本发明涉及一株ε-聚赖氨酸高产菌株及生产ε-聚赖氨酸方法，属于生物技术领域。
背景技术：
ε-聚赖氨酸（ε-polylysine）属于微生物食品防腐剂，是一种高效广谱的新型生物防腐剂。ε-聚赖氨酸是L-赖氨酸由α-羧基和ε-氨基连接形成的聚合物，含有25~35个赖氨酸残基，成品为淡黄色粉末，易溶于水，吸湿性强，略有苦味。与其它防腐剂相比，ε-聚赖氨酸具有抑菌谱广、抑菌效率高、稳定性好、安全性高的特点。ε-聚赖氨酸对革兰阳性菌、革兰阴性菌、酵母菌、霉菌均有抑菌效果，对耐热性芽孢杆菌和一些病毒也有抑制作用；在食品中的添加量非常少；能适应较宽的pH范围，还具有很高的热稳定性，可以随食品一起灭菌；在肠胃中几乎不被吸收，对人体的生长发育等没有影响，在人体内可分解为L-赖氨酸而成为人体营养强化剂。除了作为防腐剂，在食品工业中，ε-聚赖氨酸还可用作乳化剂、食疗剂；在医药行业中，还可以作为药物载体以及高吸水性的生物材料。
目前，困扰ε-聚赖氨酸大规模产业化的难题主要有两个：一是现有菌株的产酸能力有限；二是分离工艺复杂，一般需要经过除菌、离子交换、脱色、浓缩、干燥等步骤；如中国专利200910152931.2提供的一种从发酵液中提取ε-聚赖氨酸及其盐的方法，其工艺步骤复杂、设备投资大、成本高、分离过程中还会产生大量污水。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种具有高产ε-聚赖氨酸能力的菌株；及根据ε-聚赖氨酸及其发酵特性，提供一种工艺简单、成本低的采用该菌株生产ε-聚赖氨酸的方法。
技术方案：
通过紫外-亚硝基胍复合诱变方法，对白色链霉菌（Streptomyces albulus）NBRC14147进行诱变，将诱变株涂布到含有10~40 g/L ε-聚赖氨酸的YMG或LB固体培养基上，28~30 ℃培养2~5天后，挑选出单菌落，经过摇瓶复筛及发酵罐验证后，获得一株具有高产ε-聚赖氨酸能力的菌株EA-19；菌株EA-19补料分批发酵培养，发酵液中ε-聚赖氨酸的浓度达38.5~39 g/L。该菌株EA-19，其形态特征为：孢子丝紧密或松敞螺旋形，含10-50个孢子；孢子球形至卵圆形，表面光滑。经鉴定，该菌株EA-19是一种白色链霉菌（Streptomyces albulus）。
该菌株EA-19已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101），分类命名为白色链霉菌（Streptomyces albulus），保藏号为CGMCC No.10156，保藏时间为2014年12月11日。
一种采用本发明的菌株EA-19生产ε-聚赖氨酸的方法：菌株EA-19进行发酵培养。当发酵液中ε-聚赖氨酸的浓度稳定后，停止发酵培养；发酵周期为42h。测得发酵液中ε-聚赖氨酸的浓度为7.5 g/L。而采用白色链霉菌NBRC14147发酵培养；当发酵液中ε-聚赖氨酸的浓度稳定后，停止发酵培养；发酵周期为42h。测得发酵液中ε-聚赖氨酸的浓度为2.5 g/L。由此可见，本发明的方法能缩短发酵周期，产ε-聚赖氨酸的能力明显提高（是白色链霉菌NBRC14147产ε-聚赖氨酸能力的三倍）。
上述方法，发酵培养过程中搅拌、通风；发酵培养结束后，将发酵液加热到80-90 ℃维持25-35分钟，然后继续向发酵液通风至发酵液不再产生泡沫；收集发酵培养过程中及发酵培养结束后产生的泡沫，进行消泡、过滤，滤液加有机溶剂进行沉淀，沉淀真空干燥，得到ε-聚赖氨酸成品。该方法采用鼓泡法，在发酵培养过程中、发酵培养结束后通风，使得发酵产生的ε-聚赖氨酸存在于泡沫中、从发酵液中分离出来；从而克服了现有制备方法中ε-聚赖氨酸难以分离的技术难题。“将发酵液加热到80-90 ℃维持25-35分钟”的作用是提高ε-聚赖氨酸的分离效果。
