DNA/RNA病毒PCR实时增强反应试剂盒、检测试剂及其使用方法与流程

本发明涉及的dna/rna病毒pcr实时增强反应试剂盒、检测试剂及其使用方法，属于检测领域。本发明针对来源于唾液、粪便、血液、鼻腔分泌物dna/rna病毒样本，无需做提取和纯化步骤，无需做水浴煮沸步骤，无需做高温预加热处理步骤，本试剂盒试剂促进dna/rna从病毒颗粒中释放出来，实时增强pcr反应，病毒样本最低检出浓度为1拷贝。

背景技术：

聚合酶链式反应(pcr)是一种有用的工具，用于食品、环境、临床样本的快速检测。典型的pcr反应需要对样本进行dna提取和纯化的前处理步骤，去除掉众多的抑制pcr反应的因素，这一前处理步骤通常需要1至2小时完成。

常用的dna病毒提取方法：(1)蛋白酶k---苯酚抽提法，蛋白酶k在edta存在下消化蛋白质或多肽分子，sds(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解，苯酚/氯仿反复抽提，使核蛋白变性降解，使dna从核蛋白中游离出来；(2)碱裂解法，naoh溶解细胞，tris-hcl溶液调节适当ph值，edta螯合ca2+和mg2+等二价金属离子，抑制dnase(dna酶)的活性，sds与醋酸钾形成蛋白质沉淀，然后用酚/氯仿/异戊醇进行抽提，进行酒精沉淀才能得到质量稳定的dna；(3)煮沸法，采用沸水高温处理10分钟，蛋白在高温下变性，在edta螯合剂，sds，tris-hcl溶液中沉淀，离心取上清液。

常用的rna病毒提取方法：(1)异硫氰酸胍提取法，利用高浓度异硫氰酸胍使蛋白质变性，迅速破坏细胞结构，使核蛋白与rna分离，释放出rna。再通过酚，氯仿等有机溶剂抽提，离心，使rna与其他细胞组分分离，得到纯化的总rna。提取缓冲液中含有sds，酚，氯仿，胍盐等蛋白质变性剂，能够内源和外源的rnase活性，保护rna分子不被降解。(2)trizol法,主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制rna酶活性，因此trizol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源rnase(rna酶)。trizol在细胞和组织样品裂解或匀浆过程中，能保持总rna完整性，加入氯仿后，溶液分为水相和有机相，总rna在水相中。取出水相，用异丙醇可沉淀回收总rna。

现有的dna/rna病毒提取方法的缺点一是操作步骤繁琐，耗费时间，不利于现场样本的快速检测；缺点二是现有提取方法采用的离子型变构剂sds，金属螯合剂edta，残留液会抑制下一步pcr酶活性，提高了最低检测样本浓度的阈值。

本发明欲提供一种全新的pcr实时增强反应试剂盒，用于检测dna/rna病毒样本，

技术实现要素：

本发明的pcr实时增强反应试剂盒的检测试剂，由5种成分混合组成：乙基苯基聚乙二醇、溶菌酶、海藻糖、三水醋酸钠，以水为溶剂。

本发明的pcr实时增强反应试剂盒中乙基苯基聚乙二醇浓度为0.5％至3％，最佳浓度为1％。乙基苯基聚乙二醇(nonidetp-40；nonaethyleneglycoloctylphenylether)为非离子型表面活性剂，与蛋白结合力强，用于防止物质分子疏水间相互作用，确保蛋白的充分溶解和结构稳定。尤其用于膜蛋白的非变性条件下的溶解。

本发明的pcr实时增强反应试剂盒中溶菌酶浓度为10ug/ml至200ug/ml，最佳浓度为10ug/ml。溶菌酶(lysozyme)可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与dna、rna、脱辅基蛋白形成复盐，通过破坏n-乙酰胞壁酸和n-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，病毒颗粒破裂内容物逸出。

本发明的pcr实时增强反应试剂盒中海藻糖浓度为0.1mol/l至1mol/l，最佳浓度为0.3mol/l。海藻糖是蛋白酶的保护剂，稳定蛋白的构象，在pcr反应循环的升温过程中保护溶菌酶的活性。

