本发明涉及一种从微生物发酵液中分离或纯化洛伐他汀或其药学上可接受的盐的方法。
背景技术：
洛伐他汀(Lovastatin)又叫做艾乐汀，其化学名为化学名称：(S)-2-甲基丁酸-(1S，3S，7S，8S，8aR)-1，2，3，7，8，8a-六氢-3，7-二甲基-8-{2-[(2R，4R)-4-羟基-6氧代-2-四氢，具体结构式如下：
洛伐他汀为第一代他汀类物质，现在多被用来作为他汀类活性药物普伐他汀的前体，因此洛伐他汀的收率和质量直接影响着普伐他汀的成本和纯度。
现有提取制备洛伐他汀的方法主要是将发酵液加热、碱化过滤，然后对滤液进行萃取或对滤液进行树脂交换提取，采用大孔树脂吸附结合柱层析的工艺存在操作繁琐、提取成本高、生产周期长、收率低等问题，逐渐被溶媒萃取的方法所取代。
但是溶媒萃取法也存在着缺陷。PCT专利申请WO 9720834阐述了一种洛伐他汀提取方法，将发酵液用NaOH调到碱性，然后用甲苯和乙醇混合溶媒在搅拌下萃取，在萃取液中加入大量的甲苯和珍珠岩，用硝酸酸化，搅拌下加氯仿，压滤，浓缩，结晶得粗品再重结晶。此法使用混合溶媒，回收困难，使用多种溶媒使生产操作变得复杂；同时在提取过程中2次pH调节至11以上，一次至pH值2左右，调节过于频繁，并且对于设备的耐酸和耐碱提出了过高要求，容易腐蚀设备。
在PCT专利申请WO 0063411提供了一种新方法：用NaOH调发酵液至碱性，在低温下搅拌，离心分离，收集上清用硫酸调至酸性，加入丁酯和正辛烷的混合溶媒萃取，离心分离，萃取液真空浓缩低温结晶。此发明中仍然使用混合溶媒萃取，回收困难，碱性萃取乳化严重，需使用大量的破乳剂，给后面的精制过程带来了困难；并且将调节pH值的次数降低至2次，但是仍然是强酸和强碱都出现，仍然对于设备的耐酸和耐碱提出了过高要求，容易腐蚀设备。
美国专利US 2003215932(A1)阐述的洛伐他汀提取方法是将发酵液用硫酸酸化并加热，在高温下搅拌环化，然后对发酵液用甲苯萃取，滤渣用碳酸氢钠液和无盐水洗涤，然后进行真空浓缩，低温结晶分离，洗涤。在提取工艺的最初就对发酵液就进行环化操作，需要加热的发酵液体积庞大，几乎是在整体提取工艺体积最大的阶段，并且发酵液中还含有强氧化性硫酸，需要消耗大量的能源并且容易腐蚀设备。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种收率高的、节能、适应大规模生产的从微生物发酵液中分离提取洛伐他汀或其药学上可接受的盐的方法。
本发明创造性的在萃取菌渣前，引入吹干菌渣的步骤，发现该步骤可以显著的提高洛伐他汀粗品的收率。过滤后的菌渣残留水、溶于水的一些亲水杂质和容易挥发的杂质等，这些杂质会直接影响后期的萃取和环化效率，延长环化和萃取工艺的时间。菌渣吹干过程中，溶于水的一些亲水杂质和容易挥发的杂质等随着水蒸气被移除，另外，吹干后的菌渣重量减少，可以减少后续萃取中使用有机溶剂和用于洗涤的溶液的用量。
具体的，本发明从发酵液中分离或纯化洛伐他汀或其药学上可接受的盐的方法包括以下步骤：
(1)取洛伐他汀发酵液，在搅拌状态下慢慢加入浓硫酸将发酵液的pH调节到1.0-5.0；
(2)过滤，菌渣吹干至菌渣含水量为10％-70％；
(3)在菌渣中加入有机溶剂，浸泡，过滤，向滤液中加入滤液体积10％的1.0％-5.0％的NaHCO3溶液，分出水层，保留有机层；
(4)将有机层进行浓缩，浓缩液降温搅拌，结晶；洛伐他汀的环化反应在浓缩时进行；
(5)过滤，并用10-20℃的冷乙酸乙酯洗涤过滤得到的粗品晶体，在40℃-50℃左右烘干粗品晶体得到洛伐他汀粗品。
