一种中华鲟VTG蛋白抗原及抗体及制备方法和应用与流程

本发明属于生物技术领域，更具体涉及一种中华鲟VTG蛋白抗原及抗体，同时还涉及一种中华鲟VTG蛋白抗原及抗体的制备方法，还涉及一种中华鲟VTG蛋白抗原及抗体的用途。

背景技术：

中华鲟(Acipenser sinensis)属于洄游距离长、生长快、体形大及卵径最大的鲟种，具有重要的科研价值，被列为我国国家一级重点保护动物。由于过度捕捞、水工建设等因素影响，目前种群数量大幅减少，中华鲟物种目前的生存问题十分严峻。中华鲟的全人工繁殖技术的突破，可摆脱人工增殖放流苗种对野生中华鲟的依赖，实现可持续的中华鲟资源增殖。截至目前中华鲟全人工繁殖技术体系尚存在很多问题亟待解决，人工养殖中华鲟性腺发育成熟的问题，仍然是一个较大的科学难题。理论上人工养殖的中华鲟需要耗时十余年的时间才能性成熟，加之成鱼个体大，所需要的养殖成本巨大，人工养殖中华鲟性腺从II期发育到III-IV期(卵黄形成期)的规律和调控机理成为目前研究难点，也是探索促进中华鲟性腺成熟的人工调控和培育技术的关键所在。

卵黄是鱼类胚胎发育过程中的主要能量及物质来源，是后续的个体发育物质基础，卵黄积累过程是鱼类性腺发育中的重要生理过程。卵黄的主要成分是卵黄蛋白，鱼类的卵黄蛋白原(vitellogenin,VTG)是卵黄蛋白的前体，通常是由两个170-220kDa的同源二聚体组成，在雌激素的作用下由肝细胞合成,后经血液循环运输到卵巢，经过卵母细胞吸收加工后形成卵黄蛋白。因此血清中卵黄蛋白原含量与卵巢的发育程度相关，被认为是一种理想的雌激素和类雌激素标志物，可将其作为中华鲟卵巢发育程度的辅助检测指标，因此制备中华鲟VTG蛋白及抗体并应用于人工养殖中华鲟体外检测具有重要的现实意义。

VTG是动物体内一种具有种特异性的高分子量磷脂蛋白，虽然VTG的结构在许多动物中具有一定的保守性和同源性，但在免疫学上仍具有高度的特异性，甚至同科不同属的鱼类之间的VTG和其他抗体也很少发生免疫交叉反应。目前没有市售的鲟科鱼类的VTG抗体，同时其他科鱼类的VTG抗体对中华鲟VTG的免疫效果不佳，因此有必要发明一种针对中华鲟VTG蛋白的特异性抗体应用于体外检测。

技术实现要素：

本发明的目的是在于提供了一种中华鲟VTG蛋白抗原及抗体，该蛋白抗原为中华鲟VTG基因编码序列分析截短后翻译的重组蛋白pet32a(+)-VTG，其序列为SEQ ID NO.1所示。该中华鲟VTG蛋白抗体与VTG蛋白抗原免疫性好，效价能达到1：1000，使检测反应更为特异和稳定。

本发明的另一个目的是在于提供了一种中华鲟VTG蛋白抗原及其抗体的制备方法，方法易行，操作简便，通过转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株进行原核表达可制备大量的中华鲟VTG蛋白抗原。对日本大耳兔进行多次免疫最终获得中华鲟VTG蛋白特异性抗体。

本发明的最后一个目的是在于提供了一种中华鲟VTG蛋白抗原及抗体在雌性中华鲟血清VTG含量检测中的应用。该应用方法直接、操作快速、检测结果阳性率高，具有良好的临床适用性。

为了达到上述的目的，本发明采取以下技术措施：

一种中华鲟VTG蛋白抗原及抗体的制备方法，其步骤是：

1.重组中华鲟VTG蛋白抗原的制备：

首先以高首鲟和西伯利亚鲟VTG序列为基础设计引物扩增得到中华鲟VTG部分序列，然后根据得到的中华鲟VTG序列设计特异性引物，采用RACE PCR(购自Clontech公司)获得了中华鲟VTG基因的编码区序列。通过对编码序列进行功能结构域分析，选择卵黄蛋白原核心功能区域，根据该片段的基因序列设计引物进行PCR扩增，获得截短的VTG序列，连接到Pet32a(+)(购自Novagen公司)表达载体，构建重组表达质粒pet32a(+)-VTG，然后将其转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株并加入IPTG诱导，收集大量诱导表达的包涵体沉淀，溶解纯化得到可溶VTG重组蛋白。截短后的VTG功能结构域片段为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。该氨基酸序列通过BLASTP比对数据库及DNAStar Protean软件分析为脂蛋白氨基末端区，该蛋白家族包括卵黄蛋白原、微粒体甘油三酸酯转运蛋白和载脂蛋白b-100等都具有参与脂质运输的功能。