本发明的pcr实时增强反应试剂盒中三水醋酸钠浓度为1mmol/l至5mmol/l，最佳浓度为1mmol/l。三水醋酸钠是试剂盒溶液ph值的调节剂和缓冲剂。

本发明的pcr实时增强反应试剂盒中的水为双蒸水、注射用水或无菌水。以不宜带入金属为佳，以免影响检测效果。

本发明的pcr实时增强反应试剂盒，其使用方法按照常规反应试剂盒操作即可：将病毒样本与试剂盒检测试剂混合，离心，取上清液，加入到pcr管中，直接做pcr扩增反应。pcr反应每一循环的升温过程，本试剂盒试剂促进dna/rna从病毒颗粒中释放出来，实时增强pcr反应。其中，混合病毒样本与试剂盒检测试剂以总量便于离心即可。一般按照病毒样本与试剂盒检测试剂体积比1:1-3混合，若病毒样本量多，则优选病毒样本与试剂盒检测试剂体积比1:1混合，若病毒样本量少，则采用试剂盒检测试剂补量以总量便于离心即可。

本发明的pcr实时增强反应试剂盒，其适用样本类型包括唾液、粪便、血液、鼻腔分泌物dna/rna病毒样本。唾液样本采用棉签试子刮取，将试子放于本发明的pcr实时增强反应试剂中，涡旋振荡，即可做pcr反应模板。粪便样本采用棉签试子刮取，将试子放于本发明的pcr实时增强反应试剂中，涡旋振荡，10000rpm离心2分钟，去除杂质，取上清液作为pcr反应模板。血液样本采用普通采血管采血，离心取上层血清，与本发明的pcr实时增强反应试剂等比混合，作为pcr反应模板。鼻腔分泌物样本采用棉签试子刮取，将试子放于本发明的pcr实时增强反应试剂中，涡旋振荡，10000g离心2分钟，去除杂质，取上清液作为pcr反应模板。

本发明的pcr实时增强反应试剂盒，无需做提取和纯化步骤，无需做水浴煮沸步骤，无需做高温预加热处理步骤，pcr实时增强反应试剂盒的病毒样本检出效率高，病毒样本最低检出浓度为1拷贝。本发明的pcr实时增强反应试剂盒节省病毒样本检测时间和劳动力，适合现场样本的实时快速检测的需求。

附图说明

图1四种表面活性剂筛选实验，采用荧光定量pcr仪器检测每个表面活性剂对pcr反应的影响。表面活性剂的浓度都为1％，乙基苯基聚乙二醇(np40)和聚乙二醇辛基苯基醚(tritonx-100)对pcr反应没有影响，而十二烷基硫酸钠(sds)和醋酸氯已定明显抑制pcr反应。

图2五个浓度梯度的乙基苯基聚乙二醇(np40)筛选实验，采用荧光定量pcr仪器检测不同浓度梯度的乙基苯基聚乙二醇对pcr反应的影响。pcr扩增曲线从高到低的浓度梯度顺序依次为1％，0.5％，2％，3％，5％。

图3溶菌酶与蛋白酶k的筛选实验，采用荧光定量pcr仪器检测不同含量的酶对pcr反应的影响。10ug/ml、100ug/ml、200ug/ml的溶菌酶对pcr反应没有影响，其中，10ug/ml的溶菌酶含量效果最好。而10ug/ml、100ug/ml的蛋白酶k明显抑制pcr。

图4犬细小病毒cpv2定量pcr检测结果分析；bio-radcfx96荧光定量pcr仪，rfu，相对荧光强度；cycle，每30秒一个循环。从左至右，cpv2模版浓度依次为①10⁷拷贝,②10⁶拷贝，③10⁵拷贝，④10⁴拷贝，⑤10³拷贝，⑥10²拷贝，⑦10拷贝，⑧1拷贝；1个模版的情况下，本发明的pcr实时增强反应试剂盒也能够检测出来。

图5犬细小病毒cpv-2基因片段pcr产物凝胶电泳图片；m,dna分子量标准品；样本1和样本2是犬唾液样本，样本3和样本4是犬粪便样本，样本5和样本6是犬血清样本；犬细小病毒cpv-2基因片段大小为210bp。

具体实施方式

以下结合附图，通过具体实施方式对本发明进行详细说明。

本发明的pcr实时增强反应试剂成分筛选实验：

(1)醋酸氯已定，十二烷基硫酸钠(sds)，聚乙二醇辛基苯基醚，乙基苯基聚乙二醇等四种表面活性剂的筛选实验。

材料和方法：

犬细小病毒唾液样本，四川成都宝兴宠物医院提供，并临床诊断为感染犬细小病毒的样本。病毒dna试剂盒提取，采用tianampvirusdna/rnakit试剂盒，按照说明书进行操作。提取出来的dna模版分成4组，第1组加入1％的醋酸氯已定，第2组加入1％的十二烷基硫酸钠，第3组加入1％的聚乙二醇辛基苯基醚，第4组加入1％的乙基苯基聚乙二醇。