(6)将粗品溶解于丙酮，加热至50-60℃，并使用活性炭脱色，过滤除去活性炭，降温至5-15℃，保温2-4小时，结晶，过滤结晶液，40-50℃左右烘干，获得洛伐他汀成品。
优选的，所述步骤(1)中浓硫酸调节发酵液pH至3.0-4.0。
更优选的，所述步骤(1)中浓硫酸调节发酵液pH至3.5-4.0。
优选的，步骤(2)中菌渣吹干使用的是室温空气吹干。
优选的，所述步骤(3)中有机溶剂为疏水性有机溶剂，选自但是不限于乙酸丁酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、甲酸乙酯、己酮、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷、甲苯、苯甲醇中的一种或者几种。
优选的，所述步骤(3)中有机溶剂的加入量与菌渣的投放比例为，有机溶剂的总投入量相当于菌渣总投入量的1.0-10.0倍(V/W)。
更优选的，所述步骤(3)中有机溶剂的加入量与菌渣的投放比例为，有机溶剂的总投入量相当于菌渣总投入量的4.0-6.0倍(V/W)。
最优选的，所述步骤(3)中有机溶剂的加入量与菌渣的投放比例为，有机溶剂的总投入量相当于菌渣总投入量的4.5倍(V/W)。
优选的，所述步骤(4)中有机层浓缩的温度控制在40℃-85℃。
优选的，所述步骤(4)中有机层浓缩的条件控制为气压为-0.080MPa，温度为55℃，浓缩时间为10小时。
优选的，所述步骤(4)中有机层浓缩的条件控制为气压为大气压时，温度为85℃，浓缩时间为40小时。
优选的，所述步骤(4)中浓缩液降温搅拌时，搅拌速度为150rpm，搅拌时间为6-8个小时。控制搅拌速度在较低的范围，延长搅拌时间，使得晶体生长变慢，得到体积大的粗品晶体，便于下面的过滤步骤。
本发明从发酵液中离或纯化洛伐他汀或其药学上可接受的盐的方法包括以下步骤：
(1)取洛伐他汀发酵液，在搅拌状态下慢慢加入浓硫酸将发酵液的pH调节到3.5-4.0；
(2)过滤，菌渣吹干至菌渣含水量为40-50％；
(3)在菌渣中加入菌渣重量4.0-6.0倍的乙酸乙酯浸泡5-6小时进行过滤，向滤液中加入滤液体积10％的1％的NaHCO3溶液，滤液静置后分出水层；
(4)将萃取滤液进行浓缩，浓缩时气压为-0.080MPa以上，温度为55℃，浓缩进行10个小时，浓缩至产品量5-7倍的小体积，接着将浓缩液的降温搅拌，结晶；
(5)过滤，并用10-20℃的冷乙酸乙酯洗涤粗品晶体，烘干粗品晶体得到洛伐他汀粗品。
(6)将粗品溶解于丙酮，加热至50-60℃，并使用活性炭脱色，过滤除去活性炭，降温至5-15℃，保温2-4小时，结晶，过滤结晶液，40-50℃左右烘干，获得洛伐他汀成品。
现有的文献资料公开了发酵液预处理时，可以加酸或者加碱，加酸时pH值调节至1.0-5.0左右，加碱时pH值调节至12.0左右。根据实际生产设备状况，发明人选择进行加酸处理，并且经过反复试验发现pH值越低，洛伐他汀溶解增加，但是当pH低于3.5时，洛伐他汀的溶解增加变得缓慢，并且pH值越低对设备的腐蚀性越大，增加设备折旧，增大生产成本。因此发明人选择将pH值调节至3.5-4.0左右，平衡收率与生产成本的关系。
本发明涉及的从发酵液中离或纯化洛伐他汀或其药学上可接受的盐的方法，在提取初期对发酵液进行了pH值调节，之后的提取步骤皆是在pH值接近中性的条件下进行，整套流程中仅调节一次pH值，不仅节约了酸碱试剂，并且减轻了对设备的腐蚀。另外，提取过程中使用单一溶媒乙酸乙酯，便于溶媒的回收；同时乙酸乙酯添加仅出现在萃取和洗涤粗品晶体，而菌渣吹干后再添加乙酸乙酯，乙酸乙酯的整体添加量少。
