转移性前列腺癌早期预测的分子探针、试剂盒及该分子探针的应用的制作方法

本发明涉及一种分子探针、试剂盒及该分子探针的应用，具体涉及一种转移性前列腺癌早期预测的分子探针、试剂盒及该分子探针的应用。
背景技术：
：前列腺癌(Prostatecancer,PCa)是严重威胁男性健康的恶性肿瘤之一，其发病率在欧美国家高居首位，死亡率居第二位。近年来，随着我国经济发展、人口老龄化加重和饮食结构改变，PCa的发病率和死亡率已逐年增长。2015年最新癌症统计数据显示PCa已成为泌尿男性生殖系统发病率和死亡率最高、增长率最快的恶性肿瘤，转移性前列腺癌患者5年的生存率仅34％。PCa正在加速影响着我国老年男性的生活质量和预期寿命。由于PCa迥异的生物学行为及复杂的发病机制，以术前前列腺特异性抗原(Prostate-specificantigen,PSA)、GS(GleasonScore)评分及临床TNM分期建立的PCa风险评估并不能准确反映PCa患者个体生物学信息。传统观点认为只有肿瘤突破包膜才开始向全身进展，而PCa早期就可以发生微转移。因此，寻找与PCa转移密切相关的生物标记物迫在眉睫。近年来，随着肿瘤病因学和分子生物学的研究进展，人们逐步认识到肿瘤的发生和发展是一个多通路、多环节、多层次、高度复杂但可控的级联反应过程，并与促癌基因及抑癌基因的活性密切相关。检测外周血中循环肿瘤细胞(circulatingtumorcells,CTCs)在监测肿瘤复发转移、确定肿瘤分子特征及判断预后等方面有重要应用价值。CTCs的本质是存在于外周循环的各类肿瘤细胞，由原发灶或转移灶脱落进入外周血。外周血中的CTCs会发生主动或被动的凋亡，只有小部分CTCs能存活下来进而通过血行转移的方式发展成为新的转移灶。CTCs的出现早于肿瘤转移灶出现，提示癌症转移可能由CTCs导致。但大部分CTCs在外周循环中发生凋亡，或被吞噬，只有少数发展成为转移灶。检测这部分能形成转移灶的CTCs数目在泌尿外科肿瘤治疗中有重要作用。研究发现CTCs的形成与上皮细胞-间质转化机制(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)有关。CTCs富集效果直接决定着后续检测的灵敏度，目前常规方法根据原理分为基于细胞生物化学特性的富集法和基于细胞物理学特性的富集法。基于细胞生物化学特性的富集法主要有免疫磁珠富集法(immunomagneticseparation,IMS)和粘附富集法。其中，IMS是一种高效、高灵敏度的CTCs富集方法。CTCs表面上皮粘附分子(EpCAM)能与链接有磁珠的特异性单抗相结合，使CTCs具有磁性并能滞留在磁场中。将免疫磁珠富集法与常规检测技术(如免疫细胞化学法，流式细胞术RT-PCR等)相结合，可大大提高外周血样本中CTCs的浓度从而提高检出率。IMS需借助CTC表面EpCAM的表达，从而导致该方法仅适用于有限的癌种。粘附富集法基于CTCs与捕获表面的亲和作用，捕获表面通过一定的生物化学修饰获得了与CTCs的亲和力。该方法可以在静态或者常用的连续微流控芯片模式下进行分离富集。在静态分离模式中，样本首先在捕获表面上孵育一段时间。随后，未粘附的细胞被冲洗掉，而CTCs将被吸附在捕获表面。由于转移性癌细胞更倾向于侵入骨基质等胶原性的组织，因此这个方法被用来捕获具有较高侵袭性的CTCs。基于细胞物理学特性的富集法主要有膜过滤富集法、梯度密度富集法和OncoQuick富集法。其中，膜过滤富集法的原理是基于细胞大小及机械性能进行过滤。将血标本通过5-10μm孔径的滤膜可将CTC富集。对循环肿瘤微栓子(CTM)的富集效果比基于免疫学原理的富集法有优势，但会有小部分肿瘤细胞因直径小于滤膜孔径而丢失，导致该方法的灵敏度偏低。梯度密度富集法的原理是基于血液中各种细胞密度差别，用分层液将肿瘤细胞和单核细胞与其他细胞层分离。这种方法操作简单，但该分离方法要求的血标本量较大(通常15-30ml)，且灵敏度和特异度均较低。OncoQuick富集法利用一种内置多孔屏障的50ml专用试管，在进行离心之前将15-30ml的全血平铺于多孔膜上，通过离心将肿瘤细胞从其他细胞中分离出来进而达到CTC富集的目的。该方法在分离过程中有可能丢失少量细胞，而且一旦血液抗凝不完全则存在于微小血凝块中的肿瘤细胞可能沉降至梯度密度液的底部。目前，前列腺癌的检测方法主要有影像学检查法、血清学检测法和病理活检监测。用于前列腺癌诊断的影像学检查主要有超声、MR和PET-CT为基础的扩展技术。超声技术是前列腺癌诊断最古老最广泛应用的技术。B超能够较好区分前列腺区带，因为B超下外周带回声比中央带和移行带较强。黑白超声技术能良好地分辨低回声病灶，经直肠黑白超声技术随机系统穿刺联合低回声病灶穿刺奠定了前列腺穿刺诊断的基础(HodgeKK,McnealJE,StameyTA.Ultrasoundguidedtransrectalcorebiopsiesofthepalpablyabnormalprostate.