上述重组表达质粒pet32a(+)-VTG的构建方法具体为：

1)设计上游引物5'-GAATTCCAACAGACAAAGTATGAACCAA-3'(含EcoRⅠ酶切位点)，下游引物5'-CTCGAGGTCAAACACCAGTTCAGCAGCC-3'(含XhoⅠ酶切位点)，扩增结构域截短序列，扩增产物回收后连接到pMD-18T(购自TaKaRa公司)中并转化DH5a感受态细胞，然后涂于含有氨苄青霉素的LB培养基上进行培养，经菌落PCR鉴定为阳性的克隆进行接种培养提取质粒并进行测序；

2)将测序正确的pMD-18T-VTG质粒以及Pet32a(+)空载体分别采用EcoRI和XhoI进行酶切后纯化目的片段，然后将二者连接为Pet32a(+)-VTG转化DH5a(购自TransGen Biotech公司)，涂于含有氨苄青霉素的LB培养基上培养，提取质粒后酶切鉴定为阳性的质粒进行测序；

上述VTG重组蛋白的诱导表达及溶解纯化的具体方法为：

1)将测序正确的Pet32a(+)-VTG质粒转化BL21(DE3)感受态细胞，涂于含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，挑取菌落接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养至菌液OD值约为1.0时，加入终浓度为0.5mM的IPTG(购自捷诚生物公司)于30℃诱导2-4h，收集诱导表达菌体进行SDS-PAGE分析(图1)，结果显示Pet32a(+)-VTG重组蛋白主要以包涵体形式大量表达。

2)将收集的菌体沉淀经过3-6次超声洗涤后收集沉淀，然后用含8M尿素的蛋白缓冲液重悬沉淀，室温(20-25℃，以下相同)放置28-32min后15000×g离心28-32min收集上清，最后以孔径0.45mm的NC膜过滤收集上清得到可溶VTG重组蛋白。

2.兔抗中华鲟VTG蛋白多克隆抗体的制备：

选择日本大耳兔作为免疫动物，将纯化目的蛋白与弗氏完全佐剂充分乳化，进行皮下注射，共免疫5次后分离血清获得多克隆抗体。

3.中华鲟VTG多克隆抗体特异性检测：

将诱导的菌体及分离的上清和沉淀分别提取蛋白进行western blot检测，结果显示，多克隆抗体在诱导后的菌体及分离出的沉淀中均明显检测到VTG蛋白特异性条带(图2)，说明制备的中华鲟VTG多克隆抗体特异性好。

一种中华鲟VTG蛋白抗原及抗体在雌性中华鲟血清VTG含量检测中的应用，其步骤是：

1.中华鲟VTG蛋白抗原及抗体在ELISA检测最佳工作浓度及稀释比例的测定：

用棋盘滴定法测定，用经倍比稀释的VTG蛋白，横向包被酶标板，阴性对照不包被VTG蛋白，按间接ELISA方法将不同稀释浓度的抗血清纵向逐孔加入板孔，对最适工作浓度评判的标准为阳性孔的A450值约为1，阴性对照孔的A450值小于0.1，而抗原抗体浓度最低即为最适工作浓度。棋盘滴定的结果显示，当抗体浓度为1：1000时，8.13ug/mL与0.13ug/mL之间曲线的灵敏度和检测范围较好，因此在ELISA检测中采用1：1000的抗体浓度。

2.检测血清VTG蛋白含量间接ELISA方法的建立：

将重组VTG蛋白以8.13、4.06、2.03、1.02、0.5、0.25、0.13μg/mL包被酶标板100μl/孔，同时将待检血清稀释5倍后包被酶标板100μl/孔，于4℃过夜，洗涤5次拍干；加入100μl/孔封闭液，37℃封闭1h，洗涤5次拍干，加入最佳工作浓度的VTG抗血清100μl/孔，37℃温浴1h，洗涤5次拍干，加入1：5000稀释辣根过氧化物酶标羊抗兔IgG100μl/孔，37℃反应1h，洗涤5次后拍干，加入TMB底物溶液100μl/孔，37℃避光反应10-20min，最后加入100μl 2M硫酸终止反应，15min内用酶标仪在450nm波长下测定OD值。

