一种吡啶并吡唑酮类衍生物及其抗甲型流感病毒方面的应用的制作方法

本发明涉及医药领域，具体涉及一种具有抗甲型流感病毒活性的吡啶并吡唑酮类衍生物。

背景技术：

近年来流感病毒频繁爆发，严重危害到人类和动物的生命健康。由于流感病毒抗原性转变和抗原性漂移的存在，使流感病毒具有了极高的变异性，新型流感病毒的出现也对社会卫生事业造成了巨大威胁。2013年我国多省(市)出现的高致病性H7N9流感病毒，就是一种新重组的禽流感病毒，确诊感染病例的死亡率接近30％。近两年，广东等地又出现了人感染新型H5N6和H10N8等禽流感病毒的病例。因此，流感的防治，尤其是药物治疗，已迫在眉睫。

迄今为止，在全球临床应用的抗流感药物神经氨酸酶抑制剂和M2离子通道抑制剂两类共5种，目前两类药物的耐药病毒株均已经出现。因此，目前函需探索新的药物作用靶点，开发新的抗流感药物，寻找新的治疗方案。

流感病毒进入抑制剂有望发展成为新型抗流感药物。流感病毒通过其表面血凝素蛋白(HA)介导，首先是HA1亚基与靶细胞表面的唾液酸受体结合，通过胞吞作用进入细胞，在胞内体的低pH环境下，HA2亚基发生构象改变，使隐藏的融合肽暴露出来，插到胞内体膜上，同时三分子HA2也形成类似六螺旋束的结构，拉近病毒膜与胞内体膜的距离而发生融合，形成融合孔，将病毒的核酸释放到胞浆内。阻断病毒进入靶细胞的过程，可以有效抑制流感病毒的感染。血凝素蛋白在这一过程中发挥重要作用，有望成为潜在的抗病毒药物靶点，开发新的抗病毒药物。

天然产物具有结构的多样性和生物活性的多样性。天然产物及其衍生物在以往的疾病治疗中发挥了无可限量的作用，也是当今药物研发过程中最具有潜力的资源之一。本发明首次合成一种吡啶并吡唑酮类衍生物，命名为化合物J1，具有显著的抗甲型流感病毒的活性。实验结果表明该化合物为研发出新型的抗甲型流感病毒的先导化合物，寻找新型结构的抗流感病毒药物提供了可能。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了一种化合物，3-(4-氯苯基)-4,5-二氢-1,4-二苯基-1氢-吡唑[3,4-b]吡啶-6(7氢)-酮，如式I所示，简称为化合物J1，所述化合物J1能够抑制甲型流感病毒的进入，从而为流感病毒性疾病的预防和治疗提供一种新的途径和手段，具有重要的研发价值和开发意义。本发明还提供了所述化合物J1的用途。

本发明一个方面提供了一种化合物，3-(4-氯苯基)-4,5-二氢-1,4-二苯基-1氢-吡唑[3,4-b]吡啶-6(7氢)-酮，其结构如式I所示。

本发明另一个方面提供了一种式I所示化合物在制备抗流感病毒药物中的应用。

其中，所述流感病毒为甲型流感病毒，优选为H1N1、H3N2、H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H7N9、H9N2或H10N8。

本发明再一个方面提供了式I所示化合物在制备抑制H5N1和H7N9亚型假病毒进入靶细胞的药物中的应用。

其中，所述式I所示化合物抗甲型流感病毒中的作用机制是靶向流感病毒血凝素HA2亚基，抑制流感病毒进行膜融合，可以用于制备预防和治疗流感的药物。

本发明再一个方面提供了式I所示化合物的制备方法，其包括以下步骤：

1)将4-氯苯甲酰乙腈，苯肼加入水中，搅拌并加热至回流；

2)回流0.5-5小时后，依次加入苯甲醛、米氏酸，在100℃下继续搅拌至反应完全；

3)以有机溶剂进行萃取，并合并有机相后去除溶剂，柱层析进行纯化后获得式I所示化合物。

其中步骤2)中的有机溶剂选自乙酸乙酯。

本发明所述的化合物结构式如下

上述所示的化合物J1能够剂量依赖的抑制抗H5N1、H3N2、H1N1、H7N9亚型甲型流感病毒的进入。

本发明所述的化合物J1靶向流感病毒血凝素HA2亚基，从而抑制流感病毒进行膜融合，可以用于制备预防和治疗流感的药物。

本发明所述的化合物J1能作为先导化合物进行结构修饰，获得活性更好地化合物并制成抗流感病毒药物。

本发明所述的化合物J1可用于制成抗甲型流感的药物。结合现代常用药物制剂手段，可将所述的化合物制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液，从而采用比较方便的口服给药形式，其中本发明化合物在所述药物中的质量百分比含量为1～20％。