[J].JUrol,1989,142(1):66-70；HodgeKK,McNealJE,TerrisMK,StameyTA.Randomsystematicversusdirectedultrasoundguidedtransrectalcorebiopsiesoftheprostate.[J]JUrol.1989；142(1):71–74.)。但是B超和黑白超声技术中一些良性疾病如前列腺炎、前列腺增生也会显示为低回声病灶。早期前列腺癌周围大量的良性腺体回声掩盖会导致其显示为等回声而难以检测出来(UkimuraO,FaberK,GillIS.Intraprostatictargeting.CurrOpinUrol.2012；22(2):97–103.)。据统计，60％的超声病灶是良性病变，21-47％的前列腺癌在初次穿刺活检中漏诊(LochT,EppelmannU,LehmannJ,WullichB,LochA,StockleM.Transrectalultrasoundguidedbiopsyoftheprostate:randomsextantversusbiopsiesofsono-morphologicallysuspiciouslesions.WorldJUrol.2004；22(5):357–360；SinghH,CantoEI,ShariatSF,etal.Predictorsofprostatecancerafterinitialnegativesystematic12corebiopsy.JUrol.2004；171(5):1850–1854；TairaAV,MerrickGS,GalbreathRW,etal.Performanceoftransperinealtemplate-guidedmappingbiopsyindetectingprostatecancerintheinitialandrepeatbiopsysetting.ProstateCancerProstaticDis.2010；13(1):71–77.)。此外，随机系统穿刺方法既不是肿瘤特异性也不是患者个性化的诊断方法，有时诊断出临床无意义的前列腺癌，有时又低估了前列腺癌的Gleason评分(TairaAV,MerrickGS,GalbreathRW,etal.Performanceoftransperinealtemplate-guidedmappingbiopsyindetectingprostatecancerintheinitialandrepeatbiopsysetting.ProstateCancerProstaticDis.2010；13(1):71–77；ZaytounOM,MoussaAS,GaoT,FareedK,JonesJS.Ofcebasedtransrectalsaturationbiopsyimprovesprostatecancerdetectioncomparedtoextendedbiopsyintherepeatbiopsypopulation.JUrol.2011；186(3):850–854；IsariyawongseBK,SunL,BanezLL,etal.SignifcantdiscrepanciesbetweendiagnosticandpathologicGleasonsumsinprostatecancer:thepredictiveroleofageandprostate-specifcantigen.Urology.2008；72(4):882–886.)。多普勒超声能够检测血流信号，而肿瘤生长过程为满足营养需要常常发生局部血流增加。但是其局限性在于，多普勒超声对于直径<0.1mm血管分辨率极为有限(UkimuraO,FaberK,GillIS.Intraprostatictargeting.CurrOpinUrol.2012；22(2):97–103.),而肿瘤生长恰恰以直径10–50μm的新生血管为主。因此，多普勒超声所检测的也是较晚期Gleason级别较高的前列腺癌。超声造影能够检测肿瘤进展过程中血管生成和新生血管紊乱引起的微血管密度变化(RussoG,MischiM,ScheepensW,delaRosetteJJ,WijkstraH.Angiogenesisinprostatecancer:onset,progressionandimaging.BJUInt.2012；110(11ptC):E794–E808.)，但对大血管的分辨率存在局限。多参数核磁共振(mpMRI)包含解剖序列T2加权像和至少两个功能序列弥散加权像和动态造影增强像。mpMRI具有较好的分辨率，能够分辨组织差异识别前列腺癌，在前列腺癌初诊、复发、分期及转移监测发挥重要作用。但其昂贵的费用极大限制了其广泛应用，而且也不能进行实时显像，技术操作也需要大量的培训学习。mpMRI融合超声技术结合了两者的优点，在前列腺癌诊断上更加精确，但增加了mpMRI的费用，其培训难度较mpMRI亦更加困难。因此，也不可能实现大规模应用。