一株同时降解精氨酸和尿素的发酵乳杆菌的制作方法

本发明涉及一株同时降解精氨酸和尿素的发酵乳杆菌，属于微生物技术领域。

背景技术：

氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate，EC)是一种2A类致癌物，被认为是食品中继黄曲霉毒素之后的又一重要污染物。很多研究者在许多酒饮料和食品中检测到了氨基甲酸乙酯的存在。自此，发酵食品中氨基甲酸乙酯的含量受到广泛关注。已有报道检测了不同香型成品白酒中EC的含量，结果显示白酒中EC平均含量约为100μg·L^-1，低于150μg·L^-1的国际限量标准。其中，清香型、酱香型、药香型及特香型白酒中EC含量较低，而浓香型、芝麻香型、凤香型等白酒中EC含量偏高。

已有报道显示尿素与乙醇反应可以生成EC；同时发现葡萄汁发酵过程中EC的主要来源是由精氨酸分解而来的尿素。范文来、徐岩等也发现酒醅中尿素和EC的变化趋势类似，二者之间具有一定的相互关系。

对发酵食品中乳酸菌的精氨酸代谢途径研究，发现了乳酸菌的精氨酸脱亚胺途径(arginine deiminasepathway，简称ADI途径)，如下所示。最近，国外许多研究者对葡萄酒MLB的编码ADI途径酶的基因(编码ADI、OTC、CK的基因分别为arcA、arcB、arcC)进行了克隆、测序和表达研究。利用arc基因簇的简并引物合成的特异性标记探针与MLB的基因进行杂交,检测到arc基因簇的菌株能降解精氨酸，而缺少arc基因簇的菌株不能降解精氨酸。

L-Arginine+H₂O→L-citrulline+NH₃(ADI)

L-Citrulline+Pi→carbamyl phosphate+L-Ornithine(OTC)

Carbamyl phosphate+ADP→ATP+NH₃+CO₂(CK)

Ough等研究了精氨酸、瓜氨酸、氨、尿素和谷氨酸在葡萄酒发酵过程中对氨基甲酸乙酯形成方面的影响，发现由氨甲酰磷酸形成的EC含量很少，大部分EC是由精氨酸分解产生的尿素形成的，因此认为尿素是形成氨基甲酸乙酯的主要前体物质。Wang等的研究表明相同条件下，相同时间内同浓度尿素比瓜氨酸生成更多EC，且随着发酵时间延长，这种差异更大。

采用MiSeq测序技术和Real-time PCR方法研究酱香型白酒发酵中乳酸菌群落结构组成及变化规律。研究表明乳酸菌是白酒发酵过程中的优势细菌。共得到8个乳酸菌属，包含31个乳酸菌种，其中22个属于乳杆菌属。发酵酒醅中的乳酸菌群结构中乳杆菌属的比例达到了90％以上，甚至在发酵中后期尤其是中下层酒醅中超过了99％。乳酸菌可以直接贡献乳酸、提供白酒中乳酸乙酯的主要前体。此外，乳酸菌的抑制作用可防止微生物过量生长，有助于稳定酿造微生物区系平衡。然而，针对国内对白酒中乳酸菌的研究还仅限于分离鉴定到单菌种、单菌种纯培养条件下的发酵特性研究等，并未有关于乳酸菌在发酵过程中对食品安全作用的更深入研究。

因此，获取能同时降解精氨酸和尿素的乳酸菌，对于以乳酸菌作为主要功能微生物的发酵食品的生产就显得尤为重要，对于食品安全具有重要贡献。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明提供了一株能够同时高效降解精氨酸和尿素的发酵乳杆菌。

所述发酵乳杆菌，已于2016年06月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.12716，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

所述发酵乳杆菌CGMCC NO.12716是从白酒酒醅中筛选得到的。

所述发酵乳杆菌CGMCC NO.12716具有如下特性：

(1)本发明的发酵乳杆菌在高粱汁培养基中对尿素的降解能力高达1.96mmol·L^-1；

(2)本发明的发酵乳杆菌在高粱汁培养基中对精氨酸降解能力高达0.86mmol·L^-1且仅生成极少量的尿素；

(3)代谢物中酸类、醇类、酮类、酚类物质的种类丰富；其中双乙酰、3-羟基-2-丁酮、2-甲氧基苯酚的含量均大于30μg·L^-1，而双乙酰、3-羟基-2-丁酮、2-甲氧基苯酚在白酒呈香中发挥一定的作用；其中乙酸、丁酸、己酸、辛酸、2-壬醇和2-十一醇的含量均大于50μg·L^-1，而这些饱和脂肪酸和饱和脂肪醇作为重要的风味化合物都曾在白酒中检测到。