上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

综上所述，本发明具有以下优点和效果

1、本发明首次发现一种吡啶并吡唑酮类衍生物具有抗甲型流感病毒的作用，为流感病毒性疾病的预防和治疗提供一种新的小分子天然药物。

2、本发明所述的化合物J1在浓度范围内没有细胞毒性。该化合物能够剂量依赖的抑制H5N1、H3N2、H1N1、H7N9亚型甲型流感病毒的进入，提供广谱的抗病毒作用，可以用于制备预防和治疗流感的药物。

3、本发明所述的化合物具有吡啶并吡唑酮结构，结构新颖，目前未见该结构的化合物抗流感病毒方面的报道，因此，可以作为先导化合物进行结构修饰。

4、本发明所述的化合物J1抗甲型流感病毒的作用机制为靶向流感病毒血凝素HA2亚基，从而抑制流感病毒进行膜融合，可以用于制备预防和治疗流感的药物。

5、本发明所述的化合物J1可单独制成抗流感病毒药物。

附图说明

图1禽流感假病毒实验检测化合物J1对H5N1和H7N9流感病毒假病毒的抑制效果。A.H5N1假病毒对MDCK细胞的感染性；B.化合物J1对多种H5N1假病毒的抑制活性；C.化合物J1对H7N9假病毒的抑制活性。

图2 MST实验检测化合物靶向流感病毒血凝素蛋白HA。

图3血凝抑制实验测定化合物不能作用于流感病毒血凝素蛋白HA1。

图4 ELISA实验测定化合物靶向流感病毒血凝素蛋白HA2。

具体实施方式

为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施方法对本发明内容作进一步说明，但本发明的保护内容不局限以下实施例。

本发明所用材料

293T细胞和犬肾细胞(MDCK)在包含有10％热灭活胎牛血清(FBS)，50单位毫升青霉素和50微克/毫升链霉素(P/S)的DMEM培养基中培养。MDCK在病毒感染后,在含有1微克/毫升的TPCK胰蛋白酶但不含有胎牛血清的MEM中培养。所有的人源H5N1假病毒，分别是A/Qinghai/59/2005，A/Xinjiang/1/2006，A/Anhui/1/2005，A/Hong Kong/156/1997，A/Thailand/Kan353/2004，A/VietNam/1194/2004。所用流感病毒株具体为：A/HongKong/415742/2009(H1N1)、A/Vietnam/1194/2004(H5N1)、A/Anhui/1/2013(H7N9)，分别在MDCK细胞中增殖并在本研究中使用。所有与活病毒相关试验是在生物安全2级或3级设施中进行。

实施例1吡啶并吡唑酮类衍生物J1的合成方法

在5mL的圆底烧瓶中加入4-氯苯甲酰乙腈(1mmol，179mg)，苯肼(1mmol，108mg)，水(2mL)，搅拌，加热至回流(100℃)，2小时后，依次加入苯甲醛(1mmol，106mg)，米氏酸(1mmol，144mg)，100℃下继续搅拌，1小时后，停止反应，加入乙酸乙酯(3×5mL)萃取并合并有机相，旋转蒸发除去溶剂后，柱层析分离提纯。得到产物3-(4-chlorophenyl)-4,5-dihydro-1,4-diphenyl-1H-pyrazolo[3,4-b]pyridin-6(7H)-one，3-(4-氯苯基)-4,5-二氢-1,4-二苯基-1氢-吡唑[3,4-b]吡啶-6(7氢)-酮243mg，产率61％，为白色固体。