基于PET的影像技术，目前有18F-FDG代表的代谢靶向PET，还有18-FACBC代表的增殖靶向PET，PSMA代表的报告子靶向PET。PET用于前列腺癌初诊较少，临床上主要用于分期、生化复发和局部复发以及转移灶检测。根据靶向指标的不同，PET可以精确到每个腺体信息进而明确分期，但其缺点在于费用昂贵和辐射暴露。血清学检测应用于前列腺癌诊断、转移预测的研究报道众多。PSA是研究报道最多的生物标记物，其除作为常规的前列腺癌筛查分子以外，还具有治疗评价和预后判断的重要作用(SmithMR,KabbinavarF,SaadF,etal.Naturalhistoryofrisingserumprostate-specifcantigeninmenwithcastratenonmetastaticprostatecancer.JClinOncol.2005；23(13):2918–2925；Acontemporaryprognosticnomogramformenwithhormone-refractorymetastaticprostatecancer:aTAX327studyanalysis.ClinCancerRes.2007；13(21):6396–6403.)。治疗后PSA水平与疾病总体生存密切相关。基础PSA和动态PSA变化如PSA倍增时间、PSA增速等与前列腺癌复发和转移密切相关。(SmithMR,KabbinavarF,SaadF,etal.Naturalhistoryofrisingserumprostate-specifcantigeninmenwithcastratenonmetastaticprostatecancer.JClinOncol.2005；23(13):2918–2925；D’AmicoAV,CoteK,LofredoM,RenshawAA,SchultzD.Determinantsofprostatecancer-specifcsurvivalafterradiationtherapyforpatientswithclinicallylocalizedprostatecancer.JClinOncol.2002；20(23):4567–4573；PoundCR,PartinAW,EisenbergerMA,ChanDW,PearsonJD,WalshPC.NaturalhistoryofprogressionafterPSAelevationfollowingradicalprostatec-tomy.JAMA.1999；281(17):1591–1597；VickersAJ,BrewsterSF.PSAvelocityanddoublingtimeindiagnosisandprog-nosisofprostatecancer.BrJMedSurgUrol.2012；5(4):162–168；ChunFK,BrigantiA,GallinaA,etal.Prostate-specifcantigenimprovestheabilityofclinicalstageandbiopsyGleasonsumtopredictthepathologicstageatradicalprostatectomyinthenewmillennium.EurUrol.2007；52(4):1067–1074；SchellhammerPF,ChodakG,WhitmoreJB,SimsR,FrohlichMW,KantofPW.Lowerbaselineprostate-specifcantigenisassociatedwithagreateroverallsurvivalbeneftfromsipuleucel-TintheImmunotherapyforProstateAdenocarcinomaTreatment(IMPACT)trial.Urology.2013；81(6):1297–1302)。但是PSA只具有器官特异性，不具有肿瘤特异性，不少良性疾病也能引起PSA的动态变化。此外，不少研究报道PCA3和ERG也与前列腺癌的发生进展密切相关，监测其血清表达水平变化能够预测前列腺癌的复发、转移。然而，这些血清学标志物的特异性和/或敏感性并不太理想。主要原因可能在于现有的血清肿瘤标志物在前列腺癌的转移中并不是关键的驱动基因。肿瘤的转移是一个多步骤、涉及多种信号通路的生物学过程，目前研究的肿瘤血清标志物可能仅限于在某一步骤或某一通路发挥作用，但在多信号通路网络的调控作用未得而知。病理活检监测前列腺癌转移的缺点则在于活检创伤大，在深部病灶穿刺不方便。活检组织的穿刺获取通常需要影像学手段辅助，因此穿刺也仅限于影像学能检测的病灶，也就是说穿刺并不能对早期微转移做出诊断预测。而且，活检具备一定的感染、出血等并发症风险。据报道，2.67％的前列腺穿刺患者因穿刺严重的相关并发症住院治疗(GaylisF,NasseriR,FinkL,etal.ProstateBiopsyComplications:ADualAnalysis.[J].Urology,2016,93:135-140.)