3.中华鲟血清样品VTG蛋白含量的检测：

运用建立的ELISA法对II期、III期、IV期共18尾雌性中华鲟血清进行VTG含量的检测，样本OD₄₅₀值≥阴性样本OD450值的平均值(X)+3(SD)＝0.192时，可判为阳性。结果发现检测血清OD450值均显示阳性值，说明建立的间接ELISA特异性良好。且IV期雌鱼样品OD450值含量最高且与其他发育期存在显著性差异，说明建立的间接ELISA具有良好的临床适用性。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1.以pet32a(+)为表达载体进行原核表达，培养简单，可实现规模化生产。

2.选择中华鲟VTG基因结构域并截短构建表达质粒，制备简单并有利于重组目的蛋白的大量表达。

3.制备VTG的特异性抗体，与VTG蛋白抗原免疫性好，效价能达到1：1000，使检测反应更为特异和稳定。

4.制备的抗原与抗体可用于建立间接ELISA法，应用于中华鲟血清VTG含量的检测。该方法直接、操作快速，当天即可得到检测结果，且检测结果阳性率高达100％，具有良好的临床适用性。本发明可为将来制定完善的不同发育期中华鲟血清卵黄蛋白原含量标准范围提供技术支持。

附图说明

图1为一种重组质粒蛋白诱导表达检测及纯化结果示意图。

图中M为标准蛋白，1为诱导前的含Pet32a(+)-VTG的BL21(DE3)产物；2为添加IPTG诱导表达的含Pet32a(+)-VTG的BL21(DE3)产物的上清；3为添加IPTG诱导表达的含Pet32a(+)-VTG的BL21(DE3)产物的沉淀；4为包涵体沉淀经溶解纯化后的可溶性目的蛋白。

图2为一种VTG重组蛋白的Western-blotting检测示意图。

其中：1为诱导前的含Pet32a(+)-VTG的BL21(DE3)产物；2为添加IPTG诱导表达的含Pet32a(+)-VTG的BL21(DE3)产物；3为添加IPTG诱导表达的含Pet32a(+)-VTG的BL21(DE3)产物的上清；4为添加IPTG诱导表达的含Pet32a(+)-VTG的BL21(DE3)产物的沉淀。

具体实施方式

下面结合具体实施方式进一步详细说明本发明。

实施例1：

一种中华鲟VTG蛋白抗原及抗体的制备方法，其步骤是：

1)雌性中华鲟肝脏总RNA的提取和逆转录：

取出于RNAlater保存的雌性中华鲟肝脏组织，置于玻璃匀浆器中匀浆，然后按RNA提取试剂盒说明提取总RNA，以提取的总RNA为模板，按照逆转录试剂盒说明反转录为cDNA。反应体系为：42℃1hr，70℃加热10min，终止反应后-20℃保存。

2)中华鲟VTG基因目的片段的扩增和克隆：

通过BLASTP比对数据库对中华鲟VTG氨基酸序列进行功能检索，发现中华鲟VTG蛋白氨基酸序列44-612aa区域为卵黄脂蛋白核心功能区，并通过DNAStar Protean软件分析选择功能区中亲水脂性及抗原性较强的44-442aa区间序列，根据该序列设计上游引物为5'-GAATTCCAACAGACAAAGTATGAACCAA-3'(含EcoRⅠ酶切位点)，下游引物为5'-CTCGAGGTCAAACACCAGTTCAGCAGCC-3'(含XhoⅠ酶切位点)，PCR扩增截短的VTG目的片段，PCR反应体系为：94℃预变性5min，94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸2min反应45个循环。扩增产物回收后连接到pMD-18T中并转化DH5a感受态细胞，然后涂于含有氨苄青霉素的LB培养基上进行培养，经菌落PCR鉴定为阳性的克隆进行接种培养提取质粒并进行测序。

3)pet32a(+)-VTG重组质粒构建及酶切鉴定：

将测序正确的pMD-18T-VTG质粒以及Pet32a(+)空载体分别采用EcoRI和XhoI进行酶切后纯化目的片段，然后将二者连接为Pet32a(+)-VTG并转化DH5a，涂布于含有氨苄青霉素的LB培养基上，37℃培养过夜，挑取3-4个克隆接种培养后提取质粒，然后分别用EcoRI和XhoI对提取质粒进行双酶切鉴定，将电泳检测正确的质粒进行测序。最后获得一种截短后的VTG功能结构域片段的SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。该氨基酸序列相关蛋白家族包括卵黄蛋白原、微粒体甘油三酸酯转运蛋白和载脂蛋白b-100等都具有参与脂质运输的功能。