上述化合物表征如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.03-7.96(m,NH),7.71–7.42(m,8H,aromactic),7.33(dd,J＝13.9,6.4Hz,3H,aromatic),7.26(d,J＝7.3Hz,1H,aromatic),7.21(d,J＝7.3Hz,2H,aromatic),4.50(d,J＝5.7Hz,1H,CH),3.22(dd,J＝16.0,7.7Hz,1H,CH2),2.90(dd,J＝15.9,2.0Hz,1H,CH2).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ169.17,147.65,141.79,138.78,137.09,134.06,130.90,129.96,129.15,128.69,128.39,128.25,127.41,126.87,123.39,101.72,40.88,35.40,-0.07.EI(-)-MS m/z,calcd for C24H18ClN3O(M)399.87,found 398.57。

实施例2选择性指数

选择性指数是通过50％的细胞毒性浓度(CC₅₀)除以50％的病毒抑制浓度(IC₅₀)计算而来的，该指标数值越高则指示该药物有越好的临床应用前景。我们通过法测定了本发明所述化合物的CC₅₀，再通过H5N1禽流感假病毒试验或者活病毒实验确定IC₅₀值，最终得到了本发明所述化合物的选择性指数。

实施例3体外抗H5N1禽流感假病毒的活性实验

假病毒实验是指将表达H5N1流感病毒包膜蛋白的HA质粒、NA质粒和表达荧光素酶(Luciferase)报告基因的vpr和env缺陷的pNL4-3.Luc.R-E-质粒，共转染293T细胞，组装只能复制一次的H5N1禽流感假病毒。由于禽流感病毒进入靶细胞的过程由包膜蛋白HA所介导，因此假病毒实验是一个高度敏感、客观、安全的模拟真病毒进入的实验体系，可用于评价化合物抑制流感病毒进入靶细胞的活性。293T细胞由293细胞派生，同时表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区的质粒可以复制。293T细胞转染效率高，蛋白表达水平高，转染后2-3天用碱性磷酸酶分析可较容易地检测到表达的蛋白。瞬时转染293T细胞是过表达蛋白并获得细胞内及细胞外蛋白的便捷方式。

实施例4H5N1假病毒的制备

1)293T细胞培养：10％小牛血清的DMEM培养液，1％谷氨酰胺，2％青/链霉素。将处于对数生长期的293T细胞以3x10⁵/ml密度接种于6孔细胞培养板，毎孔2ml，37℃，5％CO₂细胞培养箱过夜；

2)次日，待细胞密度达到孔底面积80％左右，按照PEI转染试剂说明书步骤进行转染；在一支无菌小EP管中加入15μl PEI转染试剂和200μl不含血清和双抗的DMEM培养基，室温混匀5min；

3)往PEI-DMEM混合液体中加入3μg pNL4-3R^-E^-Luc质粒，1μg HA质粒和1μg NA质粒，混匀室温静置20min；

4)将转染复合物加入细胞中，轻轻转动六孔板，使其分布均匀；

5)37℃，5％CO₂细胞培养箱培养24h，吸去6孔板上清，加入含有新鲜10％胎牛血清和双抗的DMEM培养液；

6)37℃，5％CO₂细胞培养箱继续培养24h，搜集细胞培养上清，离心，搜集病毒上清，分装，保存于-80℃冰箱中。

实施例5假病毒感染能力测定

1)以每孔1×10⁴个MDCK细胞接种于96孔细胞培养板中，在37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养24h至细胞长成单层；

2)将收集的病毒原液用DMEM培养基2倍倍比稀释，加入到96孔细胞培养板中，每个稀释度3个复孔，终体积为200μL。设置细胞对照，不加假病毒。

3)在37℃，5％CO₂细胞培养箱继续培养48h后，弃去上清，用200μL/孔PBS缓冲溶液洗涤两次；

4)按照荧光素酶检测试剂盒说明书操作，检测病毒的感染能力，每孔加入60μl的细胞裂解液，至于振荡器上振荡20min；

5)吸取50μl 96孔细胞培养板中的细胞裂解液，加入到96孔平底荧光素酶检测板中，然后同时加入50μl的荧光素酶底物；

6)用酶标仪测荧光素酶的化学发光值。以细胞对照孔化学发光值的2.5倍作为cutoff值，化学发光值大于cutoff均视为阳性。

实施例6检测化合物J1对多种H5N1毒株假病毒进入的抑制作用

1)以每孔1×10⁴个MDCK细胞接种于96孔细胞培养板中，在37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养24h；