(4)CGMCC NO.12716于MRS培养基、30℃厌氧发酵2d后进入稳定期，菌体浓度可达OD＝2.4，发酵液pH 4.3左右，乳酸含量为12g/L左右；发酵3d的乙酸产量可达6g/L。

本发明的第二个目的是提供含有所述CGMCC NO.12716菌株的微生物菌剂。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂含有CGMCC NO.12716菌体的活细胞、冷冻干燥得到的CGMCC NO.12716干菌体、固定化的CGMCC NO.12716细胞、CGMCCNO.12716的液体菌剂、CGMCC NO.12716的固体菌剂，或者以其他任何形式存在的CGMCCNO.12716菌株。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂中还含有任何可以应用于食品或者食品制备的任意种属的菌株，比如地衣芽孢杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌等等。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂中还含有任意能用于食品的载体。

本发明的第三个目的是提供所述微生物菌剂在食品技术领域的应用，尤其是应用于发酵食品技术领域。

本发明的第四个目的是提供所述CGMCC NO.12716菌株的应用，是应用于食品技术领域，尤其是发酵食品技术领域。

在本发明的一种实施方式中，所述应用，是应用于酿造酒、蒸馏酒等方面，比如白酒、葡萄酒、黄酒、果酒方面。

在本发明的一种实施方式中，所述应用，是将CGMCC NO.12716菌株添加到白酒、葡萄酒、黄酒或者果酒酿造过程中。

本发明的有益效果：

本发明的发酵乳杆菌，在高粱汁培养基中对尿素的降解能力高达1.96mmol·L^-1；对精氨酸降解能力高达0.86mmol·L^-1且仅生成极少量的尿素；是目前能同时降解精氨酸和尿素且降解效果最好的发酵乳杆菌。同时还能够代谢酸类、醇类、酮类、酚类等物质，为白酒提供重要的风味化合物；其于MRS培养基、30℃厌氧发酵2d后进入稳定期，菌体浓度可达OD₆₀₀＝2.4，发酵液pH 4.3左右，乳酸含量为12g/L左右；发酵3d的乙酸产量可达6g/L。

生物材料保藏

本发明所提供的发酵乳杆菌，分类学命名为发酵乳杆菌Lactobacillusfermentum，已于2016年06月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.12716，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

附图说明

图1：生长曲线；

图2：生长过程中pH变化趋势；

图3：生长过程中乳酸变化趋势。

具体实施方式

EC含量测定参照文献：顶空固相微萃取(HS-SPME)和气相色谱-质谱(GC-MS)联用定量蒸馏酒中氨基甲酸乙酯[J].食品工业科技,2012,33(14):60-63。

酒醅中尿素含量的测定参照文献：Jimenez-Martin E,Ruiz J,Perez-Palacios T,et aL.Gas chromatography-mass spectrometry method for the determination of free amino acids as their dimethyl-tert-butylsilyl(TBDMS)derivatives in animal source food[J].Journal ofAgricultural and Food Chemistry,2012,60(10):2456-2463。

实施例1：本发明的乳酸菌对精氨酸、尿素的降解情况

根据酒醅中精氨酸和尿素检测结果设计代谢实验中精氨酸添加量为300mg L^-1(高粱汁培养基中本身含有一定的精氨酸，额外添加300mg L^-1后总精氨酸含量约690mg/L，接近真实酒醅中精氨酸含量)，尿素添加量为200mg L^-1。发酵采用高粱汁对实验菌株L.diolivorans2-10、L.buchneri N5、L.casei X1、Lpontis JSB7、P.acidilactici JJB1、Lfermentum JSA30及L.plantarum JD19进行精氨酸、尿素的代谢实验。

实验及对照组设定：

空白1：高粱汁培养基按2％接种量接种，不添加精氨酸及尿素；

实验组1：添加300mg L^-1精氨酸的高粱汁培养基按2％接种量接种；

实验组2：添加200mg L^-1尿素的高粱汁培养基按2％接种量接种；

其中，实验菌株是按2％接种量接种到培养基中，30℃下静置培养72h。测定发酵起点、发酵终点的发酵液中精氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸、尿素的含量以及活菌数。