。上述前列腺癌的检测方法存在如下缺陷：常见的影像学手段，通过获取解剖学信息及代谢信息，对肿瘤的大小(>0.2cm的肿瘤病灶)以及肿瘤的代谢进行评估，进而判断肿瘤的现状，然后，这往往需要等到肿瘤具备一定的体积才能够被发现，因此，存在一定的滞后性，除此以外，因为辐射的安全性问题，也不能够长期多次使用。而血清学方面，它通过肿瘤蛋白标志物来反映肿瘤的状态，所以特异性和敏感性还较低。至于病理学手段，能够准确的获取肿瘤的基因信息，然后，它依托于有创的肿瘤组织样本，因为对于晚期没有办法获得组织的样本的患者来说存在一定的限制性。因此，有必要寻找前列腺癌的新检测方法。目前已存在一些关于CRMPs的研究。CRMPs家族有CRMP1-5五个成员。文献报道在肺癌细胞的一些亚系中CRMP1低表达提示疾病预后差，与疾病进展(P＝0.010)、淋巴结转移(P＝0.043)、术后早期复发(P＝0.030)、生存时间短(P＝0.016)有关。此后，他又发现了CRMP-1的新异构体LCRMP-1。序列分析显示其外显子1的氮端序列与CRMP-1不同，但外显子2-14的碳端序列却完全相同。进一步的研究发现LCRMP-1表达也与非小细胞肺癌患者的临床结局和淋巴结转移相关。LCRMP-1通过增强伪足形成促进肿瘤侵袭性的能力可被CRMP-1拮抗，这一现象提示LCRMP-1和CRMP-1在调节癌症细胞侵袭和转移中具有相反的功能。一方面，LCRMP-1增强伪足形成，稳定肌动蛋白，进而增强细胞迁移，侵袭力。这一过程需要LCRMP-1高度保守的氮端区域稳定及WAVE-1参与。它还可能通过作用于Rho家族蛋白Cdc42。Cdc42蛋白与肌动蛋白重组相关。另一方面，CRMP1通过打断LCRMP1和WAVE-1相互作用而抑制肿瘤细胞转移(PanSH,ChaoYC,ChenHY,etal.Longformcollapsinresponsemediatorprotein-1(LCRMP-1)expressionisassociatedwithclinicaloutcomeandlymphnodemetastasisinnon-smallcelllungcancerpatients.[J].LungCancer,2010,67(1):93-100；ShihJY,YangSC,HongTM,etal.Collapsinresponsemediatorprotein-1andtheinvasionandmetastasisofcancercells.[J].JNatlCancerInst,2001,93(18):1392-1400；PanSH,ChaoYC,HungPF,etal.TheabilityofLCRMP-1topromotecancerinvasionbyenhancingfilopodiaformationisantagonizedbyCRMP-1.[J].JClinInvest,2011,121(8):3189-3205.)。Hiroshima等(HiroshimaY,NakamuraF,MiyamotoH,etal.CollapsinResponseMediatorProtein4ExpressionisAssociatedwithLiverMetastasisandPoorSurvivalinPancreaticCancer.[J].AnnSurgOncol,2013,Suppl3:S369-78.)的研究发现，长亚型CRMP4的表达增加与胰腺癌肝转移较差的临床预后有关，表现为促癌基因。QuinnCC等(QuinnCC,ChenE,KinjoTG,etal.TUC-4b,anovelTUCfamilyvariant,regulatesneuriteoutgrowthandassociateswithvesiclesinthegrowthcone.[J].JNeurosci,2003,23(7):2815-2823.)的研究也发现，75kDa的CRMP4的长亚型(TUC-4BCRMP4b)和短亚型CRMP4a(TUC-4A)在轴突生长中也具有相反功能。因此，一个可能的解释就是CRMP4具有剪接异构体，在胰腺癌肝转移过程中体现了CRMP4b长亚型的特性。LaureDuplan等(DuplanL,BernardN,CasseronW.etal.CollapsinResponseMediatorProtein4a(CRMP4a)IsUpregulatedinMotoneuronsofMutantSOD1MiceandCanTriggerMotoneuronAxonalDegenerationandCellDeath.JNeurosci.2010,13；30(2):785-96.)也通过蛋白质组学报道CRMP4存在CRMP4a和CRMP4b两种亚型。4a型在氨基酸N末端13aa区域与4b氨基酸N末端126aa区域不同编码，属于链异构。并证实CRMP4a能正向调节并促发小鼠突变型SOD1运动神经元轴突变性。