2)将50μl 2倍倍比稀释的样品与50μl假病毒在37℃下孵育30min；

3)往96孔板中加入化合物和假病毒的混合物，在37℃的细胞培养箱继续培养48小时；阳性对照药物为CL-385319。

4)30min后，将病毒与样品的混合物共同加入到96孔平底培养板中，在37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养48h；

5)在37℃，5％CO₂细胞培养箱继续培养48h后，弃去上清，用PBS缓冲溶液洗涤两次；

6)按照荧光素酶检测试剂盒说明书操作，检测病毒的感染能力，每孔加入60μl的细胞裂解液，至于振荡器上振荡20min；

7)吸取50μl 96孔细胞培养板中的细胞裂解液，加入到96孔平底荧光素酶检测板中，然后同时加入50μl的荧光素酶底物；

8)用酶标仪测荧光素酶的化学发光值。

9)根据化学发光值的大小，判断药物抑制病毒进入的活性。

化合物抑制率(％)＝[1-(E-N)/(P-N)]×100

E代表实验组的化学发光值，N代表阴性对照组的化学发光值，P代表阳性对照组的化学发光值。化合物的半数抑制浓度(IC₅₀)作为化合物的抗流感病毒活性的指标。阳性对照药为CL385319。

实施例7细胞毒性研究

采用细胞毒性实验常用的XTT法。具体方法如下：

将MDCK细胞接种于96孔细胞培养板，每孔100μl，细胞数为1×10⁴个/孔，待24h后长成完整单层，用DMEM将化合物稀释成10个不同浓度，每孔加入100μl化合物，每孔总体积200μl，同时设正常细胞对照组置于37℃、5％CO₂温箱中继续培养48h，加入含0.02μM PMS的0.5mg/ml的XTT 50μl/孔，继续培养4h，酶标仪于450nm处测定吸光度值，并进一步计算半数细胞死亡浓度CC₅₀。

实施例8体外抗甲型流感活病毒的实验

本发明所述化合物针对多个亚型的流感病毒，包括H1N1、H3N2、H5N1、H7N9亚型的抗病毒效果进行了测试。犬肾上皮细胞系MDCK的病毒感染效率高，增殖快，不易变异，是公认的最适于甲，乙型流感病毒疫苗生产的细胞系之一。具体方法如下：

在96孔板中MDCK细胞中，加入50μL不同浓度(40、20、10、5、2.5、1.25μM)的待测化合物，每孔加入50μL的流感病毒(MOI＝0.002)，在37℃,5％CO₂环境下培养1h后，洗去病毒和药物，继续加入含1μg/ml TPCK(除了H5N1毒株)的培养基100μL，继续培养。24小时后，收集细胞上清液，并采用反转录-实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-quantitative PCR)技术测定病毒的低毒。实施例8本发明所述化合物神经氨酸酶抑制实验

H5N1假病毒转染的包膜蛋白包括血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。为检测样品是否有神经氨酸酶抑制剂作用，我们将采用碧云天公司的神经氨酸酶抑制剂筛选试剂盒。对照药物为扎那米韦。

1)在96孔荧光酶标板内每孔加入70μl神经氨酸酶检测缓冲液；

2)然后每孔加入10μl神经氨酸酶，再每孔加入10μl待筛选的神经氨酸酶抑制剂样品，振动摇匀1min后与37℃孵育2min；

3)加入10μl的神经氨酸酶荧光底物，再振动1min，37℃孵育20min进行荧光测定。

实施例9微量热泳动仪Microscale Thermophoresis(MST)

MST可以快速分析多种生物样品的相互作用。该测量方法基于分子在温度梯度场中的定向运动，即“热泳动”。热泳动变化取决于分子的电荷、大小或者水化层的变化。我们检测缓冲液固定的梯度试验中荧光分子的热泳动。缓冲液保持固定的情况下，热泳动的损耗或富集只与荧光分子的电荷、大小或者溶解熵的变化有关。梯度稀释的非荧光分子结合到荧光标记的分子上至少会引起电荷、大小和溶解熵三者之一的变化，这种变化会引起热泳动变化，我们通过检测热泳动变化来定量结合。试验中，荧光分子浓度[A0]保持恒定，每次滴定时所使用的滴定剂浓度[T0]均有变化。测量中所得出的荧光信号值(方程1)直接与形成复合体的荧光分子部分相对应，x＝[AT]/[A0]，该值可轻松与推导公式拟合，以得出Kd。在本报告的结果中，相对荧光分布值Fnorm以‰为单位，绘制成曲线图。

