一种干酪乳杆菌及其冻干制剂在猪饲料中的应用的制作方法

本发明属微生物领域，涉及一种干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)菌株，本发明还涉及其冻干制剂在猪饲料中的应用。

背景技术：

在养猪生产中，仔猪的消化器官和生理机能尚没有发育完全，胃酸分泌不足，内源性消化酶活性较低，肠道内的微生态平衡尚未建立起来，有害细菌容易乘虚而入，导致仔猪腹泻，影响仔猪的生长和成活率。因此，给仔猪补充能产有机酸、能抑制有害细菌(如大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等)、能促进仔猪健康生长的饲用乳酸菌，是一条重要解决途径。

干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)是乳酸杆菌属(Lactobacillus)中的种群之一，是农业部公布的《饲料添加剂品种目录(2013)》允许用于动物养殖的乳酸菌。有关干酪乳杆菌在饲料中应用的申请专利有：“一株干酪乳杆菌及其在饲料中的应用”(申请号201210277454.4)，该干酪乳杆菌L-1，是从土壤中筛选分离得到的，该菌株能发酵产生磷脂酶A2，以该菌株作为发酵菌株，以含植物磷脂的油料作物或其加工副产品为发酵底物，以硫酸铵、氯化钠、玉米淀粉作为能量供体，通过固态发酵制备饲料添加剂，用于肉猪饲料中。“一种干酪乳杆菌发酵液在饲料中的应用”(申请号为201310162105.2)，公开了干酪乳杆菌1yT-7发酵液在饲料中的应用，将干酪乳杆菌发酵液通过喷雾干燥并加入脱毒后的油菜饼，制成含干酪乳杆菌10⁹活菌/克的饲料添加剂，用于仔猪饲料中。“一种干酪乳杆菌及其在饲料发酵中的应用”(申请号201210594249.0)，涉及的干酪乳杆菌(Hzd-lc-002)分离于陈年花生壳中，采取厌氧方式培养，其发酵液用于饲养育肥猪和肉鸭。

上述专利技术通过固态发酵、液态发酵、液态发酵后喷雾干燥等方式制备饲料添加剂，应用于动物饲料中，没有涉及到猪源干酪乳杆菌，没有涉及到菌种的产酸性能、抑制有害菌情况和冻干制备存活率方面的内容。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于提供一株从健康猪肠道中分离、选育得到的干酪乳杆菌；

本发明的第二个目的在于提供适合上述干酪乳杆菌生长的培养基；

本发明的第三个目的在于提供所述干酪乳杆菌的冻干制剂及制剂的制备方法；

本发明的目的还在于提供所述干酪乳杆菌在猪饲料中的用途。

本发明从健康猪肠道中分离、选育出一株猪源干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)，命名为干酪乳杆菌ZLC018，经过体外产酸、抑菌等一系列试验，证明其具有益生特性。通过优化培养基、冻干保护剂和冻干工艺，提高了菌株的培养效率和冻干存活率，制备的冻干制剂添加到保育猪饲料中，能降低猪的腹泻率，提高日增重，显著降低粪便中有害菌数量。该菌株于2014年06月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101。保藏编号：CGMCC No.9041，生物保藏存活信息：存活。

本发明干酪乳杆菌ZLC018具有以下特性：

①37℃下，培养18h后，进入生长稳定期；培养24h，活菌数达到6.0×10⁹CFU/mL；

②37℃下，培养24h，pH达到3.69，发酵液中乳酸含量达到105.92mmoL/L；培养48h，pH达到3.66，发酵液中乳酸含量达到220.75mmoL/L；

③在pH＝2.0的人工胃液中处理4h，存活率77.62％；在pH＝6.8的人工肠液中处理4h，存活率95.56％；

④对有害细菌具有抑制作用。该菌发酵液对10⁶CFU/mL的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌有抑制作用，抑菌圈直径达18～24.2mm。

所述干酪乳杆菌ZLC018的一种优选培养基的组成为：葡萄糖80g、大豆蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母浸粉20g、无水乙酸钠5g、柠檬酸氢二铵2g、K₂HPO₄·3H₂O 2g、MgSO₄·7H₂O 0.6g、MnSO₄·H₂O 0.2g、碳酸钙0.5g、吐温-801mL、蒸馏水1000mL。利用该培养基配方，可使该菌的培养效率大幅提高，活菌数不低于6.0×10⁹CFU/mL，效果优于MRS培养基。