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种具有较高准确性、敏感性和特异性的转移性前列腺癌早期预测的分子探针和试剂盒。本发明的另一目的在于提供上述转移性前列腺癌早期预测的分子探针的应用。为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种转移性前列腺癌早期预测的分子探针，其包含LCRMP4探针，所述LCRMP4探针的序列如SEQIDNO:8所示。LCRMP4是塌陷反应介导蛋白4(collaspsinresponsemediatorprotein4,CRMP4)的异构体。LCRMP4的N端127个氨基酸不同于CRMP4，而CRMP4除N端13个氨基酸外，14-570aa与LCRMP4的128-684aa完全相同。LCRMP4探针能够特异性的区别CRMP4长短链RNA异构体，特异性检测编码LCRMP4蛋白的mRNA。我们的研究显示，CRMP4在正常前列腺组织和局限性PCa组织中表达较高，且两组间无表达差异，在转移性PCa组织中表达明显降低，体外侵袭实验证实CRMP4转染后能够抑制PCa细胞的侵袭能力，并且在临床组织样本中证实CRMP4在转录和蛋白表达水平的下调，提示CRMP4可能为PCa转移抑制基因。我们进一步研究发现，CRMP4的异构体LCRMP4在前列腺癌中发挥与CRMP4相反的肿瘤生物学功能，即LCRMP4促进前列腺癌生长及转移。在前列腺癌细胞中过表达LCRMP4明显促进细胞增殖生长，并且能够维持激素非依赖性的前列腺癌LNCaP细胞在去势状态下显著增长。此外，细胞迁移和侵袭实验显示过表达LCRMP4明显促进前列腺癌细胞的迁移侵袭能力。进一步研究发现，LCRMP4促进前列腺癌生长和转移的潜在机制是调控经典的β-catenin信号通路，并且这种调控作用不依赖于WNT配体的激活。此外，AR受体为前列腺癌发生、进展的重要蛋白，LCRMP4能够促进AR向细胞核内移位进而促进AR靶基因的转录表达。裸鼠动物实验也验证了LCRMP4促进前列腺癌生长和转移的作用。LCRMP4是与前列腺癌转移密切相关的基因，其表达量的高低与前列腺癌的分级及转移程度密切相关。将其作为转移性前列腺癌早期预测的探针时检测结果具有较高准确性、敏感性和特异性。作为本发明所述转移性前列腺癌早期预测的分子探针的优选实施方式，所述分子探针还包含上皮标志物、间质标志物和CD45探针；所述上皮标志物由EpCAM探针、CK8探针、CK18探针和CK19探针组成，所述间质标志物由Vimentin探针和Twist探针组成；其中，所述EpCAM探针的序列如SEQIDNO:1所示，CK8探针的序列如SEQIDNO:2所示，CK18探针的序列如SEQIDNO:3所示，CK19探针的序列如SEQIDNO:4所示，Vimentin探针的序列如SEQIDNO:5所示，Twist探针的序列如SEQIDNO:6所示，CD45探针的序列如SEQIDNO:7所示。Twist是一种高度保守的碱性螺旋.环.螺旋转录因子家族重要成员，在动物与人类的胚胎发育中起关键调控作用。在动物胚胎发育过程中，Twist作为转录因子在诱导细胞移动及组织塑形中起主要作用。最近研究表明，Twist在表皮一间叶细胞转换调控中起着关键作用，Twist过表达在肿瘤的发生、侵袭转移、血管生成与肿瘤细胞耐药中发挥重要作用。Twist能通过多种途径引起肿瘤的发生，目前已在多种人类上皮来源肿瘤中发现Twist表达增高，并与患者预后关系密切。另外，本发明还提供了一种转移性前列腺癌早期预测的试剂盒，为实现此目的，本发明采取的技术方案为：一种转移性前列腺癌早期预测的试剂盒，其包含上述转移性前列腺癌早期预测的分子探针。LCRMP4在前列腺癌中发挥促癌作用并与前列腺癌转移密切相关，将其用于转移性前列腺癌早期预测的试剂盒中，得到的试剂盒也可以对转移性前列腺癌进行早期预测，且结果具有较高准确性、敏感性和特异性。作为本发明所述转移性前列腺癌早期预测的试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒为原位杂交检测试剂盒，所述LCRMP4探针、EpCAM探针、CK8探针、CK18探针、CK19探针、Vimentin探针、Twist探针和CD45探针均带有标记物。更优选地，所述试剂盒为RNA原位杂交检测试剂盒。在原位杂交检测试剂盒中，上述探针均用作杂交探针。RNA原位杂交技术是运用cRNA或寡核苷酸等探针检测细胞和组织内RNA表达的一种原位杂交技术。其基本原理是：在细胞或组织结构保持不变的条件下，用标记的已知的RNA核苷酸片段，按核酸杂交中碱基配对原则，与待测细胞或组织中相应的基因片段相结合(杂交)，所形成的杂交体(Hybrids)经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的mRNA、rRNA和tRNA分子。RNA原位杂交技术应用的领域已远超出DNA原位杂交技术。尤其在基因分析和诊断方面能作定性、定位和定量分析，已成为最有效的分子病理学技术，同时在分析低丰度和罕见的mRNA表达方面具有优势。利用CTCs的RNA原位杂交技术检测LCRMP4表达水平，能够准确预测前列腺癌患者转移，其敏感性达95.5％，特异性达91.7％。能够以较少创伤的CTCs液体活检技术早期预测前列腺癌转移；并且该方法采用的是抽血检测，创伤小并发症少，能够检测临床影像学所不能检测出来的肿瘤微转移。作为本发明所述转移性前列腺癌早期预测的试剂盒的优选实施方式，所述标记物为放射性核素或非放射性标记物；更优选地，所述非放射性标记物为生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素。标记物可按照本