在建立靶向血凝素蛋白的高通量筛选模型中，我们将荧光标记(NT-647)共价结合到蛋白HA上(NHS结合)。MST试验中，保持NT-647标记的蛋白HA浓度0.1μM不变，同时非标记的化合物在200μM–0.39μM之间梯度稀释。反应溶液为PBS buffer(含有0.05％Tween-20；1％DMSO)。短时间的结合反应后，将样品装载到MST NT115Premium毛细管中，通过Monolith NT115标记型来测量。X轴的浓度单位为μM。

实施例10血凝抑制实验

流感病毒进入靶细胞是由病毒包膜上的血凝素介导的。该蛋白由HA1和HA2两个亚基组成，其中HA1亚基与靶细胞膜上的唾液酸受体结合，HA2则为跨膜亚基，介导病毒膜与胞内体膜的融合。我们可以进一步研究该化合物是否作用于血凝素蛋白HA1亚基，干扰其与靶细胞上的唾液酸受体结合。可采用血凝抑制试验。具体方法如下：

血凝实验(HA)：在96孔V型血凝板中1-11孔加入25μl PBS，第12孔加入50μl PBS，其次往第一孔加入25μl的H5抗原，然后再依次倍比稀释至第11孔，最后每孔加入25μl的1％鸡红细胞，静置30min左右，观察鸡红细胞凝集情况，算出凝集单位。

血凝抑制实验(HI)：在96孔微量反应板上，自左至右各孔加50μL不同稀释度的待测化合物，然后加入4个血凝单位不同亚型的血凝素抗原(购自哈尔滨兽医研究所)混匀后，每孔加入0.5％鸡红细胞悬液50μL，在振荡器上振荡，室温下静置10min后观察结果，待对照孔红细胞沉淀，即可进行结果判定。红细胞全部凝集，沉于孔底，平铺呈网状，即为100％凝集(++++)；不凝集者(-)红细胞沉于孔底，呈点状。该方法可以确定活性单体化合物是否作用于血凝素蛋白的HA1亚基受体结合区，抑制流感病毒与靶细胞的粘附。对照药物为抗不同亚型血凝素的血清。

实施例11与血凝素蛋白HA2亚基结合

采用酶联免疫吸附测定enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)实验。间接竞争ELISA分析方法将抗原物质吸附在固相载体上，使待测小分子化合物与固相载体上的抗原竞争性的结合已知量的特异性抗体，检测吸光度值。

具体方法为：

将2μg/mL His-HA2包被在96孔酶标板上，每孔100μL，4℃吸附过夜；PBST洗涤后拍干；用含1％BSA的PBS封闭，每孔200μL，37℃孵育1h，PBST洗涤后拍干；将梯度稀释的化合物J1和HA2的单克隆抗体IC9，每孔100μL加入到已封闭好的酶标板中，37℃孵育1h，PBST洗涤后拍干。加入稀释至工作浓度的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG和显色底物，检测吸光度值。不加药物为阳性对照。

实施例12与血凝素蛋白HA2亚基结合作用机制的分子对接

为了阐明化合物与血凝素蛋白HA2亚基结合位点的结合模式，探讨化合物阻止流感病毒进入的机制，我们利用分子对接的方法进行了研究。

发明人选取了H5N1HA晶体结构PDB(2IBX)作为研究。因为PDB(2IBX)是VN1194毒株的HA的晶体，我们将VN1194的HA蛋白序列与上述5种H5N1毒株的HA序列进行比对，同源性高达95％，与A/Qinghai/59/2005的同源性更高达96.7％。

