一种利用聚乙烯亚胺提高热激法质粒转化大肠杆菌感受态效率的方法与流程

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种利用阳离子多聚化合物聚乙烯亚胺提高CaCl₂法质粒转化大肠杆菌转化效率的方法。

背景技术：

质粒转化大肠杆菌是分子生物学中最常用的方法之一，即将体外重组的质粒DNA导入感受态细胞进行扩增从而获得大量的阳性克隆的过程。主要用于质粒载体的扩增与保存、基因克隆及表达载体构。转化效率的高低直接影响到前后实验的进展和工作效率。

目前质粒转化方法主要有电转化法和热激法。电转化法利用瞬间高压在细胞表面形成孔径从而使外源DNA进入，其转化效率高，每微克DNA可得到10⁹-10¹⁰个转化子，但需要配备特殊的仪器。自1972年Cohen成功地将R因子和重组质粒DNA导入大肠杆菌细胞后，CaCl₂法作为一项经典的分子生物学转化技术沿用至今，CaCl₂法又名热激法，该方法通过用CaCl₂处理细胞，改变膜对DNA的通透性，使其处于最适合摄取和容纳外来DNA的生理状态。转化效率为每微克DNA获得10⁶-10⁷转化子。该方法以相对成本较低，操作方便和相对理想的转化效率受到科学工作者的广泛青睐。

影响热激法转化效率的因素有很多。现有的方法主要针对大肠杆菌感受态细胞的制备(如：E.coli菌株生长时期、感受态细胞的保存时间及保存方法等)以及转化条件(如：冰浴时间，热激处理时间，预培养时间等)进行优化，虽然这可以提高转化效率，但是仍然可以考虑在转化过程中加入增效剂，使得转化效率获得进一步提高。

聚乙烯亚胺(Polyethyieneimine，PEI)含有大量带正电的氮原子，被广泛应用于水处理、食品、造纸等领域。PEI电荷密度大，1995年被首次用作基因载体，此后被大量用于基因载体的研究。其所带正电荷能与DNA静电结合，保护并输送DNA，形成的复合物尺寸小且带较高的正电荷易于被细胞摄取。

本发明由此提出一种在热激法转化体系中加入PEI作为增效剂以提高转化效率的方法。迄今为止国内外还没有关于利用电正性高分子聚合物来有效提高转化效率的报道。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种利用聚乙烯亚胺提高热激法质粒转化大肠杆菌转化效率的方法，其可以显著提高转化效率，并且操作简单，成本低廉。

本发明是这样实现的：

一种利用多聚化合物聚乙烯亚胺(PEI)提高热激法大肠杆菌转化效率的方法，包括以下步骤：

步骤1、用感受态细胞试剂盒制备E.coli BL21(DE3)感受态，每管100ul，备用；

步骤2、配制浓度为10^-7v/v-10^-8v/v的PEI溶液，备用；

步骤3、在100ul的E.coli BL21(DE3)中加入1ug质粒DNA，加入1ul步骤2配制好的PEI溶液，依次进行冰浴30min，42℃水浴70s，冰浴5min，置于超净台内，加入900ul SOC培养基，37℃、225rpm培养1h，对培养物进行离心，弃去上清后再用150-200ul培养基重悬菌体涂布加入氨苄的固体平板培养基，37℃过夜培养。

本发明的有益效果为：通过在转化体系中加入不同浓度的PEI溶液，可以显著提高质粒DNA在大肠杆菌中的转化效率，并且操作简单，成本低廉。

【附图说明】

图1：是用pPIC9转化E.coli BL21(DE3)感受态时加入不同浓度PEI后获得的阳性克隆图，平板上转化子数量可体现不同浓度PEI对转化效率的影响。

图2：是用pET22b转化E.coli BL21(DE3)感受态时加入不同浓度PEI后获得的阳性克隆图，平板上转化子数量可体现不同浓度PEI对转化效率的影响。

【具体实施方式】

下面结合附图与实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中使用的试剂和方法，如无特殊说明，均采用常规试剂和使用常规方法。

实施例一：不同浓度PEI溶液对pPIC9转化E.coli BL21(DE3)的影响

步骤1、用宝生物工程(大连)有限公司感受态细胞试剂盒Competent Cell Preparation Kit(Takara)制备感受态E.coli BL21(DE3)(100ul/管)，备用。