所述干酪乳杆菌ZLC018的一种优选冻干保护剂的组成为：脱脂奶粉25g、海藻糖10g、L-半胱氨酸1g、乳糖5g、谷氨酸钠3g、糊精20、甘油1g、羧甲基纤维素钠0.4g、蒸馏水100mL。利用该保护剂配方，可使该菌的冻干存活率达到94.6％。

所述干酪乳杆菌ZLC018冻干制剂的制备方法，包括如下工艺步骤：

①种子液制备：采取逐级扩大的方法，将于-70℃下保存的干酪乳杆菌ZLC018以1％的接种量接种于液体培养基中，在37℃下培养18h后，为一级种子液；一级种子液再以1％的接种量接种于液体培养基中，于37℃下培养18h，为二级种子液，待用；

②扩大培养：将干酪乳杆菌ZLC018的种子液以1％的接种量接种于液体培养基中，在37℃下培养22～24h；

③离心分离菌体：将步骤②中扩大培养制得的发酵液离心分离，得到菌泥；

④保护剂的配制：将所需蒸馏水用滤膜孔径为0.22μm的无菌滤器过滤至无菌桶中，依次称取保护剂成分，混匀；

⑤乳化：将配制好的保护剂和菌泥混合均匀，采用高剪切分散乳化机，转速3000r/min乳化30min，制成菌悬液；

⑥真空冷冻干燥：将乳化好的菌悬液室温稳定30min，置于冷冻盘中，厚度在0.5～1.5cm，预冻2h，然后在冷凝温度为-30℃、真空度0.37Pa的条件下真空冷冻干燥20h，得到冻干粉；

⑦收取冻干粉，粉碎、分装，铝箔袋真空包装，低温保存。

研究表明，本发明干酪乳杆菌ZLC018易培养、生长好，且具有较强的产酸、耐酸及具有抑菌作用。本发明干酪乳杆菌ZLC018在猪饲料中的应用效果：在保育猪日粮中添加干酪乳杆菌ZLC018冻干制剂，使日粮中的活菌数达到4.0×10⁹CFU/kg，保育猪的腹泻率下降7.5个百分点，存活率提高3.33个百分点，日增重提高12.71％，料重比降低7.34％，猪粪中的有害细菌数量大幅度下降，其中：大肠杆菌数量下降46.29％，金黄色葡萄球菌数量下降30.82％。饲喂干酪乳杆菌ZLC018冻干制剂后，改善了保育猪的健康状况，有利于其生产潜能的发挥。

附图说明

图1干酪乳杆菌ZLC018菌体、菌落及发酵液图片，图1a为MRS培养基，于37℃下，培养48h后的菌体形态(革兰氏染色)，图1b为MRS培养基，于37℃下，培养48h后的菌落形态；图1c为优化培养基培养24h的发酵液图片。

图2干酪乳杆菌ZLC018培养过程OD_600nm变化曲线。

图3干酪乳杆菌ZLC018培养过程pH变化曲线。

具体实施方式

实施例1分离、筛选与鉴定猪源干酪乳杆菌ZLC018

从北京某规模猪场选择健康的保育猪宰杀，取肠道，刮取肠粘膜与无菌生理盐水混匀。取1mL悬液，用无菌生理盐水分别稀释为10^-5、10^-6、10^-7，各取0.1mL分别涂布于MRS固体培养基、SL固体培养基和LBS固体培养基上，37℃厌氧培养。48h后挑取疑似乳杆菌的乳白色菌落，进行厌氧纯培养。48h后，挑取半个培养后的菌落进行H₂O₂酶试验和革兰氏染色镜检，凡是革兰氏染色阳性、H₂O₂酶试验阴性、菌体形态为杆状的菌株可初步确定为乳杆菌。然后将剩下的半个菌落进行划线培养，直至确定为纯菌，然后对分离得到的菌株进行分类编号，并进行冷冻保存。

对分离得到的菌株，通过生长曲线、产酸、耐酸、耐胆盐和抑菌等特性分析，筛选出了综合特性最好的一株乳杆菌，并对该菌株进行了形态学特征、生理生化特征和16S rRNA基因序列测定，鉴定为：干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)。该菌株的理化特征见表1，DNA序列见序列表SEQ ID No.1。

菌株的菌体和菌落形态见图1。在MRS固体培养基上，该菌菌落呈乳白色、规则、凸起、湿润、不透明、边缘整齐。菌体呈杆状，0.65～1.2×2～6μm，成对或成链状排列；革兰氏染色阳性。