本发明创造性的在发酵液调节pH值至酸性时或者萃取时，没有进行升温环化步骤，而是去掉升温环化的步骤，缩短了萃取所需的时间。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
实验组1(参照CN 102344446)
发酵液1L，用5mol/L HCl调至pH1.5，搅拌沉化1小时，过滤，收集菌渣，向在菌渣中加入0.25L丁酯，在温度55℃条件下搅拌萃取菌渣3小时，分离，收集萃取液，保温在30℃，加50ml 0.5mol/L NaOH搅拌洗涤30分钟，静置15分钟去除水相，有机相加入50ml 0.5mol/L HCl，搅拌洗涤30分钟，静置15分钟去除水相，有机相加入50ml去离子水，搅拌洗涤30分钟，静置15分钟去除水相，有机相进行真空浓缩(温度65-70℃，真空度小于0.08MPa)至体积约30ml，降温到12℃，保温3小时，离心分离并干燥得粗品。
实验组2(参照US5712130)
1L洛伐他汀的发酵液，用盐酸调节pH值至3-5，降低温度至低于20度，加入500ml乙酸丁酯提取4个小时，离心保留有机相，丢弃水相和菌渣。有机相在减压条件下40度左右浓缩至体积为50ml，在浓缩的同时发生环化，浓缩液冷却至温度低于20度，静置数小时得到结晶的洛伐他汀，将洛伐他汀重新结晶。
实验组3(参照US2003215932A)
在1L发酵液中加入63.5ml 2N硫酸，pH至2.0，升温至50-55度，搅拌22小时。
894.1mL甲苯萃取发酵液，有机相萃取液用157.6mL 5％碳酸氢钠和78.8mL双蒸水洗涤，洗涤过的有机相萃取液在40-60度下真空浓缩至23.5mL；浓缩液冷却至5-8度，搅拌2h，过滤，滤饼用15.3mL预冷至5-10度的甲苯洗涤，滤饼干燥，获得洛伐他汀。
实验组4
取1L洛伐他汀发酵液，在搅拌状态下慢慢加入浓硫酸将发酵液的pH调节到3.5-4.0。
过滤，菌渣吹干至菌渣含水量为50％。
在菌渣中加入菌渣重量4.5倍的乙酸乙酯浸泡5小时进行过滤，过滤完成后，向滤液中加入滤液体积10％的1％的NaHCO3溶液，将滤液静置1.5小时后分出水层，保留有机相。
将有机相进行浓缩，浓缩时气压为-0.080Mpa以上，55℃左右进行10h，浓缩至产品量的5倍小体积，接着将浓缩液的温度降至10℃，搅拌保温6小时，搅拌速度为150rpm，结晶。
过滤，并用15℃的冷乙酸乙酯洗涤粗品晶体，在40℃左右烘干粗湿品得到洛伐他汀粗品。
实验组5
取10L洛伐他汀发酵液，在搅拌状态下慢慢加入浓硫酸将发酵液的pH调节到3.5-4.0，
过滤，菌渣吹干至菌渣含水量为50％。
在菌渣中加入菌渣重量5.0倍的乙酸乙酯，升温至85℃，保温环化，环化完成后，进行过滤，将滤液静置后分出水层，保留有机相。
将有机相进行浓缩，接着将浓缩液的温度降至10℃，搅拌保温6小时，搅拌速度为150rpm，结晶。
过滤，并用15℃的冷乙酸乙酯洗涤粗品晶体，在40℃右烘干粗湿品得到洛伐他汀粗品。
实验组6
取1L洛伐他汀发酵液，在搅拌状态下慢慢加入浓硫酸将发酵液的pH调节到3.5-4.0，
过滤，菌渣吹干至菌渣含水量为50％。
在菌渣中加入菌渣重量5.0倍的乙酸乙酯浸泡5小时进行过滤，并用少量乙酸乙酯洗涤菌渣，过滤完成后，将滤液静置1小时后分出水层，保留有机相。