上述方法，维持发酵液的糖浓度为5-30g/L、维持发酵液的pH为3.5-4.5。随着发酵培养的进行，发酵液的糖浓度和pH逐渐降低。当糖浓度过低，菌体会死亡，产酸缓慢，影响最终产量；pH过低也不利于产酸。所以，向发酵液充补料液以维持糖浓度，向发酵液中加氨水以维持pH；所述补料液含葡萄糖。在此条件下，发酵培养168~192 h后，发酵液中ε-聚赖氨酸的浓度即可达到38.5-39g/L的稳定状态。
上述方法，优选的，维持发酵液的糖浓度为9-11g/L。在此糖浓度条件下，菌体生长状态和产酸能力更好。
上述方法，发酵培养用发酵培养基含有葡萄糖 50 g/L、酵母粉5 g/L、硫酸铵10 g/L、硫酸亚铁 0.03 g/L、硫酸锌0.04 g/L、硫酸镁0.5 g/L、磷酸氢二钾 0.8 g/L、磷酸二氢钾1.36 g/L、以及0.5~5 g/L的吐温、蔗糖酯、甘油脂和大豆磷脂中的一种以上，以助于发酵液形成的泡沫不易破裂，便于泡沫引流。
上述方法，消泡是指机械搅拌消泡和加入消泡剂消泡中的一种或两种结合。
上述方法，所述过滤为板框过滤。在本发明中，相对于采用其他过滤方式，板框过滤的优势在于：工艺简单易放大，能耗低、设备投资小。
上述方法，所述有机溶剂为乙醇、乙醚、丙醇、丁醇和丙酮中的一种或两种以上，加入量为滤液体积的1~3倍。
上述方法，菌株EA-19的发酵培养条件可以采用制备的ε-聚赖氨酸的常规发酵培养条件；优选的，发酵培养条件为：温度28~30 ℃、搅拌转速100~400 r/min，通风比0.5~1:1 V/V•m。
本发明人还发现，ε-聚赖氨酸作为赖氨酸聚合物，有较高的表面活性。在ε-聚赖氨酸发酵中后期，由于产物的积累，会产生大量的泡沫，需要不断的加入消泡剂来消泡，过多的消泡剂不仅增加成本，还会降低发酵液的表面张力，降低溶解氧浓度，对发酵存在一定的抑制作用。
有益效果
本发明的菌株EA-19具备高产ε-聚赖氨酸能力；其进行补料分批发酵，所获得的发酵液中ε-聚赖氨酸的浓度高达38.5-39g/L。
本发明的生产方法，有效利用ε-聚赖氨酸及其发酵的特性，采用鼓泡法，使ε-聚赖氨酸以泡沫形式从发酵液中分离出来，然后采用有机溶剂沉淀法浓缩；避免了离子交换等产生大量废水的步骤，产品收率（成品产量/发酵产量的比值）提高50 %以上；工艺简单易放大，能耗低、设备投资小，易于实现规模化生产。
保藏信息
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所
保藏日期：2014年12月11日
保藏编号：CGMCC No.10156
分类命名：白色链霉菌Streptomyces albulus。
具体实施方式
下面结合具体实施例以更好地理解本发明。
实施例1 高产菌株EA-19的筛选
（1）将白色链霉菌NBRC14147的孢子使用tirs-马来酸缓冲液制成孢子悬液，孢子浓度约为107~108个/mL。
（2）取孢子悬液5 mL，加入到Φ9 cm无菌平皿；将无菌平皿置于紫外诱变箱内、距15 W 紫外灯30 cm处，进行紫外光照射诱变30 s。
（3）将无菌平皿从紫外诱变箱中取出，再向无菌平皿中的孢子悬液中加入亚硝基胍，使亚硝基胍终浓度为0.8 mg/mL，避光震荡30 min；终止诱变。
（4）诱变结束后，清洗菌体并加入5 mL避光过夜培养（培养时间为16小时左右）。发酵培养基：葡萄糖 50 g/L，酵母粉5 g/L，硫酸铵10 g/L，硫酸亚铁 0.03 g/L，硫酸锌0.04 g/L，硫酸镁0.5 g/L，磷酸氢二钾 0.8 g/L，磷酸二氢钾1.36 g/L。
（5）将步骤（4）获得的菌液用含有40 g/L ε-聚赖氨酸的YMG固体培养基进行平板培养，避光培养2天，得到单菌落14个。YMG固体培养基：酵母粉4g/L，麦芽浸粉10g/L，葡萄糖4g/L，琼脂15g/L。