表1干酪乳杆菌ZLC018的生理生化特征

注：表中“+”表示≥90％菌株阳性，“－”表示≥90％菌株阴性，“d”表示80％～90％菌株阳性。

菌种ZLC018保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏信息如下：

菌株名称：干酪乳杆菌Lactobacillus casei

保藏名称：干酪乳杆菌ZLC018

保藏日期：2014年06月18日

生物保藏存活信息：存活

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所

邮政编码：100101

保藏编号：CGMCC No.9041

实施例2测定干酪乳杆菌ZLC018的生物特性

2.1生长曲线

采用OD_600nm和pH值为指标，测定了干酪乳杆菌ZLC018的生长特性。结果见图2干酪乳杆菌ZLC018培养过程OD_600nm变化曲线，图3干酪乳杆菌ZLC018培养过程pH变化曲线。

由图2、图3可知，干酪乳杆菌ZLC018在4～12h期间，菌液OD_600nm值迅速增加，pH值迅速下降；12～18h期间，菌液OD_600nm和pH值变化逐渐减小，说明已经达到对数生长末期；18h以后OD_600nm和pH值变化不明显，表明该菌进入了生长稳定期。

2.2产酸测定

将活化2次的干酪乳杆菌ZLC018的种子液以1％的接种量(体积比，下同)接种于本发明的液体培养基中，在37℃下培养，分别在12h、24h、36h、48h、72h、96h、120h取样，采用乳酸脱氢酶法测定发酵液中乳酸含量，检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。结果见表2。

表2干酪乳杆菌ZLC018培养不同时间发酵液中乳酸含量

2.3耐酸试验

2.3.1人工胃液的配制：氯化钠0.2g、胃蛋白酶1g，用pH2.0或pH3.0的稀盐酸溶液100mL充分溶解后，用微孔滤膜过滤除菌，待用。

2.3.2将活化2次的干酪乳杆菌ZLC018的种子液以1％的接种量接种于本发明的液体培养基中，在37℃下培养24h，取5mL菌液，6000r/min离心5min，弃上清液，分别加入已灭菌的生理盐水(pH 6.5)和已过滤除菌的不同pH的人工胃液5mL，37℃保温，在0h、2h、4h取样进行平板菌落计数，计算存活率，结果见表3。

表3干酪乳杆菌ZLC018在人工胃液中的存活率(％)

由表3可知，干酪乳杆菌ZLC018在pH2.0和pH3.0的人工胃液中作用4h，存活率分别为77.62％和85.11％。说明干酪乳杆菌ZLC018有较强的耐酸性，能适应动物的胃酸环境。

2.4耐人工肠液试验

2.4.1人工肠液的配制：磷酸二氢钾0.68g，加蒸馏水溶解，用0.4％的氢氧化钠溶液调节pH值，至体积为100mL，pH6.8。然后加1g胰蛋白酶，充分溶解后用微孔滤膜过滤除菌，待用。

2.4.2将活化2次的干酪乳杆菌ZLC018的种子液以1％的接种量接种于本发明的液体培养基中，37℃培养24h，取5mL菌液，6000r/min，离心5min，弃上清，分别加入已灭菌的生理盐水(pH 6.5)和已过滤除菌的人工肠液(pH6.8)5mL，37℃保温，在0h、2h、4h取样进行平板菌落计数，结果见表4。

表4干酪乳杆菌ZLC018在人工肠液中的存活率(％)

由表4可知，干酪乳杆菌ZLC018在人工肠液中作用4h，其活菌数没有显著变化，存活率为95.56％，说明干酪乳杆菌ZLC018不受人工肠液的影响，能适应动物的肠道环境。

2.5抑菌试验

采用牛津杯法进行抑菌试验。

2.5.1制备干酪乳杆菌ZLC018发酵液、无菌体上清液和菌体悬液：将活化2次的干酪乳杆菌ZLC018的种子液以1％的接种量接种于本发明的液体培养基中，在37℃下培养24h，得到发酵液。取5mL发酵液于无菌离心管中，6000r/min离心5min，得到的上清液，用0.22μm的无菌滤器过滤，得到无菌体上清液；离心得到的菌泥用无菌生理盐水洗涤2次，再用5mL无菌生理盐水悬浮，制成菌体悬液。

2.5.2制备指示菌平板：将活化2次的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌以1％的接种量分别接种于MH液体培养基中，在37℃下培养18h后，制成1麦氏比浊标准的菌悬液，按1％的体积比与温度低于50℃的MH琼脂培养基混合均匀，每只平皿(规格为直径90mm)倾注15mL，冷却制得指示菌平板。

