.02％的EDTA，转动培养瓶，使其湿润整个细胞层后，置于室温下消化2～3min。翻转培养瓶，肉眼观察细胞单层，见细胞单层的薄膜上出现针孔大小空隙时即可倒去消化液。如见消化程度不够时可再延长消化1～2min。如见细胞大片脱落，表明已消化过头，则不能倒去消化液而直接进行下一步操作。

d、加入3ml培养液于培养瓶中终止消化。吸取培养瓶中的培养液反复冲洗瓶壁上的细胞层，直至瓶壁上的细胞全被冲下，再轻轻吹打混匀，制成单细胞悬液。取样计数，调整细胞浓度为10⁴个/ml。吸取1ml细胞悬液加到另一培养瓶中，原培养瓶中留下1ml的细胞悬液，弃去多余细胞悬液(可分别提取1ml接种分配到多个培养瓶中)，并向每瓶中加4ml培养液，进行传代培养。盖好瓶盖，标上名称、组号和日期，在倒置相差显微镜下观察细胞分散情况后，置于37℃、5％CO₂孵箱中培养。

二、获取软骨细胞

空气栓塞法处死大鼠，无菌环境中取出其双膝盖关节软骨，剪碎成1～2mm²大小，置于无菌离心管中，以PBS缓冲液冲洗三次，2000r/min离心3min，离心半径9cm。吸去PBS缓冲液，加入浓度为0.25％的胰酶5ml，并置于37℃、5％CO₂、饱和湿度的孵化箱中30min，小心吸出胰酶，再加入0.2％的II型胶原蛋白酶5ml，置于孵化器中消化6h。收集消化液，800r/min离心3min，离心半径9cm，弃上清。加入DMEM/F12培养基重悬，800r/min离心3min，重复两次。加入5ml含体积分数为10％的胎牛血清的DMEM/F12培养液，并置于37℃、5％CO₂、饱和湿度的孵化箱中，进行原代培养，每隔48h换液，待原代细胞长至80％融合后，按1:3比例传代培养。取第二代软骨细胞进行微囊化处理。

三、微囊化处理软骨细胞

取第二代软骨细胞，用0.25％的胰酶消化并收集后，使用APA微囊发生器依如下步骤制备微囊化软骨细胞：

将软骨细胞与1.5％的海藻酸钠溶液混合，调整细胞浓度为5×10¹⁰个/L，将该细胞悬液经无菌注射泵滴入100mmol/L氯化钙溶液中钙化20min，得到海藻酸钙凝胶珠。将海藻酸钙凝胶珠与0.05％的多聚赖氨酸反应成膜，轻微震荡15min形成非液化的海藻酸钠/聚赖氨酸微囊膜。然后，用PBS缓冲液洗涤，以55mmol/L的柠檬酸钠液化5min，PBS缓冲液洗涤，0.15％的海藻酸钠溶液反应5min，PBS缓冲液洗涤，得到APA微囊化软骨细胞(制得的微囊直径为500μm；制备微囊所需液体均经过滤菌)。按体积比(含有软骨细胞的微囊：培养液)1:10加入含有体积分数为10％的胎牛血清的DMEM/F12培养液，而获得微囊化软骨细胞悬液，并置于37℃、5％CO₂、饱和湿度的孵化箱中孵育24h，进行下述步骤。

四、诱导干细胞定向分化

提供Transwell小室(Corning公司生产)和培养板，其中，Transwell小室呈杯状，Transwell膜设于Transwell小室的底部，将Transwell小室放入培养板中，Transwell小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以Transwell膜相隔。其中，该Transwell膜为半透膜，该半透膜采用聚酯膜材质，其孔径为2μm。

将脂肪干细胞按5×10⁴个/孔种于下室内，12h后将微囊化软骨细胞悬液种于上室内，且按微囊内的软骨细胞1.5×10⁵个/孔进行接种，上下室通过Transwell膜共通而实现共培养。其中，软骨细胞的数量与脂肪干细胞的数量比值为3:1。

对比例1

一、获取脂肪干细胞

请参见实施例1，与实施例1相同。

二、获取软骨细胞

请参见实施例1，与实施例1相同。

三、诱导干细胞定向分化

将脂肪干细胞按5×10⁴个/孔种于下室内，12h后将软骨细胞悬液按1.5×10⁵个/孔加入上室内，上下室通过Transwell膜共通而实现共培养。其中，软骨细胞的数量与脂肪干细胞的数量比值为3:1。

对比例2

一、获取脂肪干细胞

请参见实施例1，与实施例1相同。

二、培养脂肪干细胞

将脂肪干细胞按5×10⁴个/孔种于Transwell小室中培养。

验证方法及验证结果(验证结果的数据采用的形式表示。应用SPSS16.0软件对所有数据进行统计学处理。多组间差异采用单因素方差分析，P<0.05为差异有显著性意义)