（6）得到的14个单菌落经过摇瓶初筛后，获得菌株EA-19。
（7）将获得的菌株EA-19用tirs-马来酸缓冲液制成EA-19的孢子悬液，孢子浓度约为107~108个/mL；备用。
以下实验为高产菌株EA-19与原始菌株NBRC14147的对比。
1.对ε-聚赖氨酸的耐受性
将原始菌株NBRC14147和高产菌株EA-19分别接种到含有不同浓度ε-聚赖氨酸的YMG固体培养基中，30 ℃培养2~5天，观察菌体生长情况，具体结果见表1。YMG固体培养基：酵母粉4g/L，麦芽浸粉10g/L，葡萄糖4g/L，琼脂15g/L。
表1 NBRC1147和EA-19对ε-聚赖氨酸（ε-PL）的耐受性
注：－ 无生长，+ 少量生长，++ 生长较多，+++生长旺盛
2.分批发酵实验
（1）分别将菌株NBRC14147和EA-19的孢子悬液按2 %接种量接种到液体种子培养基中，30 ℃、250 r/min培养24 h；分别得到NBRC14147和EA-19的种子液。种子培养基成分为甘油 20 g/L，酵母粉 5 g/L，硫酸亚铁 0.03 g/L，硫酸锌0.04 g/L，硫酸镁0.5 g/L，磷酸氢二钾 0.8 g/L，磷酸二氢钾1.36 g/L。
（2）按5 %接种量将培养好的NBRC14147和EA-19的种子液分别接种到8 L发酵培养基中，培养温度30 ℃、搅拌转速200~400 r/min，通风比0.5~1:1 (V/V•m)（一分钟内通过单位体积培养液的空气体积比），开始发酵培养。发酵培养基为葡萄糖 50 g/L，酵母粉5 g/L，硫酸铵10 g/L，硫酸亚铁 0.03 g/L，硫酸锌0.04 g/L，硫酸镁0.5 g/L，磷酸氢二钾 0.8 g/L，磷酸二氢钾1.36 g/L。
（3）发酵培养至10~16 h，当发酵液pH降至约4.0时，分别开始流加氨水使pH稳定在4.0上下。
（4）发酵培养至40~48 h，测定发酵液中残留葡萄糖浓度低于5 g/L时，结束发酵，测定发酵液中ε-聚赖氨酸的浓度，具体结果见表2。
表2 NBRC1147和EA-19分批发酵结果
。
实施例2 高产菌株EA-19发酵分离耦合生产ε-聚赖氨酸
（1） 取实施例1制备的EA-19孢子悬液按2 %接种量接种到液体种子培养基中，30 ℃，250r/min培养24 h；得EA-19种子液。种子培养基成分为甘油 20 g/L，酵母粉 5 g/L，硫酸亚铁 0.03 g/L，硫酸锌0.04 g/L，硫酸镁0.5 g/L，磷酸氢二钾 0.8 g/L，磷酸二氢钾1.36 g/L。
（2）按5 %接种量将EA-19种子液接种到发酵培养基中，培养温度30 ℃、搅拌转速400 200-500r/min，通风比1:1 (V/V•m)，开始发酵培养。发酵培养基为葡萄糖 50 g/L，酵母粉5 g/L，硫酸铵10 g/L，硫酸亚铁 0.03 g/L，硫酸锌0.04 g/L，硫酸镁0.5 g/L，磷酸氢二钾 0.8 g/L，磷酸二氢钾1.36 g/L，吐温80 0.5 g/L。
（3）发酵培养至12 h时，发酵液pH降至约4.0，开始流加氨水使pH稳定至约4.0。
（4）发酵培养至45 h时，发酵液中的葡萄糖浓度将至10 g/L上下，开始流加补料液，使发酵液中的葡萄糖浓度稳定在10 g/L上下。补料液组成为葡萄糖500 g/L。
（5）发酵培养至65 h时，发酵液中产生大量泡沫，通过尾气管道将泡沫引流到消泡罐中；
（6）发酵培养至172 h时，通过液相检测，发酵液中ε-聚赖氨酸产量达到38.5 g/L，结束发酵。
（7）将发酵液升温至85 ℃，按1:1通风比通风鼓泡16 h，鼓泡产生的泡沫引流到消泡罐中；泡沫在消泡罐中经消泡剂消泡后，再经板框过滤，得到澄清滤液；
（8）向滤液中加入其2倍体积的乙醇，得到聚赖氨酸沉淀，沉淀再经减压干燥得到ε-聚赖氨酸成品；产品收率为81%；与实施例4相比，收率提高了50％以上。