技术领域：
的常规方式进行选择，当以荧光素作为标记物时，上皮标志物、间质标志物、CD45探针和LCRMP4探针上所带的是不同颜色的荧光标记。作为本发明所述转移性前列腺癌早期预测的试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒还包含透化剂、消化液、杂交缓冲溶液、预扩增工作液、扩增工作液、显色液和复染液。作为本发明所述转移性前列腺癌早期预测的试剂盒的更优选实施方式，所述消化液由PBS(磷酸盐缓冲液)和消化酶组成；所述杂交缓冲溶液包含曲拉通和甲酰胺；所述预扩增工作液由扩增缓冲溶液和预扩增探针组成；所述扩增工作液由扩增液和扩增探针组成；所述显色液由显色缓冲液和显色探针组成；所述复染液为4',6-二脒基-2-苯基吲哚。作为本发明所述转移性前列腺癌早期预测的试剂盒的优选实施方式，所述预扩增探针由SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11和SEQIDNO:8所示序列组成；所述扩增探针由SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14和SEQIDNO:8所示序列组成；所述显色探针由SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17和SEQIDNO:8所示序列组成。其中，SEQIDNO:9、SEQIDNO:12、SEQIDNO:15为上皮标志物(EpCAM探针、CK8探针、CK18探针和CK19探针)的DNA探针，SEQIDNO:10、SEQIDNO:13和SEQIDNO:16为间质标志物(Vimentin探针和Twist探针)的DNA探针，SEQIDNO:11、SEQIDNO:14和SEQIDNO:17为CD45的DNA探针。作为本发明所述转移性前列腺癌早期预测的试剂盒的优选实施方式，所述扩增缓冲溶液、扩增液和显色缓冲液均包含下述组分：马血清30％(w/w)，1.5％十二烷基硫酸钠(w/w)，3mMTris-HCl，所述Tris-HCl的pH值为8.0。作为本发明所述转移性前列腺癌早期预测的试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒还包含洗涤液。本发明采用原位杂交的方法对转移性前列腺癌早期预测，采用原位杂交的方法时，上述试剂盒具体的使用方法为：(1)采集外周血，进行红细胞裂解，然后离心和固定，最后进行脱水，得到待测样品；(2)将所得待测样品进行亲水及透化处理，再进行消化，然后与探针杂交、扩增；(3)显色及镜检。最后，本发明还提供了上述分子探针在制备用于转移性前列腺癌早期预测的试剂盒中的应用。作为本发明所述应用的优选实施方式，所述试剂盒为原位杂交检测试剂盒。与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供了一种新的转移性前列腺癌早期预测的探针组和试剂盒，该探针组和试剂盒对转移性前列腺癌进行早期预测时，准确性、敏感性和特异性均较高。本发明转移性前列腺癌早期预测的试剂盒可为原位杂交检测试剂盒，尤其是RNA原位杂交检测试剂盒。本发明通过CTCs检测技术(Surexam益善)，采用分子病理学中液态活检方式，动态监测肿瘤患者血液中CTC及其分型；设计与转移性PCa密切相关的LCRMP4基因检测探针，采用多重RNA原位杂交检测技术检测CTCs中LCRMP4基因的表达，统计分析建立术前预测PCa患者是否存在转移。利用CTCs的RNA原位杂交技术检测LCRMP4表达水平，能够准确预测前列腺癌患者转移，其敏感性达95.5％，特异性达91.7％。能够以较少创伤的CTCs液体活检技术早期预测前列腺癌转移。此外，本发明还具有如下优点：1.本发明检测样本为患者血液，可根据患者病情治疗状况多次采集标本，避免了传统的组织穿刺，创伤小，并发症少，并且本发明的检测方法微创、安全、动态监测，能够把临床影像学隐匿性的转移检测出来。2.本发明的检测方法自动化、方便快捷：CTC提取采用仪器自动化，能够批量操作检测。附图说明图1为利用CTCs的RNA原位杂交技术检测LCRMP4表达水平的流程图；图2为CTCs鉴定及分型方法检测结果图；图3为LCRMP4在CTCs中表达的结果图；图4为CTCs行RNA原位杂交检测预测前列腺癌(淋巴结/骨)转移ROC分析结果图；图5为CTCs行RNA原位杂交检测预测前列腺癌淋巴转移ROC分析分析结果图；图6为CTCs行RNA原位杂交检测预测前列腺癌骨转移ROC分析分析结果图。