高粱汁培养基：将高粱:水＝1:4(M:V)，加淀粉酶蒸煮液化，60℃加糖化酶糖化，过滤离心，调节糖度至10°Bx。

酱香型白酒发酵过程中筛选得到了多株乳酸菌，其中的7株优势乳酸菌对精氨酸都有一定的代谢能力，但有强有弱，具体结果见表1。其中L.pontis JSB7、L.fermentum JSA30、L.plantarum JD19、L.buchneri N5、L.casei X1和P.acidilactici JJB1对精氨酸的降解能力较强，均超过0.5mmol·L^-1，而L.diolivorans 2-10对精氨酸的降解能力较弱，只有0.06mmol·L^-1。其中JSA30、JSB7和N5均为专性异型发酵乳酸菌(Obligatory heterofermentative)，都可以降解精氨酸，存在ADI途径中的关键酶基因arcA、arcB、arcC，具体见表2。表1中可以看到JD19和X1均能很好的利用精氨酸，且存在arcA基因。JJB1对精氨酸的降解能力虽然也较强，但是其不能降解尿素。

发明人考察了上述白酒中筛到的对精氨酸和/或尿素代谢能力相对较强的优势乳酸菌对精氨酸和尿素的降解能力。从表1中看出L.fermentum JSA30表现出了突出的尿素降解能力，其次是L.plantarum JD19，L.buchneri N5对尿素的降解能力明显弱于L.fermentum JSA30和L.plantarum JD19。

表1 7株乳酸菌对精氨酸和尿素的代谢能力

注：“–”表示几乎没有含量变化。

表2 7株乳酸菌arc基因存在情况

注：“+”表示在样品中有检出相应基因的存在，“–”表示没有检测到该基因的存在。

其中L.fermentum JSA30，已于2016年06月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.12716，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

L.plantarum JD19，已于2016年06月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.12717，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。实施例2：乳酸菌生理生化特征

将发酵乳杆菌L.fermentum JSA30接种于MRS培养基，于30℃厌氧发酵2d后，两株乳酸菌进入稳定期。如图1所示，发酵2d后，L.fermentum JSA30的生物量OD₆₀₀可达2.4。

MRS液体培养基：蛋白胨10.0g·L^-1，牛肉膏10.0g·L^-1，酵母膏5.0g·L^-1，柠檬酸氢二铵2.0g·L^-1，葡萄糖20.0g·L^-1，吐温801.0mL·L^-1乙酸钠5.0g·L^-1，磷酸氢二钾2.0g·L^-1，硫酸镁0.58g·L^-1，硫酸锰0.25g·L^-1，琼脂18.0g·L^-1。

乳酸菌生长代谢导致环境pH下降，可能对于酿造体系中其他不耐酸微生物的生长产生抑制，尤其是抑制杂菌生长，从而达到调控酿造环境的作用，维持正常发酵。图2为乳酸菌生长过程中pH变化趋势。

酸是白酒中的重要呈味物质，它与其他香味物质共同构成白酒所特有的芳香。含酸量小的酒，酒味寡淡，后味短。适量的酸在酒中能起到缓冲的作用，可消除饮后上头和口味不谐调等现象。酸还能促进酒质的甜味感。乙酸和乳酸是白酒中含量最大的，其含量对白酒口感影响很大。

两株乳酸菌主要代谢产物是乳酸，L.fermentum JSA30在生长过程中也产生大量的乳酸。乳酸是白酒主要酸之一，不但影响到白酒的口感，而且也是白酒风味物质-乳酸乙酯的前体物质，对白酒的品质影响重大。由图3可知，L.fermentum JSA30发酵2d、3d后乳酸含量分别达12g/L、14g/L。

L.fermentum JSA30是异型乳酸菌，发酵糖类除产乳酸外，还能够产生乙酸、CO₂等其他代谢产物。L.fermentum JSA30发酵3d后乙酸产量为6g/L。

实施例3：菌株的应用

固态发酵培养基的制备：称250g高粱，加入350mL蒸馏水，于70-80℃培养箱中浸泡24h。将水沥干，称取500g高粱于真空袋中，再加入25mL蒸馏水。121℃，灭菌20min。加酶糖化1d。

对照组：在固态发酵培养基中接种10wt％的高温大曲，30℃恒温培养箱中静置发酵6d。

实验组：将保藏编号为CGMCC NO.12716的发酵乳杆菌的种子液以终浓度10⁷CFU/g酒醅的接种量接种至固态发酵培养基中，并接种10wt％的大曲，放置30℃恒温培养箱中静置发酵6d。

结果显示，实验组得到的发酵物中，尿素的降低量为对照组的2倍以上，精氨酸的降低量远远大于对照组。而且，实验组得到的产品风味更佳优良。

可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。