4)Pet32a(+)-VTG重组质粒的诱导表达：

将测序正确的Pet32a(+)-VTG质粒转化BL21(DE3)感受态细胞，涂于含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，挑取菌落接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜；取1ml培养物接种至200ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养至菌液OD值约为0.5时，取1ml培养物作为对照菌液，剩余菌液温度降至室温后加入终浓度为0.5mM的IPTG于30℃诱导2或3或4h，收集诱导表达菌体超声洗涤分离出上清和沉淀，并与对照菌液进行SDS-PAGE分析，结果显示Pet32a(+)-VTG重组蛋白以包涵体沉淀的形式大量表达。

5)Pet32a(+)-VTG重组蛋白的溶解纯化：

收集诱导表达的包涵体沉淀，经过多次超声洗涤后收集沉淀，然后用含8M尿素的蛋白缓冲液重悬沉淀，室温放置30min后15000×g离心30min收集上清，最后以孔径0.45mm的NC膜过滤收集上清得到可溶VTG重组蛋白，用紫外分光光度计测定纯化后的蛋白浓度。

6)兔抗中华鲟VTG蛋白多克隆抗体的制备：

将1ml纯化蛋白(约1mg/ml)与等体积弗氏完全佐剂充分震荡乳化，在日本大耳兔的背部皮下多点注射，每点注射剂量约0.2mL。第一次注射2周后加强免疫4次，以弗氏不完全佐剂乳化样品，每次剂量为第一次注射的一半，每次间隔2周。在第4次注射后10天自心脏抽取血液。将兔血放在37℃静置1h后，沿管壁搅动一圈，利于血细胞沉降。再于4℃静置过夜，室温3000g离心10min，吸取多抗血清，分装后保存于-80℃冰箱。

实施例2：

中华鲟VTG多克隆抗体特异性检测：

将诱导的菌体及分离的上清和沉淀分别提取蛋白进行western blot检测，结果显示，多克隆抗体在诱导后的菌体及分离出的沉淀中均明显检测到VTG蛋白特异性条带(图2)，说明制备的中华鲟VTG多克隆抗体特异性好。

实施例3：

一种中华鲟VTG蛋白抗原及抗体在ELISA检测最佳工作浓度及稀释比例中的应用，其过程是：

将重组VTG蛋白用pH为9.6的0.05M的碳酸盐稀释成为32.5、16.25、8.13、4.06、2.03、1.02、0.5、0.25、0.13、0.06μg/mL10个浓度以100μl/孔包被酶标板，阴性对照不包被VTG蛋白，每个浓度包被1列，放置于4℃包被过夜。用含0.1％(v/v)Tween-20的PBS-T洗涤5次后拍干，每孔加0.5％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)封闭液300μl，37℃封闭1h；然后将抗血清按1：250、1：500、1：1000、1：2000、1：4000、1:8000、1:16000和1:32000倍比稀释，分别以100μl/孔横向加入酶标板中，37℃反应1h后，洗涤5次，用1：5000稀释辣根过氧化物酶标羊抗兔IgG100μl/孔加入酶标板，37℃反应1h，洗涤5次后拍干，加入TMB底物溶液100μl/孔，37℃避光反应10或14或18或20min，最后加入100μl 2M硫酸终止反应，15min内用酶标仪在450nm波长下测定OD值；记录结果如下：

表1 VTG与VTG抗血清棋盘滴定结果

对最适工作浓度评判的标准为阳性孔的A450值约为1，阴性对照孔的A450值小于0.1，而抗原抗体浓度最低即为最适工作浓度。结果表明，当抗体浓度为1：1000时，8.13ug/mL与0.13ug/mL之间曲线的灵敏度和检测范围较好。

实施例4：

一种中华鲟VTG蛋白抗原及抗体在间接ELISA方法建立中的应用：其过程是：

将重组VTG蛋白以8.13、4.06、2.03、1.02、0.5、0.25、0.13μg/mL包被酶标板100μl/孔，同时将待检血清稀释5倍后包被酶标板100μl/孔，于4℃过夜，洗涤5次拍干；加入100μl/孔封闭液，37℃封闭1h，洗涤5次拍干，加入最佳工作浓度的VTG抗血清100μl/孔，37℃温浴1h，洗涤5次拍干，加入1：5000稀释辣根过氧化物酶标羊抗兔IgG100μl/孔，37℃反应1h，洗涤5次后拍干，加入TMB底物溶液100μl/孔，37℃避光反应10-20min，最后加入100μl 2M硫酸终止反应，15min内用酶标仪在450nm波长下测定OD值。