将有机相进行浓缩，浓缩时气压为-0.080Mpa以上，55℃左右进行10h，浓缩至产品量的5倍小体积，，接着将浓缩液的温度降至10℃，搅拌保温6小时，搅拌速度为150rpm，结晶。
过滤，并用15℃的冷乙酸乙酯洗涤粗品晶体，在40℃左右烘干粗湿品得到洛伐他汀粗品。
将实验1-6获得的洛伐他汀粗品按照以下步骤精制制备洛伐他汀成品：
将粗品溶解于丙酮，加热至55℃，并使用活性炭脱色，过滤除去活性炭，降温至10℃，保温2小时，结晶，过滤结晶液，40-50℃左右烘干，获得洛伐他汀成品。
实验1-6的实验结果见表1。
表1、实验1-6洛伐他汀成品收率列表
结论：从以上表格成品洛伐他汀收率和纯度的实验数据可以看出，实验组4的洛伐他汀成品收率达到了82.0％，远高于实验组1-3、5-6的洛伐他汀成品收率。实验组1-3、5-6为对比实施例，其中实验组6为在实验组4的基础上，去掉“向滤液中加入滤液体积10％的1％的NaHCO3溶液”步骤，为说明加入NaHCO3溶液洗涤的有益效果；而实验组5为在实验组6的基础上进一步将浓缩阶段的环化步骤移至萃取同时进行的实验方案，为说明环化步骤的位置改变对实验方案的影响，而实验组4为本发明所述方法，因此，本发明所述方法优于对比实施例的方法，大幅度提升了美伐他汀成品收率。
实施例2
取1L洛伐他汀发酵液，在搅拌状态下慢慢加入浓硫酸将发酵液的pH调节到3.5-4.0。
过滤，菌渣吹干。
在菌渣中加入菌渣重量5.0倍的乙酸乙酯浸泡5小时进行过滤，过滤完成后，向滤液中加入滤液体积10％的1％的NaHCO3溶液，将滤液静置1小时后分出水层，保留有机相。
将有机相进行浓缩，浓缩时气压为-0.080Mpa以上，55℃左右进行10h，浓缩至产品量的5倍小体积，接着将浓缩液的温度降至10℃，搅拌保温6小时，搅拌速度为150rpm，结晶。
过滤，并用15℃的冷乙酸乙酯洗涤粗品晶体，在40℃左右烘干粗湿品得到洛伐他汀粗品。
将粗品溶解于丙酮，加热至55℃，并使用活性炭脱色，过滤除去活性炭，降温至10℃，保温2小时，结晶，过滤结晶液，40-50℃左右烘干，获得洛伐他汀成品。
吹干菌渣含水量至5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％，90％(未经吹干菌渣)，实验结果见表2。
表2、菌渣含水量对洛伐他汀提取的影响
结论：从以上表格可以看出，菌渣吹干，减少菌渣含水量可以降低加入乙酸乙酯的量、萃取时间，并且可以提高收率和纯度。吹干菌渣有利于提高提取效率。
菌渣含水量进一步降低至低于50％时，乙酸乙酯加入量和萃取时间仍会继续随着菌渣含水量降低而减少，收率和纯度随着菌渣含水量降低而增加缓慢或者不增加。说明菌渣含水量不高于50％时，进一步降低菌渣含水量仅会减少乙酸乙酯加入量和萃取时间，收率和纯度并不会再显著提升；而含水量越低，需要吹干的时间延长，会增加生产时间，因此发明人确定将菌渣吹干至菌渣含水量为40-50％为最佳的生产条件。
实施例3
取1L洛伐他汀发酵液，在搅拌状态下慢慢加入浓硫酸将发酵液的pH调节到3.5。
过滤，菌渣吹干至菌渣含水量40％。
在菌渣中加入菌渣重量4.0倍的乙酸乙酯浸泡5小时进行过滤，过滤完成后，向滤液中加入滤液体积10％的1％的NaHCO3溶液，将滤液静置1小时后分出水层，保留有机相。
将有机相进行浓缩，浓缩在减压下55度左右进行10h，接着将浓缩液的温度降至5℃，搅拌保温6小时，搅拌速度为150rpm，结晶。
过滤，并用15℃的冷乙酸乙酯洗涤粗品晶体，在40℃左右烘干粗湿品得到洛伐他汀粗品。