上游引物序列cpv-f：caattggaggtaaaacaggaattaactata(seqidno.1)；

下游引物序列cpv-r：ttatcccaaatttgaccatttggataaact(seqidno.2)。

bio-radcfx96荧光定量pcr仪，solarbio公司2×sybrgreenpcr试剂盒，本试剂盒预混有缓冲液、dntp、hotstarttaqdna聚合酶、sybrgreeni染料和mgcl2，按试剂盒说明书操作加样，上下游引物各加2.5ul，终浓度0.5um，模板2ul，加水至体积20ul。定量pcr扩增参数设置：94℃0.5分钟，55℃0.5分钟,72℃1分钟,40个循环。

实验结果：

定量pcr检测结果如图1所示，乙基苯基聚乙二醇和聚乙二醇辛基苯基醚对pcr反应没有影响，而十二烷基硫酸钠和醋酸氯已定明显抑制pcr反应。

讨论：

醋酸氯已定，阳离子表面活性剂，破坏细胞膜的作用强烈，但醋酸氯已定会抑制pcr聚合酶的活性，0.3％浓度醋酸氯已定完全抑制pcr聚合酶的活性。

十二烷基硫酸钠(sds)，阴离子表面活性剂，与膜蛋白疏水部分结合并使其与膜分离，改变蛋白质的构象，但十二烷基硫酸钠严重抑制pcr聚合酶活性，0.1％浓度乙二胺四乙酸完全抑制pcr聚合酶活性。

聚乙二醇辛基苯基醚(tritonx-100)，非离子型表面活性剂，破坏细胞膜的作用强烈，但聚乙二醇辛基苯基醚具有发泡功能，pcr反应过程中产生很多小水泡，不利于后期实验。

乙基苯基聚乙二醇(nonidetp-40；nonaethyleneglycoloctylphenylether)是非离子型去垢剂，与蛋白结合力强，1％浓度基本可以破坏掉细胞膜，尤其用于膜蛋白的非变性条件下的溶解。0.5％至5％的浓度对pcr聚合酶无明显的抑制作用。

结论：

经过对比筛选实验，本发明的pcr实时增强反应试剂中表面活性剂成分选用乙基苯基聚乙二醇。

(2)表面活性剂乙基苯基聚乙二醇的浓度优化实验。

材料和方法：

dna模版的提取方法同(1)，提取出来的dna模版分成5组，从第1组到第5组分别加入0.5％、1％，2％，3％，5％的乙基苯基聚乙二醇。

实验方法同(1)。

实验结果：

定量pcr检测结果如图2所示，pcr扩增曲线从高到低的浓度梯度顺序依次为1％，0.5％，2％，3％，5％。

结论：

经过乙基苯基聚乙二醇浓度优化实验，本发明的pcr实时增强反应试剂成分乙基苯基聚乙二醇的最优浓度为1％。

(3)溶菌酶和蛋白酶k的筛选实验

材料和方法：

dna模版的提取方法同(1)，提取出来的dna模版分成5组，第1组加入10ug/ml的溶菌酶，第2组加入100ug/ml的溶菌酶，第3组加入200ug/ml的溶菌酶，第4组加入10ug/ml的蛋白酶k，第5组加入100ug/ml的蛋白酶k。

实验方法同(1)。

实验结果：

定量pcr检测结果如图3所示，10ug/ml、100ug/ml、200ug/ml的溶菌酶对pcr反应没有影响，其中，10ug/ml的溶菌酶含量效果最好。而10ug/ml、100ug/ml的蛋白酶k明显抑制pcr。

讨论：

蛋白酶k，活性强，水解蛋白完全，但需在60℃处理样本1至2小时，同时，蛋白酶k也会水解pcr聚合酶，使聚合酶失去活性。

溶菌酶，又称胞壁质酶，主要通过破坏细胞壁中n-乙酰胞壁酸和n-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，病毒颗粒破裂内容物逸出。而且溶菌酶不会破坏pcr聚合酶的结构，因此可以与聚合酶混合使用。

结论：本发明的pcr实时增强反应试剂成分中选用溶菌酶，浓度在10ug/ml至200ug/ml之间时对pcr聚合酶的活性无明显的影响。

(4)保护剂的选取，保护剂在pcr反应的高温解离步骤中，稳定酶的结构，起到保护作用，同时也具有拥挤剂作用，使得pcr实时增强反应试剂中各种成分在溶液空间中接触更近，发生化学反应的概率更高。