具体实施方式为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将以RNA原位杂交检测CTCs中LCRMP4基因的表达，统计分析术前预测PCa患者是否存在转移为例，并结合附图对本发明作进一步说明。下述实施例中，LCRMP4探针用于原位杂交检测中，但需指出的是，LCRMP4探针也可用于其他转移性前列腺癌早期预测的试剂盒中；同时，在下述实施例中，采用的是原位荧光杂交的方法，故杂交探针上的标记物为荧光素；但标记物并不限于荧光素，我们可以根据实际需要，根据采用的检测选择适合的标记物。实施例1本发明转移性前列腺癌早期预测的探针组的一种实施例，本实施例所述转移性前列腺癌早期预测的探针组包含上皮标志物、间质标志物、CD45探针和LCRMP4探针；所述上皮标志物由EpCAM探针、CK8探针、CK18探针和CK19探针组成，所述间质标志物由Vimentin探针和Twist探针组成；其中，所述EpCAM探针的序列如SEQIDNO:1所示，CK8探针的序列如SEQIDNO:2所示，CK18探针的序列如SEQIDNO:3所示，CK19探针的序列如SEQIDNO:4所示，Vimentin探针的序列如SEQIDNO:5所示，Twist探针的序列如SEQIDNO:6所示，CD45探针的序列如SEQIDNO:7所示，LCRMP4探针的序列如SEQIDNO:8所示。所述探针的具体序列如下表1所示。表1实施例2本发明转移性前列腺癌早期预测的试剂盒的一种实施例，本实施例所述转移性前列腺癌早期预测的试剂盒为原位杂交检测试剂盒，该试剂盒包含：杂交探针、透化剂、消化液、杂交缓冲溶液、预扩增工作液、扩增工作液、显色液、复染液和洗涤液；其中，所述杂交探针为实施例1所述探针组，所述LCRMP4探针、EpCAM探针、CK8探针、CK18探针、CK19探针、Vimentin探针、Twist探针和CD45探针上均带有标记物；上皮标志物(EpCAM探针、CK8探针、CK18探针和CK19探针)带红色荧光标记；间质标志物(Vimentin探针和Twist探针)带绿色荧光标记；LCRMP4探针带紫色荧光标记；CD45探针带蓝色荧光标记。所述消化液由PBS和消化酶组成；所述杂交缓冲溶液由以下成分组成：10％硫酸葡聚糖、10mmol/LNaCl、50％甲酰胺、0.1％焦磷酸钠、0.2％聚乙烯基吡咯啉、0.2％FICOLL、5mmol/LEDTA二钠、0.1％TritonX-100、50mmol/LTris-HCl；所述预扩增工作液由扩增缓冲溶液和预扩增探针组成；所述扩增工作液由扩增液和扩增探针组成，所述显色液由显色缓冲液和显色探针组成；其中，所述预扩增探针由SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11和SEQIDNO:8所示序列组成；所述扩增探针由SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14和SEQIDNO:8所示序列组成；所述显色探针由SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17和SEQIDNO:8所示序列组成；所述扩增缓冲溶液、扩增液和显色缓冲液均包含下述组分：马血清30％(w/w)，十二烷基硫酸钠1.5％(w/w)，3mMTris-HCl，所述Tris-HCl的pH值为8.0；所述SEQIDNO:9～SEQIDNO:17的具体序列见表2。所述复染液为4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)。表2SEQIDNO:9CGCAGCCTCAGCCSEQIDNO:10GACGGTCGGCGTTSEQIDNO:11GCGCGCTGTAGGGSEQIDNO:12CCCAGACCCTACCSEQIDNO:13GTCACCGCTCCACSEQIDNO:14AGGCGAGGGGAGASEQIDNO:15CTACAAACAAACAATATTSEQIDNO:16CTTCTCAATAACTAACATSEQIDNO:17CTTTATACCTTTCTTTCA实施例3本实施例采用实施例2所述试剂盒、利用CTCs的RNA原位杂交技术检测LCRMP4表达水平，以对转移性前列腺癌进行预测。本实施例利用CTCs的RNA原位杂交技术检测LCRMP4表达水平的流程如图1所示。的具体步骤如下：一、临床样本收集及处理a、采集外周血：1、用EDTA抗凝采血管采集5mL外周血，每位患者采集2管(公10mL)；2、采血后颠倒采血管5次以上充分混匀后于4℃保存，保存时间不超过4小时；3、记录患者对应编号，用连通器将采血管内的血液转入样本保存管(含红细胞裂解液)。b、红细胞裂解：1、将样本保存管上下颠倒混匀10次，室温(15-30℃)静置30min裂解，室温低于15℃时裂解时间延长至1小时；2、室温裂解的红细胞如不能及时处理，可保存于4℃，保存时间不超过8小时。