2.5.3将灭菌的牛津杯置于指示菌平板上，把制备的干酪乳杆菌ZLC018发酵液、无菌体上清液和菌体悬液分别加入牛津杯中，每孔200μL，以生理盐水和未接菌的培养基为对照，4℃冰箱扩散5h，在30℃条件下培养16～18h,测定抑菌圈直径。结果见表5。

表5干酪乳杆菌ZLC018抑菌结果(mm)

牛津杯内径6mm、外径8mm、高10mm。

实施例3制备干酪乳杆菌制剂

乳酸菌冻干制剂具有活性稳定，易储藏，使用方便的特点。冻干制剂可以直接在饲料中添加，也可以与饮用水混合制成不同活菌含量的液体制剂供动物饮用，还可以与饲料原料或全价饲料混合进行固体扩繁培养或固态发酵。而在冻干制剂的生产过程中，培养基配方、冻干保护剂和冻干工艺是重要技术环节，直接影响活菌存活率、冻干制剂活菌数以及单位生产成本。本发明对这三个技术环节进行了技术改进，取得了显著效果。

3.1改进干酪乳杆菌ZLC018的培养基

针对干酪乳杆菌ZLC018的生物学特性，以MRS培养基为基础配方，采用正交试验设计L₁₆(4⁵)法，对其中的葡萄糖、大豆蛋白胨、酵母浸粉和牛肉膏用量进行了优化筛选。最终筛选出效果最佳的培养基配方为：葡萄糖80g、大豆蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母浸粉20g、无水乙酸钠5g、柠檬酸氢二铵2g、K₂HPO₄·3H₂O 2g、MgSO₄·7H₂O 0.6g、MnSO₄·H₂O 0.2g、碳酸钙0.5g、吐温-801mL、蒸馏水1000mL。将以上成分混合，加热溶解，校正pH6.5，分装，121℃高压灭菌15min。用此培养基培养的干酪乳杆菌，活菌数不低于6.0×10⁹CFU/mL，效果优于MRS培养基。结果见表6。

表6干酪乳杆菌ZLC018在不同培养基中的活菌数(CFU/mL)

MRS培养基配方：葡萄糖20g、蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母浸粉5g、无水乙酸钠5g、柠檬酸氢二铵2g、K₂HPO₄·3H₂O 2g、MgSO₄·7H₂O 0.58g、MnSO₄·H₂O 0.19g、吐温-80 1mL、蒸馏水1000mL。

3.2优化干酪乳杆菌ZLC018的冻干保护剂

采用响应曲面法，对干酪乳杆菌冻干粉的冻干保护剂成分进行了优化。用Plackett-Burman设计，发现脱脂奶粉、海藻糖和L-半胱氨酸等物质对干酪乳杆菌ZLC018的存活率有显著影响，利用最陡爬坡法逼近最大响应区域，由中心组合设计和响应面法分析确定最优冻干保护剂的复配比例，即：脱脂奶粉25g、海藻糖10g、L-半胱氨酸1g、乳糖5g、谷氨酸钠3g、糊精20g、甘油1g、羧甲基纤维素钠0.4g、蒸馏水100mL。用该配方，可使干酪乳杆菌ZLC018的冻干存活率达到94.6％。

3.3干酪乳杆菌冻干制剂的制备方法，包括如下工艺步骤：

①种子液制备：采取逐级扩大的方法，将于-70℃下保存的干酪乳杆菌ZLC018以1％的接种量接种于液体培养基中，在37℃下培养18h后，为一级种子液；一级种子液再以1％的接种量接种于液体培养基中，于37℃下培养18h，为二级种子液，待用；

②扩大培养：将干酪乳杆菌ZLC018的种子液以1％的接种量接种于液体培养基中，在37℃下培养22～24h；

③离心分离菌体：将步骤②中扩大培养制得的发酵液离心分离，得到菌泥；

④保护剂的配制：将所需蒸馏水用滤膜孔径为0.22μm的无菌滤器过滤至无菌桶中，依次称取保护剂成分，混匀；

⑤乳化：将配制好的保护剂和菌泥混合均匀，采用高剪切分散乳化机，转速3000r/min乳化30min，制成菌悬液；

⑥真空冷冻干燥：将乳化好的菌悬液室温稳定30min，置于冷冻盘中，厚度在0.5～1.5cm，预冻2h，然后在冷凝温度为-30℃、真空度0.37Pa的条件下真空冷冻干燥20h，得到冻干粉；

