从青稞谷粒中提取和纯化β‑葡聚糖的方法与流程

本发明属于食品领域，具体涉及一种从青稞谷粒中提取和纯化β-葡聚糖的方法。

背景技术：

β-葡聚糖(β-glucan)是一种线性无分支粘性多糖，其异碳头糖苷键连接方式为β型，通过β-(1→3)和β-(1→4)糖苷键把β-D-吡喃葡萄糖单位连接而成，广泛分布于动植物及微生物界。谷物中的β-葡聚糖化学结构相似，但分子中β-(1→3)和β-(1→4)糖苷键所占比率存在差异。β-葡聚糖的水溶性与这两种糖苷键的比例有关。一般而言，水溶性β-葡聚糖中β-(1→4)糖苷键与β-(1→3)糖苷键的比例是2.3:1，而非水溶性β-葡聚糖中这一比例较高。根据报道，β-葡聚糖具有：1)降低血清胆固醇，预防心血管疾病；2)调节血糖水平，预防糖尿病；3)促进肠道益生菌增殖，预防肠癌；4)调节机体免疫功能等功效，应用前景广泛。

青稞生长在严寒缺氧的高原地带，是藏族人民每日饮食当中最主要的碳水化合物来源，具有突出的医疗保健功效，被认为是藏族人民长寿的重要因素之一。严寒、缺氧、干燥、强光照射等特殊环境使得青稞获得了极强的抗逆性，产生了十分丰富的次生代谢产物。青稞也因其营养组成全面且独特、食疗价值高而越来越受到民众青睐。

有学者指出，青稞中的β-葡聚糖含量普遍高于世界其它地区种植的大麦品种。因此β-葡聚糖也被认为是青稞中与人体健康和长寿关系最为密切的营养物质。关于β-葡聚糖的提取，报道的提取溶剂有热水、冷水、酸、碱、二甲亚砜等，提取温度从室温到100℃不等，料水比(m/V)在1:10到1:50之间，提取时间30min到22h不等。借鉴专家学者对谷物中β-葡聚糖的研究方法，我们优化提取方法及其工艺，成功从青稞谷粒中分离纯化得到高纯度的β-葡聚糖。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种从青稞谷粒中提取和纯化β-葡聚糖的方法。以青稞谷粒为原料，经过研磨、过筛、酶解、醇沉、真空冷冻干燥、脱 脂得到粗制样品，其溶解后再依次经由填料cellulose DE-32和S-400洗脱得到纯化样品。所述方法能有效从青稞谷粒中分离得到高纯度的β-葡聚糖，可用于其结构解析、理化性质鉴定及生物活性研究等。

为实现上述目的，本发明采用以下方案：

本发明涉及一种从青稞谷粒中提取和纯化β-葡聚糖的方法，包括以下步骤：

A1、原料预处理：将选出的青稞谷粒研磨后过0.4mm筛网，即得粉末样品；

A2、酶解：将粉末样品加蒸馏水溶解，依次加入耐高温α-淀粉酶、木瓜蛋白酶、糖化酶进行酶解，将酶解液离心，得上清液a；

A3、醇沉：在上清液a中滴加无水乙醇，静置过夜后离心，得醇沉沉淀物；

A4、真空冷冻干燥：醇沉沉淀物用蒸馏水复溶，60～90℃水浴蒸发浓缩，所得浓缩液-20℃下冷冻后，真空冷冻干燥24～48h，得固体粉末；

A5、脱脂：将固体粉末在60～90℃水浴条件下反复抽提6～8h；然后30～50℃下烘干即得粗制样品；

A6、洗脱：取粗制样品加蒸馏水溶解后离心，得上清液b，将上清液b先经DE-32洗脱，再经S-400洗脱后即可得到高纯度β-葡聚糖。

优选地，步骤A2中，所述酶解的具体采用以下方法：在溶解后的粉末样品中加入耐高温α-淀粉酶，80～100℃水浴1～2h；水浴温度调至60～80℃，加入木瓜蛋白酶，水浴1～2h；100℃水浴灭酶10～20min，冷却后加入糖化酶，60～80℃水浴1～2h；100℃水浴灭酶10～20min，冷却后60～90℃水浴2～4h，得酶解液。

优选地，所述固体样品以10g计，耐高温α-淀粉酶、木瓜蛋白酶、糖化酶的加入量分别为50～100μL、10～20mg、100～500μL。

优选地，步骤A3中，所述上清液a与无水乙醇的体积比为1：2～3。

优选地，所述离心的条件均为：转速3000rmp、离心15min。

优选地，步骤A5中，所述抽提的溶剂为正己烷。

优选地，所述经DE-32洗脱时，流速为0.1～1.0mL/min，流动相为蒸馏水；层析柱的规格为：2.6cm x 30cm。

优选地，所述经S-400洗脱时，流速为0.1～1.0mL/min，流动相为蒸馏水；层析柱的规格为：1.6cm x 100cm。

优选地，所述上清液b经S-400洗脱后分开收集单一糖分的滤液，将含β-葡聚糖的滤液经60～90℃水浴蒸发浓缩至约5mL；-20℃冷冻后，真空冷冻干燥24～48h即得 纯化的β-葡聚糖。