1、MTT法检测干细胞增殖率

于培养1d，4d，7d后，分别取实施例1、对比例1和对比例2的10孔细胞，弃去微囊或软骨细胞，加入MTT 20μl/孔，培养6h，然后加入DMSO 150μl/孔，振荡10min，酶联检测仪上以波长492nm测量吸光度值，每组以10孔的平均值为最终结果，且最终结果统计如图1所示。由图1可知，在培养的1d，4d，7d天后，对比例1中脂肪干细胞增殖率低于实施例1和对比例2(P<0.05)，而实施例1和对比例2中脂肪干细胞增殖率比较差异无显著性意义(P>0.05)。因此，本发明实施例1的诱导干细胞定向分化方法提高了脂肪干细胞的增殖率，同时提高了诱导脂肪干细胞定向分化的诱导效率。

2、甲苯胺蓝染色

将实施例1、对比例1和对比例2中的细胞培养7d后，弃去软骨细胞或微囊，PBS小心冲洗下板2次，加培养液继续培养干细胞5d；然后吸去培养液，以PBS冲洗2次，加入甲苯胺蓝染液染色10min，吸去染液，PBS冲洗2次，常规脱水干燥，透明封固封后显微镜下观察，如图2所示。由图2可知，实施例1中甲苯胺蓝染色致密、均匀充满整个视野，说明脂肪干细胞数量多、分布均匀；而对比例1中染色较为稀疏，且分布不均匀；对比例2染色呈阴性或者弱阳性。因此，本发明实施例1与对比例相比，脂肪干细胞数量多，增殖率高。

3、番红花O染色

将实施例1、对比例1和对比例2中的细胞培养7d后，弃去软骨细胞或微囊，PBS小心冲洗下板2次，加培养液继续培养干细胞5d；然后吸去培养液，PBS冲洗2次，酸性乙醇分化15s，PBS冲洗，苏木精染色3min，PBS冲洗，孔雀绿溶液染色3min，1％醋酸快速漂洗，0.1％的番红花O水溶液染色3min。常规脱水干燥，透明固封后显微镜下观察，如图3所示。由图3可知，实施例1中脂肪干细胞的番红花O染色强度远远强于对比例1，且分布均匀、染色致密、充满整个视野；对比例2中软骨细胞染色呈阴性或者弱阳性。因此，本发明实施例1与对比例相比，脂肪干细胞细胞数量多，且增殖率高。

4、糖胺聚糖检测

将实施例1、对比例1和对比例2中的细胞培养7d后，弃去软骨细胞或微囊，PBS小心冲洗下板2次，加培养液继续培养干细胞5d；吸去培养液，胰酶消化3min，调整每孔细胞浓度至1×109L-1，加入裂解液，4℃下裂解30min，以硫酸骨素为标准品，紫外分光光度计制作标准曲线，阿利新蓝法检测上清液中糖胺聚糖水平。每组取10孔细胞，以10孔平均值作为最终结果，如图4所示。由图4可知，实施例1中脂肪干细胞的糖胺聚糖含量为0.197±0.015mg，对比例1中脂肪干细胞的糖胺聚糖含量为0.120±0.005mg，对比例2中脂肪干细胞的糖胺聚糖含量为0.02±0.010mg。单因素方差分析结果显示，实施例1中脂肪干细胞的糖胺聚糖合成量显著高于对比例1和对比例2(P<0.05)，因此，实施例1中脂肪干细胞具有较高的纯度和增殖率。

5、Elisa(酶联免疫吸附测定)定量测量干细胞合成II型胶原蛋白的能力

分别收集实施例1、对比例1和对比例2细胞培养液，-70℃下保存备用。检测时置于4℃过夜解冻，在Elisa试剂盒中每孔各加入标准品或待测品100μL，充分混匀后置37℃中120min，洗板，加一抗工作液100μL，混匀后置37℃中60min，洗板，加酶标抗体工作液100μL，混匀后置37℃中30min，洗板，加底物工作液100μL，置37℃暗处反应15min，加终止液混匀，30min内用酶标仪于450nm处测吸光度值，并按以下公式计算Ⅱ型胶原蛋白含量：

(待测品吸光度值/标准品吸光度值)×标准品蛋白含量(10mg/l)。

统计结果如图5所示。根据图5可知，实施例1、对比例1以及对比例2中脂肪干细胞的II型胶原蛋白质量浓度分别是24.45±0.10mg/l、12.14±0.23mg/l和7.11±0.12mg/l。单因素方差分析结果显示实施例1中脂肪干细胞的II型胶原蛋白含量显著高于传统对比例1和对比例2(P<0.05)，因此，实施例1中脂肪干细胞具有较高的纯度和增殖率。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。