⑦收取冻干粉，粉碎、分装，铝箔袋真空包装，低温保存。

实施例4干酪乳杆菌ZLC018冻干制剂耐受性试验

在225mL的人工胃液(pH2.0)、225mL的人工肠液(pH6.8)和225mL含猪胆盐的溶液(胆盐最终浓度为0.3％)中，分别加入25g的干酪乳杆菌ZLC018冻干制剂，混合均匀，置于转速75r/min摇床中，37℃保温。在0h、2h、4h和6h时，分别取样进行平板菌落计数，计算存活率，结果见表7。

表7干酪乳杆菌ZLC018冻干制剂在人工胃液、人工肠液和0.3％猪胆盐溶液中存活率(％)

由表7可知，干酪乳杆菌ZLC018冻干制剂在人工胃液(pH2.0)和人工肠液(pH6.8)中，0h至2h活菌数略微下降，随后增加；在猪胆盐溶液(0.3％)中活菌数持续增加，说明干酪乳杆菌ZLC018冻干制剂中的保护成分能够提高菌体对人工胃液、人工肠液和猪胆盐的耐受能力，能够提高菌体在动物胃肠道的存活率。

实施例5干酪乳杆菌ZLC018冻干制剂在保育猪饲料中应用

5.1试验材料与方法

试验在北京某猪场进行。

选择健康、体重和日龄相近的保育猪180头，随机分成3个组(对照组、抗生素组和乳酸菌组)，每组6个重复，每个重复10头猪。自由采食、自由饮水，网床饲养，室内温度24～28℃，饲养管理按常规进行。试验期为30d。

对照组饲喂基础日粮；抗生素组在基础日粮中添加杆菌肽锌和硫酸粘杆菌素，每千克饲料中含40mg杆菌肽锌和8mg硫酸粘杆菌素；乳酸菌组在基础日粮中添加干酪乳杆菌ZLC018冻干粉，每千克饲料中有效活菌数达到4.0×10⁹CFU。日粮的组成及营养水平见表8。

表8保育猪日粮组成及营养水平(风干基础)

注：1)复合预混料为每千克饲料提供Cu 150mg；Fe 150mg；Zn 140mg；Mn 40mg；Se 0.3mg；I 0.6mg；VA 8000IU；VD₃ 1800IU；VE 24IU；VK 1.8mg；VB₁ 1.6mg；VB₂ 6mg；VB₆3.2mg；VB₁₂ 0.05mg；生物素0.3mg；叶酸1.2mg；烟酸24mg；泛酸18mg；氯化胆碱0.4g；L-赖氨酸盐2.2g；苏氨酸盐0.4g；钙5g和总磷3g。

2)水分、粗蛋白质、钙和总磷为实测值。

5.2试验结果

由表9可知，保育猪日粮中添加抗生素和乳酸菌均能提高保育猪平均日增重，降低料重比。与对照组相比，抗生素组和乳酸菌组平均日增重分别提高8.58％和12.71％；料重比分别降低4.52％和7.34％。与抗生素组相比，乳酸菌组的平均日增重提高了3.80％，料重比降低了2.96％。干酪乳杆菌制剂的使用效果优于抗生素使用效果。

表9饲粮中添加干酪乳杆菌ZLC018冻干制剂对保育猪生产性能的影响

注：同行肩标小写字母不同者，表示差异显著(P<0.05)。

由表10可见，饲喂干酪乳杆菌降低了保育猪的死亡率和腹泻率，与对照组相比分别降低了3.33个百分点和7.5个百分点。

表10干酪乳杆菌ZLC018对保育猪死亡率和腹泻率的影响

由表11可知，与对照组相比，日粮中添加了干酪乳杆菌ZLC018冻干制剂后，保育猪粪便中的有害细菌数量大幅度下降，大肠杆菌数量下降了46.29％(P<0.05)，金黄色葡萄球菌数量下降了30.82％(P<0.05)；乳酸菌与大肠杆菌的比值提高了(P<0.05)。

表11日粮中添加干酪乳杆菌ZLC018冻干制剂对保育猪粪便中菌群的影响

注：同行肩标小写字母不同者，表示差异显著(P<0.05)。

综上所述，在保育猪饲料中添加干酪乳杆菌ZLC018冻干制剂后，猪的肠道健康了，猪的腹泻率降低了，成活率提高了；日增重提高了，料重比降低了；猪粪中的大肠杆菌数量和金黄色葡萄球菌数量显著降低，乳酸菌与大肠杆菌比值升高了。这些主要性能指标有利于保育猪的健康生长和生产效益的提高，有利于猪场养殖环境的改善。