步骤2、配制10％v/v的PEI(pH＝7.9)水溶液，将10ml的聚乙烯亚胺[Polyethyleneimine solution～50％,Sigma Aldrich]加入70ml H₂O中，用浓盐酸滴定至pH7.9，并用H₂O调体积至100ml，4℃避光保存。再将10％v/v PEI储液用水稀释至浓度为10^-5v/v、10^-6v/v、5×10^-7v/v、10^-7v/v、5×10^-8v/v、10^-8v/v、10^-9v/v的PEI溶液，备用。

步骤3、取1ul pPIC9质粒(10ng/ul)加入制备好的E.coli BL21(DE3)感受态细胞中(100ul/管)，加入1ul浓度为0、10^-5v/v、10^-6v/v、10^-7v/v、10^-8v/v、10^-9v/v的PEI溶液。

步骤4、冰浴30min.

步骤5、42℃水浴70s。

步骤6、冰浴5min。

步骤7、置于超净台内，加入900ul SOC培养基，37℃、225rpm培养1h。

步骤8、取100ul培养物分别涂布加入氨苄的固体平板培养基，37℃过夜培养。

常规转化时，步骤3应取1ug质粒DNA加入100ul感受态细胞；步骤8应先对培养物进行离心，弃去上清后再用150-200ul培养基重悬菌体涂布平板。然而这样做涂布的平板密度太大，不能直接观察出差异。故减少加入DNA的质量至10ng并用100ul培养物涂布平板。

实验结果如图1所示，其中1-1：空白(不加PEI的转化体系)的菌落生长情况；1-2：加入1ul 10^-6v/v PEI转化体系的菌落生长情况；1-3：加入1ul 10^-7v/v PEI转化体系的菌落生长情况；1-4：加入1ul 10^-8v/v PEI转化体系的菌落生长情况；1-5：加入1ul 10^-9v/v PEI转化体系的菌落生长情况。

结果显示，转化体系内加入10^-7、10^-8v/v PEI溶液后获得转化子数量明显多于不加PEI的空白组；加入10^-6、10^-9v/v PEI溶液后获得的转化子数量与空白组接近；加入10^-5v/v PEI溶液的转化体系无转化子(结果未展示)，这可能是由于PEI浓度过大产生细胞毒性从而引起感受态细胞死亡。由此可见，提高质粒转化大肠杆菌效率的最适PEI浓度为10^-7v/v-10^-8v/v。

实施例二:不同浓度PEI对pET22b转化E.coli BL21(DE3)的影响

1、取1ul pET22b质粒(10ng/ul)加入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中(100ul/管)，加入1ul浓度为0、10^-5v/v、5×10^-7(v/v)、10^-7v/v、5×10^-8v/v的PEI溶液。

2、冰浴30min。

3、42℃水浴70s。

4、冰浴5min。

5、置于超净台内，加入900ul SOC培养基，37℃、225rpm培养1h。

6、取100ul培养物分别涂布加入氨苄的固体平板培养基，37℃过夜培养。

由于在实施例一已发现提高质粒转化大肠杆菌效率的最适PEI浓度为10^-7v/v-10^-8v/v，所以在本实施例步骤1中，加入最适浓度的PEI溶液，验证是否能有效提高另一种质粒对E.coli BL21(DE3)转化效率。

与实施例一相同，实施例二也减少加入DNA的质量至10ng并用100ul培养物涂布平板，旨在能够直接的观察出结果的差异性。

实验结果如图2所示：其中2-1：空白(不加PEI的转化体系)的菌落生长情况；2-2：加入1ul 5×10-⁷v/v PEI转化体系的菌落生长情况；2-3：加入1ul 10^-7v/v PEI转化体系的菌落生长情况；2-4：加入1ul 5×10^-8v/v PEI转化体系的菌落生长情况。同样，加入10^-5v/v PEI溶液的转化体系也无转化子出现(结果未展示)。

结果显示，在转化体系内加入5×10^-7、10^-7、5×10^-8v/v的PEI溶液后获得转化子数量明显多于不加PEI的空白组，证明了实施例一中得到的PEI最适浓度同样能有效提高另一种质粒对E.coli BL21(DE3)转化效率，即证明了本专利提出的技术方案是具有可重复性。

根据以上实施例所述，在CaCl2法(热激法)转化质粒DNA进入E.coli BL21(DE3)时，加入适当浓度的聚乙烯亚胺确实可以显著提高转化效率，获得更多转化子。该方法操作简单，重复性良好，而且PEI价格低廉易获取，可广泛应用。

虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，本发明所描述的具体实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。