将粗品溶解于丙酮，加热至50℃，并使用活性炭脱色，过滤除去活性炭，降温至5℃，保温4小时，结晶，过滤结晶液，40-50℃左右烘干，获得洛伐他汀成品。
实施例4
取1L洛伐他汀发酵液，在搅拌状态下慢慢加入浓硫酸将发酵液的pH调节到3.5。
过滤，菌渣吹干至菌渣含水量50％。
在菌渣中加入菌渣重量6.0倍的乙酸乙酯浸泡5小时进行过滤，过滤完成后，向滤液中加入滤液体积10％的1％的NaHCO3溶液，将滤液静置1小时后分出水层，保留有机相。
将有机相进行浓缩，浓缩在减压下40度左右进行10h，接着将浓缩液的温度降至5℃，搅拌保温6小时，搅拌速度为150rpm，结晶。
过滤，并用10℃的冷乙酸乙酯洗涤粗品晶体，在50℃左右烘干粗湿品得到洛伐他汀粗品。
将粗品溶解于丙酮，加热至60℃，并使用活性炭脱色，过滤除去活性炭，降温至15℃，保温3小时，结晶，过滤结晶液，40-50℃左右烘干，获得洛伐他汀成品。
实施例5
取1L洛伐他汀发酵液，在搅拌状态下慢慢加入浓硫酸将发酵液的pH调节到4.0。
过滤，菌渣吹干至菌渣含水量为50％。
在菌渣中加入菌渣重量5.0倍的乙酸乙酯浸泡5小时进行过滤，过滤完成后，向滤液中加入滤液体积10％的1％的NaHCO3溶液，将滤液静置1.5小时后分出水层，保留有机相。
将有机相进行浓缩，浓缩时气压为-0.080Mpa以上，55℃左右进行10h，浓缩至产品量的5倍小体积，，接着将浓缩液的温度降至10℃，搅拌保温6小时，搅拌速度为150rpm，结晶。
过滤，并用15℃的冷乙酸乙酯洗涤粗品晶体，在40℃左右烘干粗湿品得到洛伐他汀粗品。
将粗品溶解于丙酮，加热至50℃，并使用活性炭脱色，过滤除去活性炭，降温至8℃，保温2.5小时，结晶，过滤结晶液，40-50℃左右烘干，获得洛伐他汀成品。
实施例6
取1L洛伐他汀发酵液，在搅拌状态下慢慢加入浓硫酸将发酵液的pH调节到3.5-4.0。
过滤，菌渣吹干至菌渣含水量为10％。
在菌渣中加入菌渣重量1.0倍的乙酸丁酯浸泡5小时进行过滤，过滤完成后，向滤液中加入滤液体积10％的5.0％的NaHCO3溶液，将滤液静置1.5小时后分出水层，保留有机相。
将有机相进行浓缩，浓缩时气压为-0.080Mpa以上，55℃左右进行10h，浓缩至产品量的7倍小体积，，接着将浓缩液的温度降至10℃，搅拌保温6小时，搅拌速度为150rpm，结晶。
过滤，并用20℃的冷乙酸丁酯洗涤粗品晶体，在50℃左右烘干粗湿品得到洛伐他汀粗品。
将粗品溶解于丙酮，加热至58℃，并使用活性炭脱色，过滤除去活性炭，降温至12℃，保温3小时，结晶，过滤结晶液，40-50℃左右烘干，获得洛伐他汀成品。
实施例7
取1L洛伐他汀发酵液，在搅拌状态下慢慢加入浓硫酸将发酵液的pH调节到3.5-4.0。
过滤，菌渣吹干至菌渣含水量为70％。
在菌渣中加入菌渣重量10.0倍的甲苯浸泡5小时进行过滤，过滤完成后，向滤液中加入滤液体积10％的1.0％的NaHCO3溶液，将滤液静置1.5小时后分出水层，保留有机相。
将有机相进行浓缩，浓缩时气压为-0.080Mpa以上，55℃左右进行10h，浓缩至产品量的7倍小体积，，接着将浓缩液的温度降至10℃，搅拌保温6小时，搅拌速度为150rpm，结晶。
过滤，并用20℃的冷甲苯洗涤粗品晶体，在50℃左右烘干粗湿品得到洛伐他汀粗品。
将粗品溶解于丙酮，加热至5460℃，并使用活性炭脱色，过滤除去活性炭，降温至14℃，保温3.5小时，结晶，过滤结晶液，40-50℃左右烘干，获得洛伐他汀成品。