实施例3 高产菌株EA-19发酵分离耦合生产ε-聚赖氨酸
（1） 取实施例1制备的EA-19孢子悬液按2 %接种量接种到液体种子培养基中，30 ℃、250 r/min培养24 h；得EA-19种子液。种子培养基成分为甘油 20 g/L，酵母粉 5 g/L，硫酸亚铁 0.03 g/L，硫酸锌0.04 g/L，硫酸镁0.5 g/L，磷酸氢二钾 0.8 g/L，磷酸二氢钾1.36 g/L。
（2）按5 %接种量将；得EA-19种子液接种到发酵培养基中，培养温度30 ℃、搅拌转速400 r/min，通风比1:1 V/V•m，开始发酵培养。发酵培养基为葡萄糖 50 g/L，酵母粉5 g/L，硫酸铵10 g/L，硫酸亚铁 0.03 g/L，硫酸锌0.04 g/L，硫酸镁0.5 g/L，磷酸氢二钾 0.8 g/L，磷酸二氢钾1.36 g/L，单甘脂 1 g/L。
（3）发酵培养至12 h时，发酵液pH降至约4.0，开始流加氨水使pH稳定至约4.0。
（4）发酵培养至46 h时，发酵液中的葡萄糖浓度降至10 g/L上下，开始流加补料液，使发酵液中的葡萄糖浓度稳定在10 g/L上下；补料液组成为葡萄糖500 g/L。
（5）发酵培养至61 h时，发酵液中产生大量泡沫，通过尾气管道将泡沫引流到消泡罐中。
（6）发酵培养至170 h时，通过液相检测，ε-聚赖氨酸产量达到39.0 g/L，结束发酵。
（7）将发酵液升温至85 ℃，按1:1通风比通风鼓泡12 h，鼓泡产生的泡沫引流到消泡罐中。泡沫在消泡罐中经消泡剂和机械搅拌消泡后，再经板框过滤，得到澄清滤液。
（8）向滤液中加入其1.5倍体积的乙醚，得到聚赖氨酸沉淀，沉淀再经减压干燥得到聚赖氨酸成品；产品收率为83%。
实施例4 高产菌株EA-19采用常规方法进行发酵分离生产ε-聚赖氨酸
具体操作如下：
（1） 取实施例1制备的EA-19孢子悬液按2 %接种量接种到液体种子培养基中，30 ℃，250r/min培养24 h；得EA-19种子液。种子培养基成分为甘油 20 g/L，酵母粉 5 g/L，硫酸亚铁 0.03 g/L，硫酸锌0.04 g/L，硫酸镁0.5 g/L，磷酸氢二钾 0.8 g/L，磷酸二氢钾1.36 g/L。
（2）按5 %接种量将EA-19种子液接种到发酵培养基中，培养温度30 ℃、搅拌转速400 200-500r/min，通风比1:1 (V/V•m)，开始发酵培养。发酵培养基为葡萄糖 50 g/L，酵母粉5 g/L，硫酸铵10 g/L，硫酸亚铁 0.03 g/L，硫酸锌0.04 g/L，硫酸镁0.5 g/L，磷酸氢二钾 0.8 g/L，磷酸二氢钾1.36 g/L，吐温80 0.5 g/L。
（3）发酵培养至12 h时，发酵液pH降至约4.0，开始流加氨水使pH稳定至约4.0。
（4）发酵培养至46 h时，发酵液中的葡萄糖浓度降至10 g/L上下，开始流加补料液，使发酵液中的葡萄糖浓度稳定在10 g/L上下；补料液组成为葡萄糖500 g/L。
（5）发酵培养至170 h时，通过液相检测，ε-聚赖氨酸产量达到38.7g/L，结束发酵。
（6）将聚赖氨酸发酵液调pH值为3.0，然后加热至85℃，保温20分钟，再冷却至60℃，经板框过滤、顶洗、复滤后得清滤液；
（7）将清滤液调pH值为8.0，得碱化液；
（8）将碱化液压入树脂吸附柱中进行吸附，并保持吸附过程的pH值保持在8.0范围内，直到树脂吸附达饱和状态；用纯化水洗涤饱和树脂，至洗涤液体澄清为止；
（9）用盐酸进行解析，待pH降至4.0以下，解吸结束，得解析液；
（10）在所述解析液中加入活性炭进行脱色，过滤得脱色液；
（11）将所述脱色液压入滤膜装置进行循环浓缩，将脱色液浓缩至ε-PL含量在30％时，停止浓缩，得浓缩液，浓缩液经干燥而得到ε-聚赖氨酸成品，收率为55%。