单糖，例如葡萄糖，稳定蛋白的构象，增强酶与底物的结合，但葡萄糖溶液易滋生细菌，在试剂盒生产过程不便于对试剂进行灭菌操作。

双糖，例如蔗糖和海藻糖，常用的酶保护剂，在pcr反应的高温解离步骤中温度上升至95℃，在高温环境条件下海藻糖比蔗糖的保护作用更好。

因此，本发明的pcr实时增强反应试剂成分选用海藻糖作为保护剂，浓度在0.1mol/l至1mol/l，最佳浓度在0.3mol/l。

(5)缓冲液的选取。

本发明的pcr实时增强反应试剂成分选用三水醋酸钠为缓冲液，三水醋酸钠安全性好，浓度在1mmol/l至5mmol/l之间，最佳浓度在1mmol/l。

本实施例中pcr实时增强反应试剂成分及含量组成：乙基苯基聚乙二醇溶液1％，溶菌酶10ug/ml，海藻糖0.3mol/l，三水醋酸钠1mmol/l，溶剂为水。

实施例

本发明用于犬细小病毒2型基因快速检测，犬细小病毒病是犬的一种具有高度接触性传染的烈性传染病。临床上以急性出血性肠炎和心肌炎为特征。

犬细小病毒对犬具有高度的接触性传染性，各种年龄的犬均可感染。但以刚断乳至90日龄的犬发病较多，病情也较严重。据临床幼犬有的可呈现心肌炎症状而突然死亡。本病一年四季均可发生，但以天气寒冷的冬春季多发。病犬的粪便中含毒量最高。

犬细小病毒是一种单链dna病毒，cpv-2是继binn等1967年从犬中分离到的第二种细小病毒，它与binn早期从健康犬分离的犬极小病毒(minutevirusofcanine，mvc)在致病性上显著不同，抗原性上也有明显差异。cpv-2在家犬和犬科其他成员间具有高度传染性。感染cpv-2发展为急性胃肠炎，临床症状表现食欲不振，呕吐，发热，出血性腹泻和白细胞减少，具有高发病率与死亡率。

(1)样本收集

四川成都宝兴宠物医院，杂交犬，雄性，4个月，经临床诊断感染犬细小病毒。

唾液病毒样本采集，采用棉签试子从犬口腔中沾取，将试子放于1.5ml离心管中，加入本发明的pcr实时增强反应试剂200ul，涡旋振荡，作为pcr反应模板。

血液病毒样本采集，采血针，100-200ul血样，普通采血管收集，离心取上清液20ul，与本发明的pcr实时增强反应试剂等比混合，作为pcr反应模板。

粪便病毒样本采集，用棉签试子插入直肠，试取内容物，放入1.5ml离心管中，加入600ul与本发明的pcr实时增强反应试剂，涡旋振荡15秒，10000g离心2分钟，取上清液pcr反应模板。

(2)引物设计

根据genbankcpv-435病毒基因序列设计引物；

上游引物序列cpv-f：caattggaggtaaaacaggaattaactata(seqidno.1)；

下游引物序列cpv-r：ttatcccaaatttgaccatttggataaact(seqidno.2)。

引物序列由擎科生物技术有限公司合成。

(3)pcr扩增

大连宝生物takaraextaq试剂盒，按试剂盒说明书操作加样，上下游引物各加2.5ul，终浓度0.5um，模板2ul，加水至体积20ul，pcr反应参数设置：94℃0.5分钟，55℃0.5分钟,72℃1分钟,30个循环。

(4)定量pcr检测结果

bio-radcfx96荧光定量pcr仪，solarbio公司2×sybrgreenpcr试剂盒，本试剂盒预混有缓冲液、dntp、hotstarttaqdna聚合酶、sybrgreeni染料和mgcl2，按试剂盒说明书操作加样，上下游引物各加2.5ul，终浓度0.5um，模板2ul，加水至体积20ul。定量pcr扩增参数设置：94℃0.5分钟，55℃0.5分钟,72℃1分钟,40个循环。定量pcr检测结果见图4。

(5)电泳检测结果

犬细小病毒cpv2的pcr产物凝胶电泳图谱见图5，样本1和样本2是犬唾液样本，样本3和样本4是犬粪便样本，样本5和样本6是犬血清样本；犬细小病毒cpv-2基因片段大小为210bp。pcr产物条带清晰明亮，说明采用本发明的pcr实时增强反应试剂盒，犬唾液、粪便和血清病毒样本无需提取纯化步骤，直接做pcr反应，就能扩增出目的dna序列片段。

(6)分析与结论

犬细小病毒cpv2定量pcr检测结果分析，从左至右，cpv2模版浓度依次为①10⁷拷贝,②10⁶拷贝，③10⁵拷贝，④10⁴拷贝，⑤10³拷贝，⑥10²拷贝，⑦10拷贝，⑧1拷贝；1个模版的情况下，本发明的pcr实时增强反应试剂盒也能够检测出来。说明发明的pcr实时增强反应试剂盒，病毒样本最低检出浓度为1拷贝。

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