具体操作流程为：从Protein Data Bank上下载H5N1avian influenza A virus蛋白(PDB编号：2IBX，分辨率：)。采用USCF Chimera准备蛋白和配体分子的结构，去除溶剂分子，修补蛋白质肽链。采用Dock Prep模块添加氢原子，分别为蛋白和配体分子添加AMBERff4SB力场和AM1-BCC电荷。采用Chimera中的DMS工具以半径为的探针生成蛋白的分子表面，使用sphgen模块生成围绕活性位点的球状集合(Spheres)，使用Grid模块生成Grid文件，该文件用于快速的基于Grid的能量打分评价。采用DOCK6程序进行柔性对接(flxible docking)，生成1000个不同的构象取向(orientation)以及获得化合物与结合口袋中残基间的静电和范德华相互作用，并由此计算得到Grid打分。通过聚类分析(RMSD阈值为)，得到打分最佳的构象。最后，通过Chimera分析计算结果，并采用PyMOL生成图片。

试验结果本发明化合物具有抑制H5N1禽流感假病毒病毒进入的活性

结果如图1A所示，病毒原液2倍稀释时化学发光值达到了10⁵，表明制备的H5N1假病毒具有很强的感染能力。通过检查细胞裂解液的化学发光值，可以判定化合物的抑制活性。

从图1B，可以知道本发明所述的化合物J1具有抑制H5N1禽流感病毒的效果，其选择性指数见表1。化合物J1对VSVG假病毒没有抑制作用。由于这两种假病毒的制备只是转入的包膜蛋白质粒不同，因此该化合物J1抗H5N1假病毒的靶点为血凝素蛋白或神经氨酸酶。为判断化合物J1抗H5N1禽流感假病毒的活性是否是由细胞毒性引起的，我们进一步检测该化合物J1的细胞毒性，如表1所示，用MTT实验检测该化合物J1在抗流感活性浓度的情况下，对MDCK细胞没有明显的毒性作用。

随后，测试了化合物J1对神经氨酸酶活性的影响(数据未展示)。当高浓度时，化合物J1对神经氨酸酶活性没有明显的抑制作用，而阳性药物组(扎那米韦)则对流感病毒神经氨酸酶活性有明显的抑制作用。这说明，该化合物J1抗甲型流感病毒活性的发挥不是通过此机制实现的。

表1.化合物J1抗H5N1禽流感假病毒感染的抑制活性

2本发明化合物体外抗甲型流感病毒的活性

研究表明，化合物J1对不同亚型甲型流感病毒有明显的抑制作用，且存在明显的量效关系，随药物浓度增加而抑制率升高。

表2化合物抗流感病毒活性

本发明化合物可与血凝素蛋白HA结合

为确证本发明所述化合物J1抗H5N1假病毒的靶点为血凝素蛋白，采用微量热泳动仪MST进行分析。如图2所示吡唑并吡啶酮类化合物呈剂量依赖性的与血凝素蛋白发生相互作用，K_d值为0.54±0.181μΜ。表明该化合物可以和流感病毒的血凝素蛋白进行结合，从而抑制流感病毒的进入。

4本发明化合物不能作用于血凝素蛋白HA1亚基

流感病毒进入靶细胞是由病毒包膜上的血凝素介导的。该蛋白由HA1和HA2两个亚基组成，其中HA1亚基与靶细胞膜上的唾液酸受体结合，HA2则为跨膜亚基，介导病毒膜与胞内体膜的融合。我们可以进一步研究该化合物是否作用于血凝素蛋白HA1亚基，干扰其与靶细胞上的唾液酸受体结合。如图3所示，该化合物的血凝抑制实验为阴性，表明化合物的作用位点不是HA1亚基上的唾液酸受体结合区域，因此其抑制流感病毒进入的作用位点可能是HA2亚基。

5本发明化合物能作用于血凝素蛋白HA2亚基

如图4所示，流感病毒血凝素蛋白HA2亚基能够与化合物J1以特异性的方式结合。即HA2为化合物J1的靶点，化合物J1通过与HA2结合抑制了HA介导的流感病毒膜与宿主细胞膜的融合，从而抑制了流感病毒进入宿主细胞。

6本发明化合物靶向血凝素蛋白HA2亚基

根据H5N1的晶体结构(2IBX)，茎部区域由G1₂、L2₂、K51₂、E105₂、R106₂、T107₂、L108₂、D109₂、F110₂、T22₁、M24₁、E25₁和R322₁氨基酸残基组成。