c、离心和固定：1、将样本以1850rpm(600×g)离心5min,弃上清；2、依次加入4mLPBS和1mL固定剂(用于样本预处理的固定)，涡旋混匀，室温静置8min。d、抽滤再固定：1、检查过滤器是否完好，是否有滤膜，将过滤器固定到真空歧板上；2、打开真空泵，使负压上升至-0.06MPa(此步骤在样本固定期间完成)；3、将样本保存管中的液体转移至过滤器中，打开二通阀门，将样本抽滤至过滤器中的滤膜上，完成过滤后关闭阀门，过滤器中加入1mL样本固定液，固定1h。e、脱水及保存：依次用1mL50％脱水剂、100％脱水剂浸泡处理，每次浸泡2min，处理结束后，将样本放入-20℃冰箱可保存两周，或放入-80℃冰箱可保存6个月。二、CTCs样本分型检测a、亲水及透化：1、依次用400uL100％乙醇、70％乙醇、50％乙醇浸泡处理，各2min；2、加入1-2mLPBS洗涤三次，每次浸泡2min；3、将滤膜倒扣在100uL的透化剂上，室温孵育5min；4、加入1-2mLPBS洗涤三次，每次浸泡2min。b、消化：1、将滤膜倒扣在100uL的消化液(590uLPBS+10uL消化酶)上，室温孵育1h；2、加入1-2mLPBS洗涤三次，每次浸泡2min。c、探针杂交：1、将滤膜倒扣在100uL的杂交液(84uL杂交缓冲液+16uL杂交探针)上，40℃孵育3h；2、加入1-2mL洗涤液(即探针洗涤液)洗涤三次，每次浸泡2min。d、扩增：1、将滤膜倒扣在预扩增工作液(90uL扩增缓冲液+10uL预扩增探针)上，40℃孵育30min；2、加入1-2mL洗涤液(即探针洗涤液)洗涤三次，每次浸泡2min；3、将滤膜倒扣在100uL的扩增工作液(90uL扩增液+10uL扩增探针)上，40℃孵育30min；2、加入1-2mL洗涤液(即探针洗涤液)洗涤三次，每次浸泡2min。e、显色及镜检：1、将滤膜倒扣在100uL的显色液(90uL显色缓冲液+10uL显色探针上，40℃孵育30min；2、加入1-2mL洗涤液(即探针洗涤液)洗涤三次，每次浸泡2min；3、滤膜正面朝上置于载玻片上，用刀片沿铁圈内环滤膜割下。4、加10uL复染液，盖上18mm×18mm的盖拨片，直接镜检或放入-20℃冰箱保存。三、CTCs镜检流程图a、开机：开启电脑；开启显微镜开关(显微镜左下方的开关)；开启荧光电源；启动软件(左键双击桌面“Metafer4”软件)b、20倍扫描：左键单击setup，选择surexam01-CTC-20×程序拍摄；拍摄完成后选择1和3区域的细胞，“RejectUndefined”去除未选择的细胞。(每张片约5分钟)c、40倍DAPI拍摄：左键单击setup，选择surexam01-CTC-40×-DAPI程序拍摄；40倍DAPI拍摄完成后选择核纹清晰的细胞，“RejectUndefined”去除未选择的细胞。(每张片约2分钟)d、40倍荧光信号拍摄：左键单击setup，选择surexam01-CTC-40×-4F程序拍摄；(每个细胞约40秒)e、图像调整：在Review软件中打开拍摄的结果，右键点击细胞，在Colors选项中调整细胞亮度、对比度。f、结果判定：在CTCs镜检结果判定单上进行结果判定，CTCs判断标准：1、细胞核清晰且有核纹；2、红色信号点或绿色信号点大于或等于7个，且为白色信号点少于7个。g、图像输出：通过点击ExportCellGallery，分别输出上皮型、混合型、间质型及LCRMP4在各型CTCs中表达的图片。CTCs鉴定及分型方法检测结果如图2所示。图2中，DAPI表示4',6-二脒基-2-苯基吲哚；Emarker表示上皮标志物，由EpCAM探针、CK8探针、CK18探针和CK19探针组成；Mmarker表示间质标志物，由Vimentin探针和Twist探针组成；CD45为白细胞标志物。h、结果分析：根据检测结果中CTCs数量及类型，绘制CTCs数量类型变化柱状图，统计分析LCRMP4在各型CTC中表达情况，计算出LCRMP4表达信号数。收集临床患者信息，通过ROC曲线分析CTCs中LCRMP4表达与转移之间的关系。LCRMP4在CTCs中表达的结果如图3所示。图3中，A表示LCRMP4无表达，B和C表示LCRMP4表达(紫色)。CTCs行RNA原位杂交检测预测前列腺癌(淋巴结/骨)转移ROC分析结果如图4所示；CTCs行RNA原位杂交检测预测前列腺癌淋巴转移ROC分析分析结果如图5所示；CTCs行RNA原位杂交检测预测前列腺癌骨转移ROC分析分析结果如图6所示。由图4可见，RNA原位杂交荧光数预测前列腺癌(淋巴结/骨)转移阀值0时敏感性95.5％,特异性91.7％；由图5可见，RNA原位杂交荧光数预测前列腺癌淋巴结转移阀值0时敏感性83.3％,特异性91.7％；由图6可见，RNA原位杂交荧光数预测前列腺癌骨转移阀值5时敏感性80％,特异性94.7％。最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。当前第1页1 2 3