实施例5：

一种中华鲟VTG蛋白抗原及抗体在ELISA检测雌性中华鲟血清VTG含量中的应用：其过程是：

采用实施例4方法对II期、III期、IV期共18尾雌性中华鲟血清进行VTG含量的检测，样本OD₄₅₀值≥阴性样本OD450值的平均值(X)+3(SD)＝0.192时，可判为阳性。结果发现检测血清OD450值均显示阳性值，说明建立的间接ELISA特异性良好。且IV期雌鱼样品OD450值含量最高且与其他发育期存在显著性差异，说明建立的间接ELISA具有良好的临床适用性。如下表：

表2：中华鲟血清检测结果

以上所述仅是本发明的非限定实施方式，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思和不作出创造性劳动的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国水产科学研究院长江水产研究所

<120> 一种中华鲟vtg蛋白抗原及抗体及制备方法和应用

<130> 一种中华鲟vtg蛋白抗原及抗体及制备方法和应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 407

<212> PRT

<213> 中华鲟

<400> 1

Gln Gln Thr Lys Tyr Glu Pro Ser Phe Ser Gly Ser Lys Thr Tyr Gln

1 5 10 15

Tyr Lys Tyr Glu Gly Val Ile Leu Thr Gly Leu Pro Glu Lys Gly Leu

20 25 30

Ala Arg Ala Gly Leu Lys Val His Cys Lys Val Glu Ile Ser Glu Val

35 40 45

Ala Gln Lys Thr Tyr Leu Leu Lys Ile Leu Asn Pro Glu Ile Gln Glu

50 55 60

Tyr Asn Gly Ile Trp Pro Lys Ala Pro Phe Tyr Pro Ala Ser Lys Leu

65 70 75 80

Thr Gln Ala Leu Ala Ser Gln Leu Thr Gln Pro Ile Lys Phe Gln Tyr

85 90 95

Arg Asn Gly Gln Val Gly Asp Ile Phe Ala Ser Glu Asp Val Ser Asp

100 105 110

Thr Ile Leu Asn Ile Gln Arg Gly Ile Leu Asn Met Leu Gln Leu Thr

115 120 125

Ile Lys Thr Thr Gln Asn Val Tyr Gly Leu Gln Glu Asn Gly Ile Ala

130 135 140

Gly Ile Cys Gly Ala Ser Tyr Val Ile Gln Glu Asp Arg Lys Ala Asn

145 150 155 160

Lys Ile Ile Val Thr Lys Ser Lys Asp Leu Asn Asn Cys Asn Glu Lys

165 170 175

Ile Lys Met Asp Ile Gly Met Ala Tyr Ser His Thr Cys Ser Asn Cys

180 185 190

Arg Lys Ile Arg Lys Asn Thr Arg Gly Thr Ala Ala Tyr Thr Tyr Ile

195 200 205

Leu Lys Pro Thr Asp Ala Gly Thr Leu Ile Thr Gln Ala Thr Ser Gln

210 215 220

Glu Val His Gln Leu Thr Pro Phe Asn Glu Met Thr Gly Ala Ala Ile

225 230 235 240

Thr Glu Ala Arg Gln Lys Leu Val Leu Glu Asp Ala Lys Val Val His

245 250 255

Val Thr Val Pro Glu Gln Glu Leu Lys Asn Arg Gly Ser Ile Gln Tyr

260 265 270

Gln Phe Ala Ser Glu Ile Leu Gln Thr Pro Ile Gln Leu Phe Lys Thr

275 280 285

Arg Ser Pro Glu Thr Lys Ile Lys Glu Val Leu Gln His Leu Val Gln

290 295 300

Asn Asn Gln Gln Gln Val Gln Ser Asp Ala Pro Ser Lys Phe Leu Gln

305 310 315 320

Leu Thr Gln Leu Leu Arg Ala Cys Thr His Glu Asn Ile Glu Gly Ile

325 330 335

Trp Arg Gln Tyr Glu Lys Thr Gln Leu Tyr Arg Arg Trp Ile Leu Asp

340 345 350

Ala Leu Pro Ala Ala Ala Thr Pro Thr Ala Phe Arg Phe Ile Ser Gln

355 360 365

Arg Ile Met Lys Arg Asp Leu Thr Asp Ala Glu Ala Ile Gln Thr Leu

370 375 380

Val Thr Ala Met His Leu Val Gln Thr Asn His Gln Ile Val Gln Met

385 390 395 400

Ala Ala Glu Leu Val Phe Asp

405