优选地，所述单一糖分的滤液的糖分纯度采用高效液相色谱仪测定，采用的糖柱型号为SUGAR KS-805检测器温度为30℃，柱温为30～60℃；流动相为蒸馏水，流速为0.5～1.0mL/min。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

1.酶解阶段充分去除淀粉、蛋白质等大分子杂质，分离除去水不溶性非淀粉多糖而保留水溶性非淀粉多糖成分，极大地提高了β-葡聚糖的纯度和提取率；

2.脱脂步骤置于酶解步骤之后，极大地提高脱脂效率并节约时间、减少物力消耗；

3.采用离子交换纤维素DE-32去除色素等小分子物质、葡萄糖树脂S-400分离不同分子量的未知多糖组分，效率高、效果好。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为分离纯化青稞谷粒中β-葡聚糖的流程图；

图2为实施例1测定β-葡聚糖滤液中单糖组成的气相色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1：

本实施例提供了一种从青稞谷粒中提取和纯化β-葡聚糖的方法，流程如图1所示，具体步骤如下：

分选若干无病变等正常青稞谷粒，研磨、过0.4mm筛网；称取10g粉末状样品加90mL蒸馏水溶解，加入50μL耐高温α-淀粉酶，80℃水浴1h；水浴温度调至60℃，加入15mg木瓜蛋白酶，水浴1h；100℃水浴灭酶10min，冷却后加入400μL糖化酶，60℃水浴1h；100℃水浴灭酶10min，冷却后86℃水浴4h；酶解液3000转离心15min， 沉淀物留存，上清液备用。

上清液在磁力搅拌的条件下缓慢滴加3倍体积无水乙醇，静置过夜；3000转离心15min，醇沉液弃去，沉淀物用适量蒸馏水复溶，90℃水浴蒸发浓缩至约10mL；-20℃冷冻，真空冷冻干燥24h,将得到的固体粉末置于索氏提取装置中，用正己烷作溶剂，90℃水浴条件下反复抽提6-8h；40℃低温烘干即得粗制样品，即酶解后处理得到的粗多糖粉末。

取0.5g粗制样品加蒸馏水溶解，3000转离心15min；上清液经由DE-32洗脱，流动相为蒸馏水在流速0.2mL/min条件下按3mL/管收集100管；苯酚—硫酸法遴选有糖试管，合并滤液；90℃水浴蒸发浓缩至约2mL。

浓缩液再由S-400洗脱，流动相为蒸馏水，在流速0.2mL/min条件下按3mL/管收集100管；苯酚—硫酸法遴选有糖试管，采用气相色谱仪测定各有糖试管种绿叶的糖分组成，采用高效液相色谱仪(配备示差检测器Waters 2414，糖柱SUGAR KS-805 检测条件：检测器温度30℃、柱温35℃，流动相为蒸馏水，流速为1mL/min)依次测定各有糖试管中滤液的糖分纯度，合并单一糖分相同且纯度>90％的滤液，并按单一糖分不同分开收集；所得的β-葡聚糖滤液，然后经90℃水浴蒸发浓缩至约5mL；-20℃冷冻，真空冷冻干燥24h即得纯化的β-葡聚糖。

根据气相色谱仪测定β-葡聚糖滤液的糖分组成如图2所示，该滤液中含有大量的葡萄糖。进一步的，采用β-1,3葡聚糖检测试剂盒对葡萄糖进行鉴定，其结果表明该滤液中的葡萄糖为β-葡聚糖。根据液相色谱检测结果可知β-葡聚糖的纯度为98.68％，酶解后得到的粗制样品经洗脱后得到的β-葡聚糖的提取率为31.1％。

实施例2：

本实施例提供了一种从青稞谷粒中提取和纯化β-葡聚糖的方法，与实施例1的方法基本相同，区别仅在于DE-32和S-400的洗脱流速不同，即实施例2中DE-32和S-400的洗脱流速均为0.5mL/min。

本实施例收集的β-葡聚糖滤液根据气相色谱仪测定其的糖分组成可知，该滤液中含有大量的葡萄糖。进一步的，采用β-1,3葡聚糖检测试剂盒对葡萄糖进行鉴定，其结果表明该滤液中的葡萄糖为β-葡聚糖。根据液相色谱检测结果可知本实施例制备的β-葡聚糖纯度为97.63％，酶解后得到的粗制样品经洗脱后得到的β-葡聚糖的提取率为11.6％。与实施例1相比，本实施例的纯度与实施例1相当，但粗制样品经洗脱后得到的β-葡聚糖的提取率下降，这是由于洗脱流速慢的时候，各组分未知多糖按 分子量的大小缓缓经由洗脱流出，这时的分离效果比较好；洗脱速度快的时候，各组分未知多糖洗脱流出出现重叠，分离效果变差，提取率也自然降低。

对比例1：

对比例1和实施例1的区别在于：DE-32和S-400的洗脱顺序不同，即对比例1中先用S-400洗脱再用DE-32洗脱。其它操作同实施例1。

采用该对比例的方法不能分离出单一组分的糖，即本发明制备的多糖为混合多糖，不能分离纯化出β-葡聚糖。粗制样品经洗脱后所得的混合多糖的提取率为27.6％。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。